骨髓间充质干细胞修复兔骨缺损的实验研究

大段骨缺损的修复一直是骨科的热点和难点,我们通过兔桡骨缺损模型,探讨自体骨髓间充质干细胞(MSCs)修复大段骨缺损的能力。一、材料与方法1.MSCs的分离、培养:选成年新西兰大白兔15只,每只兔抽取骨髓约4ml,离心、洗涤后,细胞成分以含10 ?S的DMEM培养,不贴壁的细胞经换液除去,贴壁细胞经增殖、传代,MSCs逐步纯化。2 .细胞—载体复合物的准备:另取兔松质骨,制成12mm×4mm×4mm的冻干松质骨块,作为载体。取第3代MSCs ,以无血清DMEM制成5×10 6cells/ml的细胞悬液,通过轻度负压使细胞随培养液渗入骨块内部,制成细胞—载体复合物备…     

骨髓间充质干细胞修复软骨缺损研究进展

间充质干细胞是一类多能干细胞,在胚胎形成过程中分化为骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪和骨髓基质等多种间充质组织.近年研究者成功地分离到人和多种动物骨髓间充质干细胞并发现其在体外仍保持干细胞特性,能够诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞和脂肪细胞等细胞系.动物实验表明,骨髓间充质干细胞能够修复具有临床意义的软骨缺损.此外,由于具有多能性,骨髓间充质干细胞还是很好的基因载体,在创伤修复的基因治疗中有广阔的应用前景.     

复合骨髓间充质干细胞生物陶瓷修复兔松质骨缺损

目的 评估复合骨髓间充质干细胞(MScs)的生物陶瓷在修复兔松质骨缺损中的作用。方法 分别对单纯燃烧骨、复合MSCs燃烧骨、三磷酸钙(β-TCP)及复合MSCsβ-TCP行：①体外研究：电镜观察复合后MSCs的生物学行为；②裸鼠异位成骨研究；②兔股骨锻松质骨缺损(φ6mm、深12mm)修复：18只兔32侧骨缺损分为5组(其中一组未加任何处理)，于2、4、8周末分别行组织学检查。结果 ①MSCs在燃烧骨及β-TCP上的黏附及生长情况良好，4d基本长满表面，6d起开始重叠生长；②在裸鼠体内，单纯β-TCP或燃烧骨无成骨，而复合MSCs组自2周开始成骨，并随时间延长而增加，但β-TcP组成骨与材料降解相平衡，而煅烧骨组仅在孔壁周围形成板层骨；③兔股骨锻缺损：未经处理不能自行愈合，2周内各组均无骨长入，4周开始由周边长入，8周时各组的骨长入率分别为40％、56％、45％、60％，无论在燃烧骨抑或β-TCP组中复合MSCs组的成骨量均高于对照组(P＜0．05)。结论 复合MSCs的生物陶瓷是修复负重区松质骨缺损的一种有效方法。     

骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白凝胶修复大面积关节软骨缺损

目的 :用自体骨髓间充质干细胞 (MSCs)复合纤维蛋白修复关节软骨缺损。方法 :抽取兔自体骨髓并分离和培养MSCs ,扩增足够数量后与同种异体纤维蛋白复合在一起 ,植入股骨关节面上 5mm× 10mm的骨软骨缺损区 ,对侧缺损区只植入单纯纤维蛋白或留作空白对照。结果 :术后 12周时 ,植入复合物的缺损区再生出典型的透明软骨样结构 ,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原基因表达检测均为阳性。对侧缺损区表面仅为纤维组织。结论 :自体骨髓间充质干细胞与纤维蛋白复合物可用于修复关节软骨缺损 ,但长远期疗效尚需做进一步研究。     

温敏性壳聚糖水凝胶支架联合骨髓间充质干细胞治疗兔膝关节软骨缺损

目的 制备壳聚糖/Ⅱ型胶原/聚乳酸复合水凝胶支架,以支架为骨髓间充质干细胞载体,评价修复兔膝关节软骨缺损的可行性.方法 将壳聚糖、Ⅱ型胶原、聚乳酸联合β-甘油磷酸钠盐制备复合水凝胶,检测凝胶形成时间、弹性模量及细胞相容性;制作新西兰兔关节软骨缺损模型,分为四组.空白组:正常软骨,未作任何处理;模型组:旷置骨软骨缺损作为...     

骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白凝胶修复兔关节软骨缺损

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)复合纤维蛋白凝胶(FG)对兔关节软骨缺损的修复效果。方法12只兔24个膝关节按左右分为实验组与对照组,抽取兔骨髓,密度梯度离心法分离间充质干细胞并行体外培养扩增,实验组以MSCs与FG及转化生长因子β1(TGFβ1)复合后填充到兔膝关节全厚软骨缺损模型中,而对照组以FG/TGFβ1填充,于术后12周取材,观察检测软骨缺损的修复情况。结果术后12周,实验组缺损由类透明软骨或透明软骨修复,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,甲苯胺蓝异染性明显,修复面较平整光滑;而对照组则以纤维软骨及纤维组织修复,Ⅱ型胶原免疫组化染色阴性。结论MSCs复合FG及TGFβ1能够修复兔关节软骨缺损。     

同种异体间充质干细胞复合纤维蛋白修复骨缺损

[目的]探讨骨髓间充质干细胞(m esenchym al stem cells,MSCs)的体外培养,以及同种异体MSCs复合纤维蛋白修复兔股骨髁松质骨缺损的效果。[方法]在日本大耳兔双侧股骨髁制作0.6 cm×1.0 cm松质骨缺损,左侧植入同种异体MSCs纤维蛋白复合物,右侧单纯植入纤维蛋白。分别于术后2、5、8周行放射学、组织学检查,以了解骨缺损修复情况。[结果]单纯植入纤维蛋白的一侧不能自行愈合。植入复合物的一侧术后2周可见少量骨组织生成,5周可见大量模糊骨痂,术后8周骨缺损基本愈合。除少量炎性细胞浸润外,各期均未见明显免疫排斥反应。[结论]同种异体MSCs复合纤维蛋白可有效修复兔股骨髁松质骨缺损,8周内机体的免疫排斥反应较弱。     

负载胰岛素样生长因子-1的骨髓间充质干细胞与壳聚糖-胶原复合物修复大鼠骨缺损的实验研究

背景：目前已有较多研究表明将种子细胞复合于支架材料进行骨缺损的修复能够取得良好的效果,但仍需探索有效的生长因子以促进修复过程。 目的：探讨负载胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor,IGF-1）的骨髓间充质干细胞与壳聚糖-胶原复合物对大鼠骨缺损的修复作用。 方法：分离大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞术鉴定细胞表面标志物;将骨髓间充质干细胞进行成骨诱导后检测碱性磷酸酶的活性以鉴定其成骨能力;IGF-1过表达载体转染骨髓间充质干细胞并筛选稳转细胞系,Real-time PCR以及Western blot鉴定稳转细胞系中IGF-1的表达。扩培细胞,并与壳聚糖-胶原进行复合培养。同时建立大鼠骨缺损模型,造模成功后将20只大鼠随机分为4组,每组5只。实验组植入负载IGF-1的骨髓间充质干细胞复合支架,支架修复组植入未经细胞复合的支架,干细胞复合支架修复组植入单纯骨髓间充质干细胞复合支架,空白对照组缺损处未植入任何物质。术后分别通过X射线和组织学切片观察比较各组大鼠的骨缺损修复情况。 结果：流式细胞术鉴定结果显示细胞CD44阳性率为98.19%,CD45阳性率为3.65%,CD90阳性率为97.62%。成骨诱导后碱性磷酸酶浓度升高至（11.57±0.48）U/L,显著高于未经成骨诱导的细胞（5.55±0.63）U/L（〈0.05）。Real-time PCR以及Western blot检测结果IGF-1稳定转染的细胞中IGF-1 mRNA以及蛋白的表达均显著升高（〈0.05）。X射线以及组织学观察结果表明空白组骨缺损不能自行修复,壳聚糖-胶原支架与骨髓间充质干细胞复合物植入大鼠后未见明显的免疫排斥反应,与其他组相比负载IGF-1的骨髓间充质干细胞与壳聚糖-胶原复合物组的成骨及修复效果均较为明显。 结论：骨髓间充质干细胞是较为理想的骨组织工程种子细胞,将IGF-1负载于骨髓间充质干细胞能够促进骨组织的修复。     

