Par-3蛋白在转化生长因子?茁1介导的大鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察转化生长因子（TGF)β1诱导的正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化（EMT）过程中细胞极性蛋白Par-3的表达及上调Par-3蛋白表达对TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程的影响。 方法 应用TGF-β1 (10 μg/L)刺激NRK52E细胞，采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Par-3 mRNA和蛋白的表达；应用Lipofectmine 2000将pKH3-HA-Par-3质粒瞬时转染NEK52E细胞，采用Western印迹观察上调表达Par-3对上述指标的影响。 结果 TGF-β1刺激后，NRK52E细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调，E-cadherin蛋白和mRNA的表达下调；Par-3蛋白表达呈时间依赖模式下调，72 h TGF-β1刺激组与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。但Par-3 mRNA水平在各时间点差异均无统计学意义（P > 0.05）。脂质体转染外源性质粒pKH3-HA-Par-3上调表达Par-3可显著抑制TGF-β1诱导NRK52E细胞α-SMA蛋白的上调表达；逆转E-cadherin蛋白的下调表达。 结论 在TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程中细胞极性Par-3蛋白表达下调，基因转染上调表达Par-3可部分减轻EMT的程度，提示Par-3蛋白在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中可发挥保护性作用。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞胶原分泌的影响

目的比较结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸两种导入方法的优缺点,观察CTGF反义寡核苷酸对TGF-β1刺激的肾小管上皮细胞胶原分泌的影响。方法分别用脂质体包裹和未包裹的CTGF反义寡核苷酸(分高剂量和低剂量)处理NRK52E肾小管上皮细胞,观察异硫氰酸荧光素(FITC)荧光标记的反义寡核苷酸的导入情况和细胞的生长状态。采用RT-PCR和Western印迹方法检测CTGF和Ⅰ型胶原的表达。结果脂质体包裹有助于反义寡核苷酸的导入,于6h～9h细胞即出现生长抑制,形态改变。直接导入法反义寡核苷酸进入较慢,在96h内仍未出现明显细胞毒性。直接导入法中,反义寡核苷酸处理48h后,高、低剂量组CTGFmRNA和蛋白大部分受抑,72h时低剂量组CTGF的表达有少量的恢复。TGF-β1刺激能够显著增加Ⅰ型胶原分泌,加入CTGF反义寡核苷酸共同孵育48h,可以大部分取消TGF-β1的作用,而正义和错义的寡核苷酸没有作用。结论反义寡核苷酸直接导入细胞较慢,但仍然能够达到较好的抑制效果,且细胞毒性小,可以用于体外反义技术的研究。CTGF反义寡核苷酸能够抑制TGF-β1引起的肾小管上皮细胞胶原Ⅰ型分泌增多,表明阻断CTGF可能是延缓肾间质纤维化的有效手段。     

转化生长因子β1诱导肾小管上皮细胞转分化的蛋白质组学研究

目的 研究转化生长因子（TGF）β1诱导肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化（EMT）过程中相关靶蛋白的表达变化。 方法 应用比较蛋白质组学方法。用双向凝胶电泳（2-DE）对TGF-β1刺激组和对照组 NRK52E细胞总蛋白进行分离。两组间差异蛋白点用质谱和数据库搜索鉴定，并用RT-PCR和Western 印迹在蛋白质和mRNA水平上进一步检测验证。 结果 鉴定出22个差异蛋白，包括与细胞骨架相关蛋白、参与物质转化和能量代谢的酶类、与蛋白翻译后修饰相关蛋白、细胞因子及其他蛋白等。应用RT-PCR验证了转胶蛋白（transgelin）、ATP合成酶α亚型、苹果酸脱氢酶、丝氨酸（半胱氨酸）蛋白酶抑制因子、泛素结合酶9（Ubc9）和表皮生长因子8在mRNA水平的表达差异，与2-DE结果一致。用Western 印迹验证了transgelin、ATP 合成酶α亚型两种蛋白的表达差异，亦与2-DE结果一致。 结论 TGF-β1刺激NRK52E细胞EMT发生过程中可诱导包括与细胞骨架相关蛋白、与翻译后修饰相关蛋白、代谢酶类及细胞因子等多种蛋白表达变化。本研究结果有助于深入理解EMT的具体分子机制及阐明肾脏疾病慢性进展的机制。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞纤溶酶原激活物抑制物1表达的影响

