HCV NS3丝氨酸蛋白酶与野生型P53相互作用的研究

目的：探讨HCV NS3丝氨酸蛋白酶与P53蛋白之间的关系。为研究NS3丝氨酸蛋白酶在HCV所致肝癌发生发展机制中的作用奠定基础。方法：构建HCV NS3丝氨酸蛋白酶基因及其N端缺失突变体的重组质粒,通过酵母双杂交系统定性及定量检测P53与NS3及共突变体的相互作用。结果：HCV NS3丝氨酸蛋白酶、N端缺失15个氨基酸及缺失30个氨基酸的NS3丝氨酸蛋白酶与P53均有相互作用,且相互作用的强度无显著差异,结论：HCV NS3丝氨酸蛋白酶与P53之间确定存在相互作用,但NS3参与相互作用的区段不在N2S3的N端,而在其C端。     

新型低抗原性葡激酶的构建、表达及功能分析

目的:降低野生型葡激酶(wild-type staphylokinase,wt-SAK)的抗原性,获得新型溶栓剂.方法:利用生物信息学分析野生型SAK抗原表位,将其分子内主要的抗原决定簇编码序列定点突变为丙氨酸密码子,将其N端抗原性较强的前10位氨基酸缺失.经过筛选从系列突变体中得到突变体NSAKV.结果:生物信息学分析突变后分子抗原性,结果表明其主要抗原表位消失.该突变体(NSAKV)与原核表达载体pET17b重组后,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导获得高效表达,NSAKV占全菌总蛋白的40%～50%,以可溶性形式存在.经进一步纯化,纯度达98%以上,分子量与理论值相符.比活性2.616×104 AU/mg.经ELISA法和溶圈法测定,NSAKV与wt-SAK制备的免抗wt-SAK抗血清的免疫反应性显著降低,经抗血清温育后wt-SAK活性下降程度远高于NSAKV.结论:突变体(NSAKV)保持了野生型SAK的活性,同时抗原性下降.     

CHIP基因及其突变体的克隆及在人卵巢癌细胞SKOV3中的表达

目的：热休克蛋白70羧基端作用蛋白（CHIP）是近年来新发现的同时具有辅助伴侣分子和E3泛素连接酶活性的特殊蛋白分子。但其对相应底物蛋白代谢和活性的调控机制尚不十分清楚。本研究拟构建含CHIP全长编码基因的真核表达栽体。并在此基础上构建含CHIP不同功能结构域突变体和缺失体基因的表达栽体，以实现这些基因在真核细胞中的高效表达，为后续探讨CHIP相关功能的实验奠定基础。方法：从高表达CHIP的人非小细胞肺癌H322细胞中提取总RNA，以此为模板，采用逆转录巢式PCR（RT-nested-PCR）获得CHIP全长编码基因，经测序确定序列正确后将CHIP基因连入带有myc标签的克隆载体pCMV-Tagl中，并以此为模板采用点突变的方法构建CHIP基因N端TPR结构域突变体K30A和C端U-box结构域的突变体H260Q以及U-box结构域缺失体U-box（-）。结果：钓取的CHIP基因经测序鉴定序列与GenBank报道完全一致，瞬时转染证实所构建的CHIP及其突变体表达载体可以在人卵巢癌SKOV3细胞中实现高效表达。结论：成功地构建并获得能够在真核细胞内高表达的CHIP及其功能域突变体的表达载体，为进一步探讨真核细胞内CHIP对相关蛋白分子的调控机制奠定了前期基础。     

以激活的脾细胞为反应细胞测定IL-2活性

本文介绍了以激活的小鼠脾细胞为反应细胞测定IL-2活性的方法,并研究了影响其活性测定的一些因素.此方法不需传代培养,比对IL-2依赖性CTLL(细胞毒性T淋巴细胞瘤)细胞株法简便,活性测定的灵敏度与特异性与采用对IL-2依赖的CTLL细胞株法所测定的结果相似,在无CTLL细胞株的情况下,也可以作为IL-2活性测定的方法.     