骨髓间充质干细胞修复关节软骨缺损研究进展

关节软骨损伤在临床上很常见．由于关节软骨的自身修复能力很差．关节软骨一一旦损伤即很难修复．继而会发生不可逆的病理变化，造成关节的退行性改变．严重影响患者的生活质量。目前．关节软骨损伤临床上尚无有效的治疗方法。近年发展起来的一门新兴学科一组织工程学．通过利用少量的种子细胞经过体外培养扩增，并附着在一定的吏架材料上，移植到体内而形成新的有生命力的组织。骨髓闸充质干细胞（Bone Marrow—derived Mesenchymal Stem Cells，BMSOs）用作种子细胞具有增殖能力强．多向分化潜能（可以分化为骨、软骨、肌肉、脂肪等多种组织），而且具有采集方便、对机体损伤小的特点．是软骨组织工程理想的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞结合Masquelet技术治疗感染性骨缺损的临床疗效观察

目的 观察应用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)结合Masquelet技术治疗感染性骨缺损的临床疗效.方法 回顾性分析2016年6月至2019年1月河南省洛阳正骨医院采用BMSCs结合Masquelet技术治疗的30例感染性骨缺损病人的临床资料.其中男2...     

骨髓间充质干细胞载体复合膜修复皮肤缺损的实验研究

目的探讨应用自体骨髓间充质干细胞的羊膜载体复合膜(羊膜-明胶-壳聚糖膜)植入皮肤全层缺损处对真皮的再生和重建速度的影响。方法抽取16只新西兰大耳白兔的骨髓间充质干细胞,经体外分离、培养并于其背部脊柱两侧制作两个全层皮肤缺损创面、随机分为两组。治疗组为骨髓间充质干细胞和载体复合膜,对照组单纯为载体复合膜。7、14、21天取材观察结果。采用大体观察、HE染色、Masson染色、I型胶原免疫组织化学染色、电镜观察、墨汁灌注法等化学染色动态观察创面愈合情况。结果治疗组在7、14、21天时新生真皮明显较对照组相应时间点的厚、活跃的I型胶原阳性细胞数多、电镜下粗面内质网扩张的成纤维细胞、血管和胶原纤维均较对照组的多。结论用含骨髓间充质干细胞的载体复合膜修复全层皮肤缺损,能加速真皮的修复和重建。     

复合磷酸三钙／转血管生成素-1的骨髓间充质干细胞对骨修复及血管形成的实验研究

目的 研究转染Ang-1基因的骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合磷酸三钙(TCP)对骨缺损的修复及血管形成作用。方法 脂质体介导质粒pEGFP-N1-hAng-1转染兔BMSCs,与TCP复合,修复兔桡骨1.5 cm缺损模型。分别在2、4、8、12周取材,以组织学、免疫组化、核素扫描等方法检测骨修复及血管再生状况。结果组织学检查见转染细胞组毛细血管生长及新骨形成活跃,术后8、12周骨小梁体积(TBV％)由对照组21.67±6.28和40.18±9.57升至实验组42.17±8.93和67.54±15.29(P<0.05)。微血管密度(MVD)则由对照组10.18±3.54、14.28±5.03升至实验组15.23±5.67、19.64±6.47(P<0.05)。实验组99m锝(Tc)放射性计数在术后4、8、12周达到68.39±21.43、85.52±26.68、98.64±29.28,与对照组37.54±12.36、55.23±18.85、75.67±26.39组间差异有显著性(P<0.05)。结论 Ang-1转染细胞组较对照组血供加强,骨修复加速。与细胞因子局部定向释放,加强血管形成及骨代谢有关。利用基因转染技术结合组织工程有助于深入加强骨缺损的修复研究。     

壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵复合人脐带间充质干细胞用于异位成骨的实验研究

目的通过构建壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵,与人脐带间充质干细胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells,hUCMSCs)复合构建组织工程骨并行成骨诱导培养,探讨其异位成骨效果,为骨组织工程寻找理想支架材料。方法在壳聚糖分子中引入亚磷酸根基团,制备亚磷酸化壳聚糖,并进行表征。分别将浓度为2%的壳聚糖和亚磷酸化壳聚糖溶液,按1∶1体积比混合均匀,构建壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵;然后在模拟体液中进行原位矿化,通过扫描电镜观察矿化前后复合海绵的结构。用酶消化法分离培养hUCMSCs,取生长良好的第3代细胞与壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵复合培养,构建细胞-支架复合物,并行成骨诱导培养。成骨诱导培养1、2周,分别于光镜及扫描电镜下观察细胞黏附情况;培养1、2、3、4、5、6 d时,MTT法分析细胞增殖情况。取3～4月龄新西兰大白兔40只,雌雄不限,体重2.1～3.2 kg,平均2.5 kg;制备双侧竖脊肌肌袋,在每只兔右侧肌袋内植入细胞-支架复合物(A组,n=40),于其中20只兔左侧肌袋植入壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵(B组,n=20),剩余20只兔左侧肌袋不植入材料(C组,n=20)。术后观察动物一般情况,4周后处死动物取材,行大体及组织学观察。结果亚磷酸化壳聚糖分析表明亚磷酸化反应主要发生在羟基上,其质子类型和化学位移强度与化学结构一致。扫描电镜观察到壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵孔洞均匀,孔壁较薄;原位矿化后孔壁表面有钙磷涂层,晶体颗粒生成;细胞在壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵支架上黏附、生长良好。体内实验大体观察A组可见细胞-支架复合物大小、形态基本保持原状,质地有所增韧,材料周围有薄层结缔样组织;B组复合海绵体积缩小,质地松软;C组肌袋手术创口已愈合。组织学观察A组支架材料部分吸收,边缘有均质类骨物质出现,并见成骨细胞;B组植入区形成圆形空腔,残留壳聚糖支架网络;C组创面基本愈合,肌肉纤维间可见少量淋巴细胞浸润。结论壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵是一种具有良好生物相容性的支架材料,与hUCMSCs复合构建的组织工程骨在兔体内可异位成骨。     

成软骨诱导的骨髓间充质干细胞膜片修复肋软骨供区缺损的实验研究

目的采用兔胸廓损伤动物模型,观察成软骨诱导的骨髓间充质干细胞膜片对肋软骨供区再生修复的影响。方法将16只家兔随机分为4组,每组4只,分别为健康对照组,实验1、2、3组。健康对照组家兔无任何处理,对实验组的每组双侧第4—6肋软骨均采用不同的2种方法处理,同侧3根肋软骨采用同一种方法处理,3种方法在每组中两两配对。3种方法分别为：①直接缝合软骨膜;②骨髓间充质干细胞膜片折叠数层成圆筒状填塞人肋软骨缺损处缝合;③成软骨诱导的骨髓间充质干细胞膜片同法折叠数层成圆筒状填塞入肋软骨缺损处,缝合封闭缺损。3种方法在各实验组兔两侧肋软骨中两两配对,健康对照组不做处理。术后16周,处死家兔取材进行大体观察,常规HE染色,并行生物力学检测,测定所有肋软骨的抗压强度及弯曲强度。结果各实验组家兔的胸廓整体形态均较良好,各组及各处理方法间无明显差别。生物力学检测显示,3种处理方法之间均存在差异（P〈0．01）,方法3处理的修复组织的抗压、弯曲强度与健康对照组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;方法1、2处理的修复组织的抗压、弯曲强度明显低于健康对照组（P〈0．01）;方法2处理的修复组织的抗压、弯曲强度优于方法1。组织切片HE染色病理观察,可见方法1、2处理的修复组织主要为纤维组织,方法3处理的修复组织内,可见新生的软骨细胞和大量的软骨细胞外基质。结论成软骨诱导的骨髓间充质干细胞膜片可以促进肋软骨供区软骨细胞的再生,修复肋软骨供区缺损,维持胸廓的正常形态和稳定性,从而降低术后胸廓畸形的发生率。     

