血管内皮生长因子反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞的抑制作用

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ASODN)对骨肉瘤细胞的抑制作用。方法设计合成VEGF ASODN,按不同浓度转染骨肉瘤OS-732细胞,设正义(SODN)和空白对照组进行比较。观察细胞生长状态,Western blot检测VEGF蛋白表达,MTT法测定细胞生长抑制率(IR),流式细胞仪检测细胞凋亡。结果与SODN、对照组比较,ASODN组细胞中VEGF表达显著降低(P<0.05),IR(分别为10μmol/L组34.21%,20μmol/L组39.50%)显著增高(P< 0.05),上述效应呈浓度依赖性;镜下观察ASODN转染细胞代谢衰退,当转染浓度至20μmol/L时,其凋亡率AI值(18.25±0.40)%显著高于对照组(5.20±0.28)%和SODN组[(6.41±0.10)%, P<0.01]。结论ASODN能够特异性封闭骨肉瘤细胞VEGF基因表达;并可抑制细胞增殖,诱导其凋亡。     

单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及其对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

目的 构建双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53，并研究其对骨肉瘤细胞增殖生长的抑制作用。方法 利用基因工程技术，将从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增出的p14cDNA（0．5kb）亚克隆至pIRES载体中，通过聚合酶链反应（PCR）、限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pIRES-p14ARF-p53。通过脂质体介导转染入骨肉瘤MG-63细胞中，并筛选出阳性克隆，流式细胞仪测定瘤细胞DNA含量和细胞周期；逆转录（RT）-PCR和Western bolt对稳定转染后的瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达进行定性和半定量检测。噻唑蓝（MTT）比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果 成功构建出双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53。转染后瘤细胞形态由转染前密集排列的多角形、星形转变为排列稀疏的长梭形细胞，瘤细胞生长速度较前缓慢，群体倍增时间比转染前增加了2．3倍，且易出现脱壁并见散在瘤细胞凋亡；流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞多停滞于G1期；RT-PCR与Western blot检测证实p14ARF、p53基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达，转染MG-63后24、48、72、96h瘤细胞生长抑制率分别为：33．43％、69．37％、66，19％、75．26％，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 野生型p53和p14ARF协同抑制骨肉瘤细胞的增殖促进瘤细胞的凋亡，为进一步研究p14ARF与p53在骨肉瘤基因治疗的体内实验奠定了基础。     

凋亡相关基因在骨肉瘤细胞中的表达及其临床意义

目的 探讨凋亡相关基因在骨肉瘤细胞中的表达及其临床意义.方法 采用3个公认的骨肉瘤细胞株及1个成骨细胞株,提取总RNA,合成生物素标记的cRNA与Affymetrix(R)GeneChip(R) U133A芯片杂交,筛选差异表达的凋亡相关基因.利用MATLAB软件进行细胞凋亡通路的KEGG分析.结果 以表达差异≥2.0倍为限,在Affymetrix(R)HG-U133A芯片包含的所有基因中,3个骨肉瘤细胞株与成骨细胞株比较,一共筛选出7个差异表达的凋亡相关基因:3个上调基因(IKBKB、IL1R1和FAS),4个下调基因(TP53、PPP3CB、PPP3CC和APAF1).利用MATLAB软件将7个差异表达的凋亡相关基因映射到KEGG的凋亡通路上.结论 骨肉瘤足细胞增殖和细胞凋亡间平衡失调的结果,通过调控细胞凋亡相关基因的表达可以诱导肿瘤细胞凋亡,达到抗肿瘤目的 .     

羟基磷灰石纳米粒子对人肝癌和结肠癌细胞生长的抑制作用

目的研究羟基磷灰石纳米粒子（nano-HAP）对人肝癌BEL-7402细胞和结肠癌SW-480细胞生长及凋亡的影响。方法用羟基磷灰石纳米粒子以不同终浓度作用于这二株细胞。用噻唑蓝（MTT）比色法观察其对两株细胞的生长抑制，荧光显微镜、透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术（FCM）等方法从细胞凋亡的角度探讨其作用机制。结果羟基磷灰石纳米粒子对BEL07402和SW-480细胞的半数有效抑制浓度（IC50）值分别为29．28mg／L和36．66mg／L。50～100mg／L的纳米粒子处理48h后，癌细胞即可表现出细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂以及凋亡小体形成等凋亡特征性形态改变。作用48h后，琼脂糖凝胶电泳观察到DNA“梯带”。流式细胞仪定量分析显示人肝癌、结肠癌细胞经0、50、100、200mg／L作用48h后的细胞凋亡率分别为2．23％、20．35％、29．34％、53．64％和3．57％、21．45％、37．10％、49．45％。结论羟基磷灰石纳米粒子对人肝癌BEL07402和结肠癌SW-480细胞有明显的生长抑制作用，诱导癌细胞凋亡可能是其主要作用机制．     

