减数分裂重组关键蛋白MLH1结合蛋白的酵母双杂交筛选和鉴定

目的探寻减数分裂关键重组蛋白MLH1在精子发生中的结合蛋白。方法以MLH1为诱饵,通过酵母双杂交系统,在小鼠睾丸组织的cDNA文库中进行筛选,寻找MLH1的相互作用蛋白并通过GST pull-down和免疫共沉淀的方法进行验证。结果通过酵母双杂交的筛选,在小鼠睾丸中经四缺板筛出蛋白29个,包括己知的MLH3和PSM2等。通过GST Pull-down和免疫共沉淀验证了其中一个新的蛋白RHNO1与MLH1的结合。通过Real-time PCR检测发现RHNO1在睾丸中高表达,提示RHNO1在精子发生中具有重要功能。结论酵母双杂交系统是寻找结合蛋白的有力手段,发现了新的MLH1结合蛋白RHNO1,可能参与了减数分裂同源重组。     

HBV表面抗原大蛋白与C53蛋白在肝细胞内的相互作用研究

目的 采用酵母双杂交方法筛选出肝细胞内HBV表面抗原大蛋白(LHBs)的结合蛋白,并验证LHBs与C53蛋白在肝细胞内的相互作用.方法 构建pGBKT7-LHBs作为诱饵质粒,从人肝脏cDNA文库中筛选与其相互作用蛋白的编码基因,发现其中包括C53基因.分别构建pCMV-5a-C53和pACT-C53质粒,采用哺乳动物双杂交及免疫共沉淀的实验方法验证肝癌细胞系HepG2内这两种蛋白之间的相互作用.结果 成功从肝脏cDNA文库筛选出C53蛋白;成功构建了pCMV-5a-C53和pACT-C53质粒,并通过哺乳动物双杂交及免疫共沉淀方法明确了LHBs及C53在肝细胞内的相互作用.结论 肝癌细胞系HepG2中LHBs及C53存在明确的相互作用,为进一步研究二者的相互作用及对相关生物学功能的影响奠定了前期基础.     

METH1在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的通过观察血管生成抑制因子METH1的cDNA片段在酵母双杂交中的表达及检测其对报告基因有无激活作用,为进一步明确METH1抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法采用酵母双杂交Gal4系统3,经PCR扩增子METH1的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因的激活作用。结果成功获得METH1的cDNA片段,该片段所表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性,且对报告基因无激活作用。结论血管生成抑制因子METH1蛋白活性区在酵母双杂交系统中的表达产物,可作为诱饵蛋白进行相互作用蛋白的筛选研究。     

METH1在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的通过观察血管生成抑制因子METH1的cDNA片段在酵母双杂交中的表达及检测其对报告基因有无激活作用，为进一步明确METHI抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法采用酵母双杂交Ga14系统3，经PCR扩增子METH1的cDNA片段，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后。再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因的激活作用。结果成功获得METH1的cDNA片段，该片段所表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性，且对报告基因无激活作用。结论血管生成抑制因子METH1蛋白活性区在酵母双杂交系统中的表达产物。可作为诱饵蛋白进行相互作用蛋白的筛选研究。     

人睾丸酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

目的:构建应用于酵母双杂交系统的人睾丸组织cDNA文库。方法:从正常人睾丸组织总RNA中纯化出mRNA,以SMARTШTM和CDSШ为引物,合成两端具有同源臂的双链cDNA,后者与线性质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母细胞Y187,两者在酵母细胞中同源重组成环形的cDNA文库质粒,收集在营养缺陷培养板上筛选出的所有克隆,即为人睾丸酵母双杂交cDNA文库。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人睾丸cDNA文库,共获得2×106个转化子,插入的双链cDNA片段的长度在0.3～4.0 kb之间。结论:利用ClontechSMART技术,成功构建了应用于酵母双杂交的人睾丸组织cDNA文库,为探讨人精子发生的分子机制奠定了基础。     