骨髓间充质干细胞结合硼硅酸盐玻璃支架修复兔股骨头坏死

目的 通过应用硼硅酸盐生物玻璃13-93B3材料和组织工程技术,探索骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)结合硼硅酸盐生物玻璃在股骨头坏死修复中的效果.方法 制备硼硅酸盐生物玻璃和成骨诱导的BMSCs复合体.应用新西兰大白兔36只分别建立股骨头坏死动物模型,数字抽签随机分为3组:对照组未植入任何材料;单纯植入组,为在股骨头骨坏死区单纯植入硼硅酸盐玻璃;复合植入组,为在股骨头骨坏死区植入硼硅酸盐玻璃并BMSCs复合体.应用影像学Lane-Sandhu X线片评分和组织学新生骨小梁面积率分析各组术后4、8、12周的股骨头缺损修复情况.结果 对照组在造模后骨坏死缺损区域无明显成骨修复,以纤维组织增生为主,最终股骨头塌陷,第12周的Lane-Sandhu X线片评分为(0.35±0.16)分,新生骨小梁面积率为4.40%±0.34%.单纯植入组硼硅酸盐玻璃逐渐被新生骨替代而降解,骨小梁分布欠均匀、无股骨头塌陷,第12周的Lane-Sandhu X线片评分为(6.41±0.34)分,新生骨小梁面积率为38.10%±1.11%.复合植入组骨缺损区逐渐出现成骨修复反应,复合材料同步降解,骨小梁分布均衡、无股骨头塌陷,第12周的Lane-Sandhu X线片评分为(9.78±0.28)分,新生骨小梁面积率为68.20%±2.16%.通过对第4、8、12周的Lane-Sandhu X线片评分及新生骨小梁面积率统计学分析,复合植入组分别与对照组、单纯植入组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05).单纯植入组和复合植入组在治疗股骨头坏死成骨方面效果好于对照组,其中复合植入组的成骨效果较单纯植入组更好.结论 采用BMSCs复合硼硅酸盐玻璃修复骨缺损将为股骨头坏死治疗提供新的材料及方法,对早期股骨头坏死的治疗有较好的应用前景.但是这一技术若要真正应用于临床实践,仍尚需大量的基础实验进行探索.     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。     

慢病毒介导BMP-2过表达质粒转染骨髓间充质干细胞联合丝素蛋白支架向成骨细胞转化的实验研究

目的：探究慢病毒介导BMP-2过表达质粒转染骨髓间充质干细胞联合丝素蛋白支架向成骨细胞转化的作用效果。方法：构建慢病毒BMP-2过表达载体,培养骨髓间充质干细胞,构建细胞核支架的联合培养体系,体外实验利用茜素红染色和碱性磷酸酶染色检测骨髓间充质干细胞的成骨转化。选择10只新西兰大白兔,体重3.2～4.5 kg,平均3.9 kg;年龄（2.89±0.45）岁;使用口腔钻在兔子胫骨钻孔（长度5 mm、宽度2 mm、深度3 mm的锥形胫骨缺损）构建兔子胫骨骨缺损模型,HE染色观察动物模型内骨缺损的修复。实验组造模后植入丝素蛋白支架+转染BMP-2过表达载体骨髓间充质干细胞复合物,阴性对照组造模后植入丝素蛋白支架+未转染骨髓间充质干细胞复合物。结果：实验组（丝素蛋白支架+转染BMP-2过表达载体骨髓间充质干细胞复合物）中支架表面黏附的细胞与对照组（丝素蛋白支架+未转染骨髓间充质干细胞）相比,细胞数明显增多。实验组细胞外基质分泌与对照组相比,支架间细胞外基质含量明显增多。对照组支架表面元素EDX分析显示钙离子含量为0.22%,实验组支架表面元素EDX分析显示钙离子含量为0.86%,可见实验组诱导钙离子形成的能力要比对照组强。钙结节茜素红染色结果显示,对照组肉眼观无明显变化,镜下观察可见少量钙结节点。实验组肉眼观可见明显红色区域染色,镜下观察可见大量钙结节点。碱性磷酸酶染色结果显示,对照组肉眼观无明显变化,镜下观察未见明显变化。实验组肉眼观可见紫色区域染色,镜下观察可见ALP染色呈强阳性。丝素蛋白支架与骨髓间充质干细胞联合培养体系可以对软骨缺损有较好的修复作用,转染BMP-2骨髓间充质干细胞后修复作用明显优于未转染组。HE染色结果显示,对照组炎性细胞减少,支架略有消失。实验组炎性细胞明显减少,支架消失,血管生成。结论：慢病毒介导BMP-2过表达质粒可以促进BMSC向骨细胞的分化作用,并且分泌更多的含Ca²⁺成分的细胞外基质,从而发挥其促进骨缺损修复的作用。     