凋亡相关因子Smac、Livin与Caspase-3在骨肉瘤中表达及其意义

目的 观察人骨肉瘤组织中凋亡相关因子Smac、Livin和Cagpage-3表达,及其对骨肉瘤生物学行为影响.方法 采用免疫组织化学技术(SABC法)检测46例骨肉瘤组织中Smac、Livin及Cagpage-3蛋白表达,比较Smac、Livin表达与骨肉瘤主要临床病理参数的关系.结果 Smac、Livin及Cagpage-3基因在骨肉瘤中表达分别为29例(63.0%)、30例(65.2%)、32例(72.4%);Smac、Livin表达率与骨肉瘤组织学分级、WHO分型无关,与转移有关(P<0.05);骨肉瘤中Smac和Livin基因表达正相关(r=0.639,P<0.01),两者与Caspase-3表达无关.结论 凋亡相关因子Smac、Livin和Cagpage-3高表达于骨肉瘤中,可能通过影响细胞凋亡共同参与肿瘤发生发展.     

扭曲肉芝甲酯对人结肠癌LoVo细胞生长的抑制作用及其机制

目的 探讨扭曲肉芝甲酷抗结肠癌LoVo细胞增殖活性及其机制.方法 将LoVo细胞随机分为对照组和处理组(10、30、50μmol/L 3个亚组).对扭曲肉芝甲酯处理后LoVo细胞凋亡率、细胞周期、凋亡蛋白表达的改变进行定量分析.结果 经10、30、50 μmol/L扭曲肉芝甲酯处理24h后,LoVo细胞凋亡率分别为(2.32±0.93)％、(11.03±0.14)％和(16.29±1.98)％,对照组凋亡率为(2.09±0.97)％,而50 μmol/L扭曲肉芝甲酯处理0、6、12、24h后凋亡率分别为(2.67±0.97)％、(5.08±1.03)％、(5.04±0.83)％和(13.50±1.16)％(P＜0.05).荧光显微镜下细胞呈现典型的凋亡性改变;扭曲肉芝甲酯在0、10、50及100 μmol/L时将LoVo细胞抑制在G2/M期(9.53±3.97)％、(10.26±1.89)％、(11.36±2.56)％、(15.39±1.56)％ (P ＜0.05),该期的比例逐渐增高;Western blot法结果显示扭曲肉芝甲酯处理后结肠癌LoVo细胞的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶( Caspase)-8、Caspase-3表达升高.结论 扭曲肉芝甲酯以浓度依赖性和时间依赖性的方式抑制结肠癌LoVo细胞增殖,抑制细胞周期G2/M期,通过Caspase-8/Caspase-3来诱导细胞凋亡.     

RGDS-GG-KLAKLAKK多肽对人骨肉瘤细胞生长的影响

.结果 多肽RGDS-GG-KLAKLAKK明显抑制MG-63细胞的增殖,并有时间和剂量依赖性,在24、48 h的IC50分别为46.8、37.6 μmol/L(P＜0.05).多肽RGDS-GG-KLAKLAKK随着剂量的增加MG-63细胞的凋亡率从5.23%上升至38.90%(P＜0.01).MG-63细胞在多肽RGDS-GG-KLAKLAKK处理后,SurvivinmRNA的表达出现明显下降.结论 多肽RGDS-GG-KLAKLAKK能够抑制入骨肉瘤MG-63细胞的增殖,并诱导其凋亡.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体联合阿霉素治疗骨肉瘤