目的探讨结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ODN)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)mRNA表达和蛋白产生的影响,以明确CTGF在肾脏细胞外基质(ECM)降解中的作用。方法体外培养人近曲小管上皮细胞(HKC),以脂质体介导方法将CTGF反义ODN转染细胞。以TGF-β1(5μg/L)刺激HKC不同时间后,用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测PAI-1mRNA表达;流式细胞仪法检测胞内PAI-1蛋白合成;Western印迹方法检测HKC分泌到上清中的PAI-1蛋白含量。结果TGF-β1可诱导HKC高表达CTGF和PAI-1。转染后6h,CTGF反义ODN可显著抑制TGF-β1诱导的HKCPAI-1mRNA表达。转染后24h,CTGF反义ODN可明显抑制胞内PAI-1蛋白合成,并减少了HKC分泌到胞外的PAI-1。结论CTGF在肾小管间质纤维化时ECM降解中起了关键调控作用,其反义ODN的导入可能是延缓肾小管间质纤维化的有效手段之一。     

终末期糖基化终产物通过转化生长因子依赖和非依赖途径介导NRK52E细胞转分化和胶原Ⅰ的合成

目的探讨终末期糖基化终产物（AGEs）介导肾小管上皮细胞转分化和胶原（Col）Ⅰ合成的分子机制。方法体外培养正常大鼠近端肾小管上皮细胞系（NRK52E），应用自制的AGE-牛血清白蛋白（BSA）刺激NRK52E细胞。免疫细胞化学方法检测不同时间磷酸化（P）Smad2／3核转位情况。ELISA方法检测细胞培养上清TGF-β1的水平。RT-PCR方法检测α-平滑肌肌动蛋白（SMA）、E-钙黏着糖蛋白（cadherin）和ColⅠmRNA表达。Western印迹检测α-SMA、E-cadherin和ColⅠ蛋白的表达。同时观察TGF-β1中和抗体对AGE-BSA上述效应的阻断作用。结果基础状态下，NRK52E细胞存在低水平p-Smad2／3核表达（16％）。与BSA对照组比较，AGE—BSA以时间依赖方式上调NRK52E细胞p-Smad2／3核转位，其高峰出现在30min（68％比30.5％，P〈0．01）和24h（76％比31．3％，P〈0．01）。AGE—BSA显著上调α-SMA和ColⅠmRNA和蛋白表达；下调E-cadherin mRNA和蛋白的表达；并能促进NRK52E细胞合成和分泌TGF-β1。TGF-β1中和抗体能明显抑制AGE—BSA介导的24hp-Smad2／3核转位（25．2％，P〈0．01），但不能阻抑30min活化高峰；能明显抑制AGE-BSA介导的α-SMA和ColⅠmRNA和蛋白表达．以及显著地上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达。结论AGEs通过TGF-β依赖和非依赖途径诱导肾小管上皮细胞Smads信号通路活化，促进其向肌成纤维母细胞转分化和ColⅠ的合成。     

虫草素通过下调TGF-β抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化

目的：探讨虫草素对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响。方法：体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞株）,分为正常对照组（葡萄糖5.5 mmol/L,NG组）、高糖组（葡萄糖30 mmol/L,HG组）、高糖＋虫草素组（葡萄糖30 mmol/L＋虫草素10μg/ml,HG＋C组）。分别于刺激12 h,24 h,48 h后收集细胞。应用定量RT-PCR测定NRK52E TGF-β,E-cadherin,α-SMA mRNA的表达;Western印迹方法检测TGF-β、E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果：高糖刺激后NRK52E细胞的TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达明显高于正常糖组（P〈0.01）,而虫草素组TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达显著低于高糖组（P〈0.05）;高糖诱导的NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平明显降低（P〈0.01）;而虫草素组NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平显著高于高糖组（P〈0.05）。结论：虫草素可以明显抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化,其机制可能是通过下调TGF-β实现。     