应用酵母双杂交系统筛选小鼠PIAS2相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交技术,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选与PIAS2(protein inhibitor of activatedSTAT2,PIAS2)相互作用的未知蛋白。通过对其相互作用蛋白的筛选和研究,探讨PIAS2在精子发生中的作用机制,为临床男性不育症的治疗和诊断提供理论基础。方法:以pGBKT7-PIAS2为诱饵质粒,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选出与pGBKT7-PIAS2相互作用的阳性克隆,对验证后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,进一步采用直接酵母双杂交进行相互作用的验证。结果:经过筛选、测序、同源性分析及直接酵母双杂交验证,发现了与PIAS2相互作用的8个候选蛋白:Cyfip2、Psmb3、Nme1、nischarin、Nsun5、Ints10、Gnb2l1及Ndufaf3。结论:应用酵母双杂交系统,共筛选得到了8个不同的基因,其编码蛋白与PIAS2相互作用,可能与男性生殖调控相关。对上述蛋白与PIAS2的相互作用研究有助于揭示PIAS2的作用机制。     

乳鼠成骨细胞酵母双杂交cDNA文库构建

目的构建乳鼠成骨细胞的酵母双杂交cDNA文库。方法用TRIzol法提取乳鼠成骨细胞总RNA,按照SMART cDNA Library Construction Kit ( CLONTECH)说明书反转录合成双链cDNA.Spin Column去除短片段,然后用同源重组的方法将双链 cDNA和PGADT7~rec载体共转化到酵母细胞Y187中,建立文库并计算文库滴度。结果提取的总RNA的A 260/A 280为 1.99,琼脂糖凝胶电泳示28SrRNA、18SrRNA2条带,且28S与18S带亮度比值约为2。酵母文库库容为1. 68 x 107,重组率为 100%。插人片段PCR检测提示大小分布为1. 5 -4. 0 kb,平均长度约为3. 0 kb。结论乳鼠成骨细胞酵母双杂交cDNA文 库构建成功。     

FBXO43在胃癌中的表达及其生物学功能与作用机制

背景与目的：F-BOX蛋白（FBP）家族成员F-box only protein 43 (FBXO43）在肝癌和结直肠癌等消化系统肿瘤中高表达,促进肿瘤恶性进展,且研究显示,FBXO43促进p53降解,发挥促瘤功能。为此本研究进一步探讨FBXO43在胃癌中的表达及其在胃癌恶性进展中的功能与相关机制。方法：基于TCGA、GTEx和Kaplan-Meier Plotter等在线数据库,分析FBXO43在胃癌组织中的表达及其与胃癌患者预后的相关性。用Western blot和qPCR检测FBXO43在胃癌细胞与正常胃黏膜上皮细胞中的表达水平;用免疫组化检测在胃癌组织与癌旁组织中FBXO43的蛋白水平。利用脂质体转染特异性靶向FBXO43和p53的小分子干扰RNA分子（siFBXO43和sip53）,分别或同时敲低HGC27和MGC803细胞中的FBXO43和p53的表达,利用CCK8、平板克隆形成、Transwell侵袭和迁移等实验,检测细胞生长、增殖、迁移和侵袭能力的影响;利用免疫共沉淀（Co-IP）检测FBXO43和p53的相互作用情况,以及敲低FBXO43后,p53的总泛素化水平。结果...     

雄激素通过雄激素受体途径调控小鼠附睾Fkbp5基因的表达

目的初步研究小鼠附睾Fkbp5(FK506 binding protein 5)基因对雄激素的响应性以及相关的分子机制。方法建立小鼠去势以及雄激素补充模型。采用RT-PCR以及RT-qPCR,检测正常小鼠、去势小鼠以及去势后补充外源雄激素的小鼠附睾中Fkbp5基因的mRNA表达水平。搜索染色体免疫共沉淀-测序(chromatin immunoprecipitation-sequencing,ChIP-seq)数据建立的小鼠附睾全基因组雄激素受体(androgen receptor,AR)结合位点的数据库,寻找与Fkbp5基因相关联的AR结合位点。利用AR抗体进行染色体免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP),采用ChIP-PCR以及ChIP-qPCR的方法,检测Fkbp5基因相关联的AR结合位点在体内与AR的结合情况。结果去势后,Fkbp5基因的表达显著降低(P0.05);补加雄激素后,Fkbp5基因的表达又升至正常水平(P0.05)。从小鼠附睾AR结合位点的数据库中鉴定到14个Fkbp5相关联的AR结合位点。ChIP-PCR结果显示,在正常生理状态下,这14个结合位点均与AR结合。ChIP-qPCR结果显示,去势后,这14个AR结合位点的富集倍数均显著下降(P0.05);而补加雄激素后,这些AR结合位点的富集倍数又显著上升至生理水平(P0.05)。结论 Fkbp5在小鼠附睾内的表达受雄激素的正调控,并且是AR的一个直接靶基因。该研究首次证实了Fkbp5的启动子以及上游增强子区域存在雄激素响应元件,为探究雄激素/AR对Fkbp5的调控机制提供了新的视角。     