普氏立克次体120×103表面抗原的N端和C端重组蛋白免疫原性的研究

目的:评价普氏立克次体120×103表面抗原的N端和C端重组蛋白的免疫原性。方法:将纯化的N端和C端重组蛋白分别免疫小鼠,采用酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光试验分析免疫小鼠的体液免疫应答水平;用MTT法评价小鼠脾淋巴细胞的增殖情况,分析免疫小鼠的细胞免疫应答水平,并采用RT-PCR方法检测免疫小鼠脾淋巴细胞被重组蛋白刺激后细胞因子的表达。结果:N端和C端重组蛋白均诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG抗体,诱导高水平的小鼠脾淋巴细胞增殖;经两种重组蛋白刺激的小鼠脾淋巴细胞均表达了IFN-γ和IL-2。结论:普氏立克次体120×103表面抗原的N端和C端重组蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,可作为流行性斑疹伤寒亚单位疫苗的候选蛋白。     

BRCA1对FHL2转录激活功能的影响

目的：进一步了解乳癌易感基因BRCA1与FHL2相互作用对FHL2转录激活功能的影响，为揭示BRCA1在肿瘤发生发展中的作用提供依据。方法：将BRCA1 C端缺失突变体BRCA1(△1443—1863aa)和BRCA1(△908，1863aa)按正确读框插入到pCR3载体中，并在293T细胞中表达。利用GAL4荧光素酶报告基因检测野生型BRCA1以及肿瘤易感突变体BRCA1(P1749R)，BRCA1(Y1853imA)，BRCA1(△1443—1863aa)和BRCA1(△908，1863aa)对FHL2转录激活活性的调节作用。结果：野生型BRCA1能增强FHL2转录激活活性，且具有剂量依赖性。而4种肿瘤易感突变体增强FHL2转录激活活性的能力明显减弱。结论：BRCA1与FHL2相互作用可能对基因转录调节以及肿瘤发生、发展中起着重要作用。     

Smad4诱导大规模染色质伸展结构域定位

目的：了解Smad4能否调节大规模染色质结构改变并对其功能区域进行定位。方法：将Smad4及其缺失突变体与pRC-lac载体上lac的阻遏物融合并在AO3-1细胞中表达。该细胞株由CHO细胞衍变而来，整合有256个拷贝串联排列的lac操纵基因。在lac操纵子基因上游含有DHFR基因，可用甲氨蝶呤(MTX)进行基因共扩增。在细胞中lac阻遏物识别和结合lac操纵子基因。用抗lac阻遏物抗体进行免疫组化试验，荧光显微镜下观察染色质结构的改变。结果：野生型Smad4(1～552aa)有一定的诱导染色质伸展能力，且不依赖于TGF-β。N端区域(1～150aa)、中间连接区域(130～325aa)没有诱导大规模染色质伸展活性。C端区域(260～552aa)有一定的诱导染色质伸展能力，而C端缺失38个氨基酸残基的区域(260～514aa)能强烈地诱导大规模染色质伸展。结论：Smad4诱导大规模染色质伸展结构域位于260～514位氨基酸之间，C端38个氨基酸对Smad4诱导大规模染色质伸展有抑制作用。对Smad4诱导大规模染色质伸展活性特性的研究为揭示Smad4在肿瘤发生发展中的作用机制提供了新的途径。     

重组人proEMAP Ⅱ/p43蛋白N端和C端结构域的构建及活性鉴定

目的构建表达重组人proEMAPⅡ蛋白N端（p43N）及C端（p43C）结构域,并进行活性鉴定。方法分别在大肠杆菌中表达p43N及p43C蛋白,并纯化获得目的蛋白;利用血管内皮细胞管腔形成实验及细胞迁移实验进行活性鉴定,并比较等摩尔浓度下,p43蛋白、p43N、p43C及p43N＋p43C的活性差异。结果 p43N及p43C均具有抑制内皮细胞管腔形成和迁移的活性,在等摩尔浓度条件下,p43蛋白的生物活性高于p43N和p43C,p43N活性最弱,但p43N和p43C共同作用时,抑制活性高于单独作用。结论获得具有生物活性的p43N及p43C蛋白,为进一步确定p43N作用机制及其与p43C相互关系奠定了基础。     