转化生长因子β1和结缔组织生长因子在狼疮肾炎肾小管间质中的表达

目的 研究狼疮性肾炎肾小管间质转化生长因子β1（TGF－β1）和结缔组织生长因子（CTGF）的表达特点及其意义。方法 应用免疫组织化学方法比较原发性肾小球肾炎微小病变型（MCD）和狼疮肾炎（LN）肾小管间质中TGF－β1和CTGF的表达及分布以及浸润细胞，α－平滑肌肌动蛋白（SMA）的表达特点。结果 TGF－β1及CTGF可不同程度地表达于LN的肾小球和肾小管间质，且较MCD的表达普遍增高，肾间质TGF－β1表达量与CTGF的表达量之间的相关系数r=0.5316,P=0.023。LN患者肾间质内CD3阳性细胞，CD68阳性细胞，PCNA阳性细胞以及α－SMA的表达明显高于MCD患者。α－SMA的表达程度与肾小管间质纤维化程度存在正相关关系，r=0.436,P=0.032。结论 LN肾间质内TGF－β1和CTGF表达增高，可能与LN肾间质病变及炎性细胞的浸润有关。     

罗格列酮对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的探讨体外条件下转化生长因子(TGF)β1对人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)表达结缔组织生长因子(CTGF)的诱导情况,以及罗格列酮对其影响和作用途径。方法应用RT-PCR方法检测CTGF和α-平滑肌肌动蛋白(SMA)mRNA表达。应用Western印迹方法检测CTGF和纤连蛋白(FN)的蛋白表达。结果(1)HK-2细胞低水平表达CTGFmRNA和蛋白,TGF-β1呈剂量和时间依赖性增加HK-2细胞CTGFmRNA和蛋白表达(P<0.01)。(2)罗格列酮和15脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)呈剂量依赖性抑制TGF—β1(4ng/ml)诱导的HK-2细胞CTGFmRNA和蛋白的表达。(3)过氧化物酶体增殖体激活受体(PPAR)γ特异性抑制剂GW9662(1μmol/L)完全阻断罗格列酮和15d—PGJ2对CTGFmRNA和蛋白表达的抑制作用。(4)与单纯TGF-β14ng/ml刺激组相比,罗格列酮5、10μmol/L处理组HK-2细胞FN蛋白分别下调39.9%和53.4%(P<0.01),并呈剂量依赖性(P<0.01),而GW9662完全阻断该作用。结论在体外,罗格列酮可通过激活肾小管上皮细胞PPARγ抑制TGF-β1诱导的CTGF转录和表达,同时也可抑制FN的表达。     

囊泡型H+-ATP酶B亚基在转化生长因子β1致肾小管上皮细胞转分化中的变化及其意义

目的 探讨在转化生长因子（TGF）β1致大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）发生上皮细胞向间质细胞转分化（EMT）过程中囊泡型H+-ATP酶（V-ATPase）B亚基的变化及其可能意义。 方法 NRK52E细胞无血清培养后予TGF-β1（10 μg/L）刺激不同时间（0、6、12、24、48、72 h）,应用实时定量PCR、Western印迹、免疫荧光技术检测?琢平滑肌肌动蛋白（?琢-SMA）、E钙黏素（E-cadherin）、V-ATPase B亚基（B1、B2）mRNA、蛋白表达及分布的变化。 结果 TGF-β1刺激NRK52E细胞48 h后?琢-SMA mRNA及蛋白表达显著上调,E-cadherin mRNA及蛋白表达显著下调,同时V-ATPase B2亚基mRNA及蛋白表达也显著增加（均P < 0.05）。但是B1亚基在细胞内表达很低,刺激后也未见显著变化。免疫荧光也显示V-ATPase B2亚基在细胞内的分布明显增加并向胞膜聚集。 结论 在NRK52E内主要分布的是V-ATPase B2亚基。TGF-β1刺激NRK52E EMT过程中V-ATPase B2亚基表达显著增加,这提示B2亚基可能参与肾小管EMT过程。     