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）与阿霉素（ADM）联用对骨肉瘤细胞株HOS是否具有协同杀伤作用，并对其机制进行初步研究。方法 MTT法检测细胞的抑制率和存活率，流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测TRAIL受体（receptor，R）的表达水平。结果 单用0．5mg／LTRAIL及1．0、10．0、100．0mg／LADM对HOS8603的抑制率分别为13．18％、5．56％、23．02％和76．72％，联合用药的抑制率分别为42．98％、53．12％、81．91％。0．5mg／LTRAIL和1．0mg／LADM有协同作用．TRAIL和ADM联用时TRAIL R2 mRNA表达较TRAIL单用时明显增强。结论 TRAIL与ADM联用对骨肉瘤细胞有明显的协同作用，其机制可能与ADM上调TRAILR2的表达有关。     

紫杉醇诱导骨肉瘤细胞系凋亡的体外研究

目的研究抗微管新药紫杉醇对成骨肉瘤细胞系U-2OS的生长抑制及诱导凋亡作用,并探讨其诱导凋亡作用的机制。方法将不同浓度的紫杉醇作用于成骨肉瘤细胞系U-2OS,应用形态学观察、台盼蓝染色、流式细胞术、电镜、原位末端标记(TUNEL)等方法,检测其诱导骨肉瘤细胞凋亡的时间效应和剂量效应,并与其它化疗药物比较。结果紫杉醇对U-2OS细胞具有生长抑制及诱导凋亡作用,且呈时间依赖和剂量依赖性。表现为细胞G2/M期阻滞、出现明显的凋亡峰;有核碎裂、染色体凝集、DNA断裂等凋亡特征,并出现大量多核细胞。经其它化疗药物诱导的U-2OS细胞未出现多核现象。结论紫杉醇通过抑制细胞有丝分裂,对骨肉瘤细胞有明显的生长抑制及促凋亡作用,且其作用有独特的机制。     

Survivin反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞的抑制作用

我们以骨肉瘤OS 73 2细胞为对象 ,在明确其高表达Survivin基础上 ,尝试通过合成靶向Survivin的反义寡核苷酸(ASODN)转染OS 73 2细胞 ,以封闭Sur vivin表达 ,探讨ASODN对骨肉瘤细胞凋亡 /增殖的影响及其对化疗药物的促进作用。一、材料与方法1.材料 :人骨肉瘤细胞株OS 73 2购自北京积水潭医院骨科研究所。针对Survivin基因翻译起始密码区 ,设计合成ASODN (上海生工公司 ) ,序列为 5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG 3′ ,并设正义 (senseoligonucleotide ,SODN )对照 ,序列为 5′GTTCCTCGACCTTCCGACCC3′ ,两组寡核苷酸均…     

缺氧对骨肉瘤SaOS-2细胞生物学特性的影响

目的观察体外缺氧条件下骨肉瘤SaOS-2生物学特性的改变。方法建立骨肉瘤细胞体外缺氧培养模型；流式细胞仪分析细胞周期改变；划痕损伤法和Boyden侵袭小室检测细胞体外侵袭迁移能力的变化；半定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫组织化学（SP法）观察缺氧培养不同时相（8、16、24h）血管内皮生长因子（VEGF）的表达。结果缺氧培养16h内，细胞周期表现为G1期阻滞。24h后，细胞周期恢复常氧状态。缺氧培养24h后，骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭能力明显增强。缺氧处理后，VEGF mRNA以及蛋白的表达在缺氧条件下均显著增强。结论骨肉瘤细胞存在缺氧耐受机制，通过一系列生物学特性的改变来应对缺氧带来的不利。     

硫化砷对骨肉瘤细胞生长和凋亡的影响

目的 研究硫化砷对骨肉瘤细胞生长和凋亡的影响，并探讨其可能的机制。方法 应用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞生长抑制率、倒置显微镜观察细胞形态、AnnexinV法检测细胞凋亡、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测bcl-2及bax基因的表达，观察硫化砷对骨肉瘤细胞株MG-63诱导凋亡的作用。结果 硫化砷可明显抑制MG-63细胞的增殖，1．0mg／L浓度的硫化砷作用24h后，MG-63细胞的抑制率可达26．43％。倒置显微镜观察被硫化砷抑制的MG-63细胞呈典型的凋亡改变．流式细胞仪检测凋亡率与硫化砷处理时间、处理浓度呈正相关。在硫化砷的作用下，MG-63细胞的bcl-2表达下调，而bax表达无明显改变．结论 硫化砷可有效地诱导骨肉瘤细胞凋亡，bcl-2表达下调是诱导细胞凋亡的重要机制。     