胃癌中雌激素和孕激素受体的表达及其临床意义

目的 :应用相应单克隆抗体探讨胃癌中雌激素受体 (ER)和孕激素受体 (PR)表达的临床意义。方法 :用ER、PR单克隆抗体对 86例胃癌标本进行免疫组化 (S -P法 )染色。结果 :①ER、PR在 86例胃癌中阳性表达率分别为 43 .0 %、3 7.2 % ,两者共同阳性 2 4例 (2 7.9% ) ;②ER、PR在胃癌Borrmann第 4型、胃低分化腺癌、粘液腺癌和有淋巴结转移组其阳性率显著高于其它各组 (P <0 .0 1)。而与患者年龄、性别无关 (P >0 .0 5 ) ;③ER、PR共同阳性 2 4例中 ,17例接受化疗加三苯氧胺治疗 ,7例单用化疗 ,随访 3年 ,两者生存率有明显差异 (P <0 .0 5 )。结论 :ER、PR阳性表达的胃癌是一种激素依赖性肿瘤 ,其预后较差 ,但对接受化疗加内分泌治疗有较好效果 ,可延长患者生存期。     

下调MicroRNA-21对胃癌细胞生物学行为及PTEN表达的影响

目的:探讨抑制MicroRNA 21(miR-21)的表达对胃癌细胞的生物学行为及PTEN表达的影响,并分析miR-21参与肿瘤发生、发展的可能机制。方法:应用细胞瞬转的方法将miR-21 inhibitor转染课题组前期试验证实的miR-21高表达胃癌细胞株,应用细胞增殖试验(CCK8方法)、流式细胞技术(Annexin-Ⅴ标记)、Transwell试验检测抑制胃癌细胞株中miR-21表达后,对其细胞增殖、凋亡、周期、迁移的影响;并用Western印迹技术和双荧光素酶报告载体技术检测下调miR-21后,胃癌细胞株PTEN表达的变化。结果:体外增殖试验显示,下调miR-21后对胃癌细胞株的增殖抑制作用明显(P<0.05);体外凋亡试验显示,下调miR-21能增加胃癌细胞株的凋亡(P<0.05);Western印迹试验显示,抑制miR-21表达后胃癌细胞株PTEN蛋白表达明显增加,荧光素酶相对活性明显增加(P<0.05)。结论:下调miR-21的表达对胃癌细胞株的增殖有明显的抑制作用,且促进其凋亡,能降低其体外迁移能力;下调miR-21后,PTEN活性明显增加;PTEN可能是miR-21参与胃癌发生、发展的靶标之一。     

miR-126在胃癌中的表达及其靶基因Crk的鉴定

目的:分析miR-126在胃癌中的表达水平并鉴定miR-126的靶基因,以阐明miR-126在胃癌发生机制中的功能。方法:采用qRT-PCR分别检测miR-126在胃癌细胞株、正常胃黏膜组织、永生化胃黏膜上皮细胞、胃癌及配对癌旁组织的表达水平,并与胃癌组织的临床病理指标进行相关性分析。采用生物信息学方法预测出miR-126的靶基因,并通过荧光素酶报告系统加以验证;采用qRT-PCR及Western印迹法检测miR-126对靶基因mRNA及蛋白质表达水平的影响。结果:qRT-PCR检测结果显示,miR-126在胃癌细胞株中的表达水平明显低于其在正常胃黏膜组织及永生化胃黏膜上皮细胞株的表达水平。miR-126在60例病人的胃癌组织中表达的水平显著低于其在配对癌旁组织中表达的水平;且胃癌组织miR-126表达水平低者,肿瘤组织体积较大,胃壁浸润较深,易发生淋巴结转移,病理分期也较晚。生物信息学分析提示Crk mRNA的3′UTR含有miR-126直接作用的靶序列,荧光素酶报告系统检测进一步验证了该靶序列,qRT-PCR及Western印迹法证实miR-126对Crk蛋白表达的调控发生在转录后水平。结论:miR-126有望成为研究胃癌的新型标志物;miR-126通过对其靶基因Crk的调控参与了胃癌的发生、发展过程。     