核因子κB反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导下，核因子κB（NF-κB）反义寡核苷酸对体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响。 方法 采用脂质体介导的方法将NF-κB反义寡核苷酸（AS-ODN）导入细胞，以TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞24 h后，用RT-PCR方法检测细胞中NF-κB mRNA及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达，用荧光光谱法分析α-SMA蛋白的表达，并以倒置相差显微镜观察细胞转分化过程的形态变化。 结果 TGF-β1诱导24 h后，HK-2细胞中NF-κB mRNA的表达显著上调，为空白对照组的8倍以上（P < 0.01）。NF-κB反义寡核苷酸导入细胞后，可显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞的 NF-κB mRNA表达，比TGF-β1组减少75％（P < 0.05），同时，α-SMA mRNA和蛋白表达亦较TGF-β1组均明显下调（P < 0.05）。 结论 NF-κB反义寡核苷酸可抑制TGF-β1诱导肾小管上皮细胞NF-κB的表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，可能有利于肾间质纤维化的防治。     

血管内皮生长因子C对大鼠近端肾小管上皮细胞凋亡的保护作用

目的 探讨肿瘤坏死因子α（TNF-α）对肾小管上皮细胞生成血管内皮生长因子C（ VEGF-C）的影响,及VEGF-C对TNF-α诱导的肾小管上皮细胞凋亡的作用.方法 体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）,加入不同浓度的TNF-α作用不同时间,用实时定量PCR和Western blot方法检测VEGF-C mRNA和蛋白的表达.用不同浓度TNF-α与放线菌素D（ActD）刺激细胞24 h,流式细胞学方法检测细胞凋亡.再加入不同浓度的VEGF-C,观察其对凋亡的抑制情况.结果 TNF-α促进NRK52E细胞VEGF-C的表达,呈剂量和时间依赖性.TNF-α（加入ActD 30ng/ml）促进细胞凋亡,凋亡率随TNF-α浓度增高而增加.VEGF-C能够抑制凋亡,50 ng/ml时对细胞凋亡有抑制作用,100 ng/ml时抑制作用最强.结论 VEGF-C对大鼠近端肾小管上皮细胞的凋亡具有保护作用.     

Erbin在肾间质纤维化中的表达和作用

目的 探讨Erbin在肾脏间质纤维化中表达量的变化及上调Erbin对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化的影响。 方法 体内实验采用SD大鼠5/6肾切除法建立肾纤维化动物模型,收集并检测各组血清中Scr、BUN水平;Masson染色观察肾间质纤维化程度;免疫组化及Western印迹检测Erbin的分布与表达。 体外实验采用TGF-β1（10 μg/L）刺激NRK52E细胞72 h建立上皮细胞-间充质转分化（EMT）细胞模型;免疫荧光及Western印迹法检测E钙黏蛋白（E-cadherin）和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达变化;RT-PCR及Western 印迹法检测Erbin的表达变化。用脂质体2000将质粒 Prk5-myc-Erbin瞬时转染至NRK52E细胞,Western印迹法观察上调Erbin表达后对上述各种指标的影响。 结果 （1）假手术组大鼠肾功能正常[Scr（33.96±7.28） μmol/L、BUN（8.11±2.55） mmol/L],Masson染色未见肾间质纤维化,Erbin在肾小管表达较少;模型组大鼠Scr [（140.52±61.11） μmol/L]、BUN[（34.23±7.66） mmol/L] 均显著高于假手术组（均P < 0.05）,肾间质可见明显纤维化,Erbin 在肾小管表达也明显增加,是假手术组的2.9倍（P < 0.01）。（2）正常NRK52E 细胞表达E-cadherin,少量表达Erbin和α-SMA。TGF-β1刺激后,NRK52E细胞E-cadherin表达显著减少,Erbin和α-SMA则表达增加（均P < 0.05）;而转染质粒Prk5-myc-Erbin可逆转TGF-β1诱导的NRK52E细胞E-cadherin表达下调,并可抑制α-SMA表达上调（均P < 0.05）。 结论 Erbin在肾间质纤维化中表达增加,上调Erbin表达可抑制TGF-β1诱导NRK52E发生EMT, 提示Erbin在肾脏纤维化中可发挥保护作用。     