华蟾酥毒基诱导骨肉瘤细胞凋亡的体外实验研究

 目的 研究华蟾酥毒基（cinobufagin）对多种骨肉瘤细胞系的增殖抑制和诱导凋亡作用,并探讨其相关机制。方法 不同浓度的华蟾素毒基分别处理骨肉瘤细胞系U2OS、MG63和SaO2后,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察不同骨肉瘤细胞系的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期的变化,细胞核荧光染色及Annexin V/ PI染色检测细胞凋亡,Western blot检测IAPs和Bcl-2家族凋亡相关蛋白凋亡相关蛋白Bax、cleaved-PARP、xIAP、cIAP-1、survivin及p65的表达。结果 MTT检测显示,华蟾酥毒基可明显抑制骨肉瘤细胞U2OS、MG63和SaO2的增殖,其抑制细胞增殖的作用呈剂量和时间依赖性,其对U2OS、MG63和 SaO2细胞的48 h IC50值分别为（104.83±16.96） nmol/L、（47.07±7.5） nmol/L和（136.72±10.08） nmol/L。100 nmol/L 华蟾酥毒基处理骨肉瘤细胞12 h后,流式细胞仪检测可见骨肉瘤U2OS、MG63和 SaO2的G₀/G₁期细胞比例下降,G2/M 期细胞比例增加,表明华蟾素毒基主要通过将细胞阻滞在G₂/M 期,以抑制骨肉瘤细胞的增殖。进一步Hoechst 33258细胞核染色发现,华蟾素毒基可诱导骨肉瘤细胞产生典型凋亡小体,Annexin V/ PI检测100 nmol/L 华蟾酥毒基作用48 h后,U2OS、MG63和 SaO2细胞凋亡率分别为33.6%±6.4%、36.4%±7.8% 及 29.3%±5.1%。表明华蟾酥毒基的抗骨肉瘤效果是通过诱导骨肉瘤细胞凋亡来实现。在探讨其诱导骨肉瘤细胞凋亡的相关机制中,通过Western blot检测发现其诱导凋亡的作用机制是通过上调IAPs和Bcl-2家族凋亡相关蛋白Bax、cleaved-PARP,下调xIAP、cIAP-1、survivin及p65蛋白来实现。结论 华蟾酥毒基可明显抑制骨肉瘤细胞株U2OS、MG63和 SaO2细胞增殖,阻滞细胞在G₂/M期,并诱导其凋亡,其诱导凋亡的作用机制为调节IAPs和Bcl-2凋亡相关家族蛋白的活性。     

雷帕霉素对人骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察雷帕霉素(RAPA)对人骨肉瘤细胞U-2OS和Saos-2增殖和凋亡的影响并探讨其机制.方法 体外培养骨肉瘤细胞株U-2OS和Saos-2;噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪检测不同浓度雷帕霉素对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响;Western blot检测雷帕霉素作用后骨肉瘤细胞Fas蛋白表达的变化.结果 MTT检测显示雷帕霉素可抑制入骨肉瘤细胞增殖,在雷帕霉素浓度达到20 nmol/L时,抑制作用显著提高(P＜0.05),增殖抑制率分别达到31.2％和28.7％.流式细胞检测显示在雷帕霉素浓度达到20 nmol/L时,其诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用显著增强(P＜0.05).Western blot检测显示经雷帕霉素作用48 h后的骨肉瘤细胞Fas蛋白的表达明显增强.结论 雷帕霉素对入骨肉瘤细胞株U-2OS和Saos-2的增殖有抑制作用并可诱导其发生凋亡,其可能是通过上调Fas蛋白的表达而发挥作用的.     

Gemcitabine inhibits viability, growth, and metastasis of osteosarcoma cell lines.