微丝相关蛋白hHBRK1突变体的构建、表达及纯化

目的：构建微丝相关蛋白hHBRK1截短体和突变体原核表达载体，并表达及纯化融合蛋白。方法：采用常规PCR并结合定点突变技术，对hHBrkl基因进行缺失和点突变；利用限制性内切酶将PCR产物克隆至原核表达载体pGEX-4T；IPTG诱导融合蛋白表达，通过谷胱甘肽一琼脂糖纯化技术分离纯化GST融合蛋白。结果与结论：构建了包括氨基端缺失截短体hHBRK1-AN、羧基端缺失截短体hHBRK1-AC和点突变蛋白hHBRKl-S^56G^57在内的原核表达质粒，分离获得较高纯度的重组hHBRKl突变体融合蛋白，Western杂交证实纯化蛋白为GST融合蛋白。本实验为进一步研究hHBRK1的相互作用蛋白及其可能的结合位点提供了基础。     

人ω干扰素在巴斯德毕赤酵母中的表达及纯化

目的 :在巴斯德毕赤酵母中表达及纯化人ω干扰素 (interferonω ,IFN_ω)以对其功能进行深入研究。方法 :用PCR方法扩增人IFN_ω基因 ,与分泌型酵母表达载体pMEX9K重组 ,经酶切、PCR和序列测定证实重组表达载体pMEX9Kω构建正确。将重组载体pMEX9Kω用SalⅠ酶切后 ,转化毕赤酵母GS115。得到的转化子经诱导表达后在发酵上清中有人IFN_ω的表达 ,表达量为 4× 10 9U L。经过ButylSepharose 4FF疏水层析柱 ,SPSepharoseFF离子交换柱和Superdex 75凝胶过滤三步层析纯化 ,利用反相HPLC分析纯化的重组蛋白。结果 :得到了纯度 >99%的重组IFN_ω。N端氨基酸序列测定表明重组人IFN_ω具有正确的N端氨基酸残基顺序 ,相对分子质量为 2 2 0 0 0 ,并具有同天然蛋白相似的比活性。结论 :在毕赤酵母中成功地表达并纯化得到了同天然蛋白具有相似的比活性的人IFN_ω。     

鼠伤寒沙门菌stn基因突变株的构建与毒力检测

作者构建了鼠伤寒沙门菌肠毒素（stn）基因插入失活型与失型突变的重组自杀载体质粒,通过重组自杀质粒中的突变stn基因与鼠伤寒沙门菌株2000染色体上野生型stn基因发生同源交换,筛选获得stn基因突变的同源突变菌体。在小鼠体内检测菌株stn基因产物生物活性的结果表明,突变菌株诱发小鼠肠液分泌的能力较野生菌株明显减弱,而小鼠口服突变菌株的半致死剂量较野生株明显增高,提示stn基因是鼠伤寒沙门菌致病机制中一个较为重要的毒力因子。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体在CHO细胞中表达产物的纯化研究

目的 :为了从细胞株培养液中纯化长半衰期的t PA组合突变体FrGGI。方法 :采用高表达克隆细胞株 ,进行大量培养 ,收集 2 4h细胞培养液为初始材料 ,利用t PAK2区含有Lysine结合位点的特性和Zn2 与蛋白质中咪唑、巯基等基团螯合作用 ,经Lysine Sepharose 4B亲和层析和Zn2 Sepharose 4B金属螯合层析二步组合纯化。结果 :获得高比活的FrGGI,为研究该突变体生物学特性及推广应用奠定基础。结论 :利用赖氨酸和锌离子柱二步组合纯化方法 ,可有效地分离纯化t PA及其含K2区的突变体     