黏着斑激酶在转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察转化生长因子（TGF）β1诱导的正常人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化（EMT）过程中黏着斑激酶（FAK）的表达及下调FAK的表达后对TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化进程的影响。 方法 应用TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞,采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E钙黏蛋白（E-cadherin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、FAK mRNA和蛋白的表达及磷酸化（p）-FAK（Tyr397）的蛋白表达。应用Lipofectmine2000将FAK siRNA转染HK-2细胞,采用Western印迹观察下调表达FAK对上述指标的影响。 结果 TGF-β1刺激后,HK-2细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调,E-cadherin蛋白和mRNA表达下调。FAK蛋白和mRNA随时间的延长表达逐渐增多,48 h达到高峰。p-FAK（Tyr397）蛋白表达趋势与FAK相同。脂质体转染siRNA后FAK的mRNA和蛋白分别下调了50%和41%,下调表达FAK后可以显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞α-SMA蛋白的上调表达,逆转 E-cadherin蛋白的下调表达。 结论 在TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化进程FAK蛋白表达上调,敲低FAK蛋白表达后可以部分减轻EMT的程度,提示FAK在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中发挥一定的作用。     

血管内皮生长因子抑制肾小管上皮间充质转化及其与结缔组织生长因子和PI3K-Akt信号通路的关系

目的　探讨血管内皮生长因子（VEGF）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮间充质转化（EMT）的作用,及其与结缔组织生长因子（CTGF）、PI3K-Akt信号通路的关系。 方法 （1）将体外培养的HK2细胞分为正常对照组、TGF-β1（5 μg/L,下同）组、VEGF组（100 μg/L,下同）、TGF-β1＋VEGF组。HK2细胞体外培养48 h,用免疫组化双染方法检测肾小管上皮细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E钙黏蛋白的表达。（2）将体外培养的HK2细胞分为正常对照组、TGF-β1组、VEGF组、TGF-β1＋VEGF组、PI3K-Akt信号通路阻断剂LY294002组（25 μmol/L,下同）、TGF-β1＋LY294002组、VEGF＋LY294002组、TGF-β1＋VEGF＋LY294002组。HK2细胞体外培养48 h,用Western印迹和RT-PCR方法检测α-SMA和CTGF的表达;用ELISA方法检测培养上清中纤连蛋白（FN）和I型胶原（ColⅠ）的表达。 结果 免疫组化结果显示,TGF-β1组α-SMA表达比正常对照组增强,而E钙黏蛋白表达减弱; TGF-β1＋VEGF组α-SMA表达比TGF-β1组显著减弱,而E钙黏蛋白表达增强。 TGF-β1组α-SMA、CTGF蛋白和 mRNA及FN、ColⅠ表达比正常对照组显著增强（均P < 0.05）;TGF-β1＋VEGF组α-SMA、CTGF蛋白和mRNA及FN、ColⅠ表达比TGF-β1组显著减弱（均P < 0.05）;TGF-β1＋VEGF＋LY294002组α-SMA、CTGF蛋白和 mRNA及FN、ColⅠ表达比TGF-β1＋VEGF组显著增强（均P < 0.05）。 结论　VEGF能抑制TGF-β1诱导的体外培养的HK2细胞发生EMT,其机制可能与VEGF下调HK2细胞CTGF表达及减少细胞外FN、ColⅠ合成有关。VEGF的这种作用可能部分通过PI3K-Akt信号转导通路实现,其确切机制有待进一步研究。     