Gemcitabine (dFdCyd) is an analog of cytosine arabinoside with anti-tumor activity in several human cancers. However, the efficacy of this compound in osteosarcoma has not been fully elucidated. Here we assessed the anti-tumor activity of gemcitabine using osteosarcome cell lines. In 9 human osteosarcoma cell lines (G292, HOS, MG63, NY, SaOS, HuO, HuO-3N1, HuO9, HuO9-N2), gemcitabine at the doses of >100 nM showed significant cytotoxicity. In HOS and MG63 cell lines, gemcitabine inhibited DNA synthesis as determined by IdU labeling assay and induced apoptosis as determined by DNA fragmentation assay and May-Giemsa staining. In C3H mice inoculated s.c. with a murine osteosarcoma cell line, LM8, treatment of the mice with gemcitabine showed reduced size of the primary tumor associated with increased apoptotic cells and a virtual absence of metastatic lesions in the lung. Gemcitabine thus had anti-tumor activity on osteosarcoma cell lines both in vitro and in vivo. The result would provide a cellular basis for application of gemcitabine to patients with osteosarcoma.     

七氟醚对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、凋亡及化疗敏感性的影响

目的探讨七氟醚对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、凋亡及化疗敏感性的影响。方法选取骨肉瘤MG63细胞,随机分为四组:对照组、1.7%七氟醚组、3.4%七氟醚组和5.1%七氟醚组,分别为不给予七氟醚、给予1.7%、3.4%和5.1%七氟醚处理。采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell细胞侵袭实验检测细胞迁移;给予各组顺铂处理,检测各组细胞凋亡情况。结果培养24、36和72 h的1.7%七氟醚组、3.4%七氟醚组和5.1%七氟醚OD值明显低于对照组(P0.05),培养24、36和72 h的5.1%七氟醚组OD值明显低于1.7%七氟醚组、3.4%七氟醚组(P0.05)。四组细胞凋亡率、细胞迁移数差异无统计学意义。顺铂作用后,1.7%七氟醚组、3.4%七氟醚组和5.1%七氟醚组细胞凋亡率明显低于对照组(P0.05),5.1%七氟醚组细胞凋亡率明显低于1.7%七氟醚组和3.4%七氟醚组(P0.05)。结论七氟醚可抑制骨肉瘤MG63细胞增殖,对细胞迁移、凋亡无明显影响;七氟醚可降低骨肉瘤MG63细胞对顺铂的敏感性。     

Ezrin shRNA联合HSP70对骨肉瘤细胞凋亡和增殖的影响

 目的 探讨Ezrin基因沉默联合热休克蛋白（heat shock protein, HSP）70诱导的免疫杀伤对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法 采用人成骨肉瘤MG63细胞系作为研究对象,将人HSP70和Ezrin-shRNA的DNA片段分别克隆至含CMV和pU6双启动子的表达载体pGFP-V-RS中构建含HSP70和Ezrin-shRNA的真核表达载体pGFP-V-RS-shRNA和pGFP-V-RS-shRNA-HSP70。重组质粒分别转染入细胞,筛选出稳定表达的细胞克隆。荧光显微镜观察细胞形态及转染效果;荧光定量RT-PCR及蛋白印迹western blot检测稳定转染细胞株Ezrin和HSP70基因及蛋白水平的变化;采用MTT、流式细胞术检测细胞增殖、凋亡能力变化,Western blot检测凋亡及周期相关蛋白表达量变化;MTT法检测HSP70刺激产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对靶肿瘤细胞的杀伤作用。结果 荧光图像及基因和蛋白表达分析证实,首次成功构建同时沉默Ezrin和过表达HSP70的特异性载体。较单纯沉默Ezrin,同时过表达HSP70会在一定程度上减弱沉默Ezrin蛋白促进细胞凋亡和抑制增殖的效果,但与对照细胞相比,M63细胞凋亡率仍明显上升,自11.01%±0.22%上升至24.28%±0.50%,增殖速度则自395.14%±2.24%减少至310.00%±2.83%。另外,Western blot检测发现Ezrin-shRNA可促进凋亡基因Bax的表达,相反可降低抗凋亡基因Bcl-2和细胞周期蛋白Cyclin D1的表达。而Ezrin-shRNA/HSP70组较Ezrin-shRNA组促Bax表达和降低Bcl-2、细胞周期蛋白Cyclin D1表达有所减弱,但较阴性对照组仍有明显效果。MG63细胞的CTL细胞毒杀伤效应显示各效靶浓度下CT+IL-2+HSP70组的杀伤活性高于CT+IL-2组,最高达56.33%±1.95%。结论 同时沉默Ezrin、过表达HSP70既可以促进骨肉瘤细胞凋亡抑制其增殖,并利用HSP70诱导的CTL,增强对靶肿瘤细胞的杀伤作用。