无活性放线菌野生株抗肿瘤活性突变株的自发突变抗性筛选和化学诱变抗性筛选

目的由无活性放线菌野生株转化获取活性突变株,为药源活性产物研究拓展新菌株资源。方法以海洋来源无活性放线菌野生株L35-1为出发菌株,通过自发突变抗性筛选以及化学诱变结合抗性筛选,筛选获得抗性突变株。采用MTT法检测突变株发酵样品对K562细胞的抑制活性。结果通过自发突变抗性筛选,得到新霉素抗性突变株114株、链霉素抗性突变株68株,其中7株新霉素抗性突变株和3株链霉素抗性突变株样品对K562细胞有抑制作用,在100μg/ml浓度下抑制率大于20%。通过化学诱变结合抗性筛选,得到硫酸二乙酯诱变链霉素抗性突变株41株、硫酸二乙酯诱变新霉素抗性突变株32株、亚硝基胍诱变新霉素抗性突变株46株,其中1株硫酸二乙酯诱变链霉素抗性突变株和1株亚硝基胍诱变新霉素抗性突变株有抗肿瘤活性,100μg/ml样品对K562细胞的抑制率大于20%。结论上述结果初步表明,无活性放线菌野生株可通过抗性筛选转化为活性突变株,因此有可能成为筛选获取药源活性新菌株的重要原始资源。     

E.coli BL21(DE3)磷酸转乙酰基酶缺陷变株的筛选及特性

目的：利用大肠杆菌磷酸转乙酰基酶（ＰＴＡ）缺陷变株减少工程菌乙酸的产生,以利于工程菌高密度培养及外源蛋白表达。方法：从Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）出发筛选ＰＴＡ变株,并对变株的特性进行研究。结果：筛选得到５株磷酸转乙酰基酶缺陷变株,变株的乙酸累积水平为亲株的１／５左右,最大比生长速率为亲株的２／３左右。各种有机酸（乙酸、乳酸、丙酮酸和琥珀酸）对ＢＬ２１（ＤＥ３）及其变株生长影响的考察结果显示,有机酸对Ｐ」ＴＡ变株的生长抑制曲线发生了一定变化,其中以乙酸影响的变化最为显著。低浓度乙酸对ＰＴＡ变株的生长不但不具抑制作用反而具有刺激作用、而高浓度乙酸对变株生长的抑制作用也明显减弱。     

海洋来源放线菌无活性野生株的链霉素抗性抗肿瘤活性突变株新产代谢产物研究

目的研究阐明无活性放线菌野生株L35-1来源硫酸二乙酯（DES）诱变链霉素抗性抗肿瘤活性突变株D2s4-1新产代谢产物及其抗肿瘤活性。方法组合利用活性跟踪与微量预试先导-放大实验制备的实验模式,通过与原始菌样品直接对照,在快速确定差异活性斑点基础上,组合利用各种色谱技术,分离纯化突变株新产代谢产物。根据理化性质和波谱数据鉴定化合物结构。采用MTT法测定抗肿瘤活性。结果从突变株D2s4-1发酵物中分离鉴定了6个该突变株新产代谢产物,即1,9-二甲酯吩嗪（1）、2-羟基苯乙酰胺（2）、2-吡咯甲酸（3）、大豆黄素（4）、环（4-羟基-脯氨酸-亮氨酸）二肽（5）和尿嘧啶（6）。其中1、3、5和6有一定抗肿瘤活性,浓度为100μg/ml时对K562细胞的抑制率分别为33.3%、16.3%、33.3%和21.1%。结论阐明了抗肿瘤活性突变株D2s4-1的6个新产物,其中4个为活性产物。化合物1为新天然产物,其抗肿瘤活性亦属首次筛选发现。用化学诱变组合抗性筛选技术从无活性放线菌野生株转化获取的活性突变株可供筛选新产活性产物,从而拓展放线菌药源活性新菌株资源。     