Numb基因在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中的作用

目的 探讨Numb在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中的作用。 方法 重组人转化生长因子β1（TGF-β1）刺激大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞),不同浓度TGF-β1 （0、1、5、10、15、20 μg/L）作用48 h与TGF-β1 10 μg/L作用不同时间(0、24、48、72 h)后,采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光染色分别检测NRK52E细胞内E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Numb 的表达。采用RNA干扰技术下调Numb表达,Western印迹观察改变Numb水平对E-cadherin、α-SMA蛋白水平的影响。 结果 TGF-β1以剂量及时间依赖的方式诱导NRK52E细胞E-cadherin 蛋白表达下调,α-SMA 蛋白表达增高。Numb蛋白的表达随TGF-β1浓度的增加而增高,在5、10、15和20 μg/L时分别为0 μg/L时的1.33倍（P = 0.024)、1.39倍（P = 0.035）、1.45倍（P = 0.025）和1.51倍（P = 0.000)。而Numb蛋白和mRNA的表达亦随TGF-β1作用时间的延长而增高,作用24 h、48 h、72 h,Numb蛋白分别为0 h的1.48倍（P = 0.046)、1.54倍（P = 0.011）、1.79倍（P = 0.028）,Numb mRNA分别为0 h的1.56倍（P = 0.012)、1.82倍（P = 0.008）、1.82倍（P = 0.002）;同时Numb的分布也发生了改变,大量聚集在胞质中。下调Numb表达可以显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA表达上调（为Numb表达正常时的18.1%,P = 0.004）、E-cadherin表达下调（为Numb表达正常时的2.19倍,P = 0.004）。 结论 Numb可以促进肾小管上皮细胞发生转分化。     

Smad7对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞转分化和胶原I合成的影响

目的探讨Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化和胶原（Col）I合成的影响。方法体外培养转染Smad7的大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞），分为强力霉素（Dox）诱导组和未加强力霉素的对照组。前者予Dox诱导24h后，给予高糖刺激；后者不加Dox诱导。采用免疫细胞化学方法检测磷酸化（p）-Smad2／3核转位情况；RT-PCR检测Smad7的表达；Western印迹方法检测不同时间点Smad7、α-SMA、E-钙黏蛋白（cadherin）和Col I蛋白的表达水平。结果成功构建了Dox调控的可上调Smad7表达的NRK52E细胞。NRK52E细胞在基础状态下可表达低水平p-Smad2／3（16．1％），与未加Dox的对照组比较，Dox诱导组可显著抑制高糖刺激的NRK52E细胞TGF-β受体调控信号蛋白Smad2／3的活化和核转位（30.3％比58．5％，P〈0．01）。上调表达Smad7可显著抑制高糖介导的NRK52E细胞α-SMA和Col I蛋白的表达；逆转高糖介导的NRK52E细胞E-cadherin蛋白的下调表达。结论基因转染上调表达Smad7可通过TGF-β受体调控信号蛋白Smad2／3的活化和核转位而阻抑高糖介导的肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质的合成。     

Smad7对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞转分化和胶原Ⅰ合成的影响

目的探讨Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化和胶原(Col)Ⅰ合成的影响。方法体外培养转染Smad7的大鼠近端肾小管上皮细胞株(NRK52E细胞),分为强力霉素(Dox)诱导组和未加强力霉素的对照组。前者予Dox诱导24 h后,给予高糖刺激;后者不加Dox诱导。采用免疫细胞化学方法检测磷酸化(p)-Smad2/3核转位情况;RT-PCR检测Smad7的表达;Western印迹方法检测不同时间点Smad7、α-SMA、E-钙黏蛋白(cadherin)和ColⅠ蛋白的表达水平。结果成功构建了Dox调控的可上调Smad7表达的NRK52E细胞。NRK52E细胞在基础状态下可表达低水平p-Smad2/3(16．1％),与未加Dox的对照组比较,Dox诱导组可显著抑制高糖刺激的NRK52E细胞TGF-β受体调控信号蛋白Smad2/3的活化和核转位(30．3％比58．5％, P<0．01)。上调表达Smad7可显著抑制高糖介导的NRK52E细胞α-SMA和ColⅠ蛋白的表达;逆转高糖介导的NRK52E细胞E-cadherin蛋白的下调表达。结论基因转染上调表达Smad7可通过TGF-β受体调控信号蛋白Smad2/3的活化和核转位而阻抑高糖介导的肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质的合成。     