骨髓间充质干细胞与骨组织共培养模型的建立

目的:建立骨髓间充质干细胞(BMSCs)与骨组织共培养模型,模拟体内成骨环境,以全面研究骨髓间充质干细胞及细胞支架复合物的生物性状.方法:通过插入式培养皿和培养板来构建细胞一组织共培养的模型,将新鲜兔骨碎粒及骨块与骨髓间充质干细胞共培养,观察共培养条件下细胞的形态学变化、ALP活性及矿化能力,免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素.结果:构建出骨髓间充质干细胞与骨组织共培养的模型.共培养的间充质干细胞同期ALP活性高于普通培养对照组,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性,对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性.结论:体外构建的共培养模型部分模拟了体内成骨环境;经过共培养的细胞呈现成骨细胞的表型.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、扩增及诱导分化

目的探讨兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)体外培养、定向诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞的途径,为进一步的实验研究打下基础。方法抽取兔股骨骨髓,以全骨髓贴壁培养法进行体外培养,贴壁细胞传代,倒置显微镜下观察细胞形态。取第3代细胞向成骨细胞和成脂肪细胞诱导,14d后成骨细胞诱导组检测碱性磷酸酶,成脂肪细胞诱导组进行油红O染色。结果全骨髓贴壁培养法可获得BM-MSCs,原代和传代培养的BM-MSCs具有活跃的增殖能力。成骨细胞诱导组碱性磷酸酶检测表达阳性,成脂肪细胞诱导组油红O染色见胞浆内出现大量红染脂滴。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BM-MSCs,分离培养的BM-MSCs生长稳定,增殖力强,可向成骨细胞和成脂肪细胞诱导分化。     

慢病毒介导的Sox9基因在兔骨髓间充质干细胞的过表达促进软骨损伤修复

目的:明确在体内Sox9基因过表达的兔骨髓间充质干细胞对于关节软骨损伤修复的作用。方法:以慢病毒介导的Sox9基因转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),体外检测软骨特异性分子,将新西兰大白兔24只48个膝关节随机分为3组,动物麻醉后,双侧股骨滑车处的关节面上用直径4 mm的钻头钻孔,深度3 mm,穿透软骨下骨,造成全层关节软骨损伤,将转染后的细胞植入体内用以修复全层关节软骨损伤,实验组植入BMSCs-(Lenti-Sox9-EGFP)-藻酸钙复合物,实验对照组植入BMSCs-藻酸钙复合物,空白对照组只钻孔。术后6、12周分别进行光镜、电镜观察,以及HE、免疫组织化学染色检测软骨的修复程度。结果:经Sox9基因转染后的细胞在3 d时,Sox9基因表达最高,随后下降。转染后3 d,Ⅱ型胶原开始表达,到14 d时达到最高。表明Sox9过表达启动了兔骨髓间充质干细胞的软骨分化。组织学观察显示,实验组术后6周缺损处有透明软骨样组织填充,术后12周缺损处软骨和软骨下骨修复良好。两对照组,缺损处由纤维组织填充。免疫组织化学显示,修复组织内Ⅱ型胶原,免疫组化染色结果阳性强于两对照组。组织学评分结果显示实验组软骨损伤修复各时间点效果明显优于两对照组,差异有统计学意义。结论:Sox9基因过表达的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)促进软骨损伤的修复。