新型粘膜免疫佐剂候选株LTAˉB+的构建

目的 :产肠毒素大肠杆菌产生的不耐热肠毒素 (LT)不仅是很强的口服免疫原 ,而且其粘膜免疫佐剂作用显著。LT的毒性限制了它的直接使用 ,希望通过体外定点诱变技术 ,获得具有粘膜免疫佐剂作用的LT减毒株。方法 :以人源LT基因为研究对象 ,首先构建了重组质粒 pUC19 LT ,然后用单引物PCR法和重叠延伸PCR法分别构建了LTQ7和K63基因突变体。结果 :CHO细胞体外试验和家兔肠结扎体内试验毒性测定的结果表明 ,LT突变体K63的毒性明显降低。结论 :K63有希望成为候选的高效粘膜免疫佐剂。     

产紫青霉G59的超声诱变活性突变株新产抗肿瘤活性产物

目的阐明无活性真菌野生株产紫青霉G59的超声诱变活性突变株N3001d1-1新产抗肿瘤活性产物。方法采用活性跟踪与高效硅胶薄层检测分析相结合的实验方法,组合利用各种色谱技术,通过将突变株样品与原始菌直接比对分离纯化突变株新产活性产物。根据理化性质和波谱数据鉴定化合物结构。用MTT法测试抗肿瘤活性。结果从突变株N3001d1-1发酵物中分离鉴定了2个突变株新产抗肿瘤活性产物,即橘霉素（citrinin）（1）和fructigenine A（2）。化合物1和2对K562细胞均呈抗肿瘤活性,抑制K562细胞的IC50分别为50.6μg/ml和69.1μg/ml。结论化合物1和2均为原始真菌产紫青霉G59所不生产的突变株N3001d1-1新产抗肿瘤活性次级代谢产物。研究结果表明,超声诱变技术可用于改造真菌无活性野生株的次级代谢功能并从中筛选获取活性突变株,从而拓展真菌药源活性新菌株资源。     

登革4型病毒5''非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用

目的探讨登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用。方法首先通过mfold3·2软件对登革4型病毒5′端RNA二级结构进行预测,确定了3个突变位点:SLB1,缺失位于短茎环82-87位5′UAR环化序列,并破坏其保守茎环结构;SLB2,在次环引入突变破坏其环状结构(M77G/C);SLB3,突变仅涉及核苷酸,不破坏该次环二级结构(M77-78AG/GA)。然后在含有海肾荧光素酶(Renilla Luciferase,R·luc)报告基因的复制子(DEN-R·luc2A-RP)基础上,利用重叠PCR构建上述突变体。将突变体(包括相关的阳性和阴性对照复制子)分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞。通过间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、R·luc报告基因技术和实时定量RT-PCR对突变体的复制和翻译水平进行检测。结果SLB1突变体的翻译水平并未受到显著影响,但其复制水平出现显著下调。SLB2突变体的翻译水平亦未受到显著影响,但其复制水平受到完全抑制;SLB3突变体的复制和翻译水平均受到了完全抑制。结论登革4型病毒5′非编码区SLB元件对基因组RNA复制和翻译具有重要的调控作用。     

人胰岛素样生长因子1突变体的构建,表达及其鉴定

目的：根据胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ１）的三维结构及其与ＩＧＦ结合蛋白３（ＩＧＦＢＰ３）的结合位点,构建ＩＧＦ１突变体。方法：以合成的人ＩＧＦ１基因为模板,利用体外定点突变技术,获得［Ｔｙｒ＾１５,Ｌｅｕ＾１６］ＩＧＦ１突变基因,在大肠杆菌中进行表达,重组蛋白经纯化、复性后,还采用蛋白免疫印迹分析、荧光光谱分析和生物活性测定进行验证。结果与结论：成功地构建并表达了ＩＧＦ１突变体,［Ｔｙｒ＾１５,Ｌ