晚期糖基化终末产物对人肾小管上皮细胞表达结缔组织生长因子和纤维连接蛋白的影响

目的：观察AGE-BSA认对体外培养的人近端肾小管上皮细胞株HK-2表达结缔组织生长因子（CTGF）和纤维连接蛋白（FN）的影响。方法：将HK-2细胞在体外与不同浓度的AGE—BSA和BSA共同培养。以酶联免疫法（ELISA）检测转化生长因子-β1（TGF-β1）的分泌，以逆转录-聚合酶联反应法（RT—PCR）测定CTGF mRNA和FN mRNA的表达。结果：100μg／ml的AGE—BSA刺激HK-2细胞24h，细胞上清中TGF-β1的浓度是对照组的2.37倍。AGE—BSA刺激HK-2细胞48h后，CTGF mRNA的表达开始出现显著升高（P〈0.01）。AGE—BSA能够剂量依赖性的上调HK-2细胞CTGF mRNA和FN mRNA的表达。BSA刺激组没有以上作用。结论：AGE—BSA可上调HK-2细胞CTGF和FN的表达，这可能在糖尿病肾病肾小管间质纤维化形成中起到一定作用。     

黄芪通过c-met调控TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化

AB 目的：探讨黄芪对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质分泌的作用及机制。方法：体外培养正常大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）,应用倒置相差显微镜观察NRK52E细胞形态学变化;免疫组织化学染色法及实时荧光定量PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,肝细胞生长因子HGF受体（c-met）的表达;ELISA法定量检测细胞上清液中胶原Ⅰ（Col-Ⅰ）,胶原Ⅲ（Col-Ⅲ）和纤维黏连蛋白（FN）的水平。结果：TGF-β1可诱导肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化（TEMT）,TGF-β1诱导组细胞肥大、拉长,呈长梭形,α-SMA表达明显增强,Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN分泌增加（P〈0.05）。加入不同浓度黄芪后,细胞形态接近正常肾小管上皮细胞形态,α-SMA表达、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN分泌均较TGF-β1诱导组明显抑制（P〈0.05）,c-met表达较TGF-β1诱导组增加（P〈0.05）且呈剂量依赖性。结论：TGF-β1可以诱导肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化,增加细胞外基质成分Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN的分泌;黄芪能够抑制TGF-β1诱导的NRK52E细胞转分化以及细胞外基质的分泌;黄芪抑制细胞转分化的机制可能与其增强c-met的表达有关。     

内质网蛋白29在肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的:观察TGF-β1诱导的正常大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)转分化过程中内质网蛋白29(ERP29)表达变化及上调表达ERP29蛋白对TGF-β1诱导NRK52E细胞极性蛋白Par-3的影响。方法:应用TGF-β1(10 ng/ml)刺激NRK52E细胞,采用Western印迹和免疫荧光方法分别检测内质网蛋白29、Par-3mRNA及蛋白的表达;应用Lipofectmine2000将ERP29质粒瞬时转染NEK52E细胞,采用Western印迹方法检测细胞极性蛋白Par-3表达变化。结果:TGF-β1刺激后,NRK52E细胞内质网蛋白29表达呈时间依赖模式逐渐下调,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。脂质体转染外源性质粒pcDNA/ERP29上调表达ERP29可显著上调表达细胞极性蛋白Par-3。结论:TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程中内质网蛋白29表达显著下调,基因转染上调表达ERP29可显著提高细胞极性蛋白Par-3表达,提示ERP29在维持细胞极性、阻抑转分化进程中发挥重要作用。