脂氧酶12 编码区遗传变异与胃癌发病的关系

目的：探讨位于脂氧酶12（LOX12）基因编码区Arg261Gln单核苷酸多态与胃癌发病风险的关系。方法：用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）方法检测148例胃癌患者和148例无肿瘤正常对照人群的LOX12的基因型,并以Logistic回归模型计算各基因型与胃癌发病风险的关系。结果：LOX12 Arg261Gln等位基因频率在胃癌组中（0.544）高于正常组（0.443）。与Arg/Arg基因型携带者相比,Gln/Gln基因型携带者发生胃癌的风险增加（OR=2.26,95%CI=1.15~4.46,P=0.018）,而杂合基因型Arg/Gln不增加胃癌发病风险（OR=1.37,95%CI=0.77~2.44,P=0.284）。结论：LOX12编码区Arg261Gln遗传变异可能是胃癌发病的重要遗传易感因素。     

肿瘤转移相关基因Ezrin在胃癌中的表达及意义

目的 探讨细胞骨架蛋白Ezrin在胃癌中的表达及其意义。方法 采用免疫组织化学方法（免疫组化法）检测组织芯片上90例胃癌组织及12例正常胃组织标本中Ezrin的表达，结合胃癌的临床病理特点进行分析。同时应用Western印记检测胃癌细胞株的Ezrin的表达，体外侵袭试验验证其侵袭能力。结果 90例胃癌组织中Ezrin的阳性表达率为93．3％，而12例正常组织Ezrin表达均阴性，两者比较P〈0.05，差异有统计学意义。同时，Ezrin阳性率与胃癌患者有无区域淋巴结转移相关（P〈0．05）。胃癌MKN-45细胞株中Ezrin的表达（171．72）明显高于其他4个细胞株（47.44～132．51）；同时，MKN-45细胞的侵袭能力（220．21）也强于其他4株胃癌细胞（89．23～210．35）。结论 胃癌组织中的Ezrin阳性表达显著高于正常胃组织，并与胃癌的转移相关。     

环状RNA cRAPGEF5对胃癌细胞增殖、侵袭和转移影响的实验研究

目的:观察环状RNA(circRNA) cRAPGEF5对胃癌细胞增殖、侵袭和转移的影响。方法:选取新乡医学院第一附属医院2018年1月至2020年1月手术切除的143例胃癌组织和癌旁组织作为研究对象,采用转录组织化学测序和荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)分析cRAPGEF5表达水平;根据过表达的circRNA的类...     

长链非编码RNA X染色体失活特异转录物调控微小RNA-335对胃癌的增殖和迁移的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)X染色体失活特异转录物(XIST)对胃癌细胞增殖、迁移的影响及其作用机制。方法收集2018年1月至2019年12月来自宜昌市中心人民医院的胃癌患者42例,采用定量聚合酶链反应(qPCR)检测XIST在胃癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织中表达,分析XIST表达与患者临床病理参数的相关性。采用qPCR检测XIST在胃癌细胞系中的表达,通过转染小干扰RNA(si-XIST)敲低XIST在胃癌细胞SGC-7901和AGS中的表达,分别将胃癌细胞分为si-XIST组和si-NC组,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测各组细胞的增殖活性,细胞划痕实验和Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力,双荧光素酶验证XIST与微小RNA(miR)-335的靶向关系。组间比较采用t检验。结果XIST在胃癌组织中相对表达量为1.86±0.24,显著高于癌旁正常组织的0.98±0.11,差异有统计学意义(P<0.05),同样,胃癌细胞系中XIST的相对表达显著上调(P<0.05),差异有统计学意义。组织样本中XIST的表达与患者的TNM分期和淋巴结转移明显相关(P<0.05),差异有统计学意义,敲低XIST表达可显著降低胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,XIST可负向调控miR-335的表达。结论lncRNA XIST可负向调控miR-335的表达,从而抑制胃癌的增殖、迁移和侵袭能力。     

肌肉游离移植后肌肉萎缩盒F基因和肌肉环状指基因1 mRNA的表达

目的 检测肌肉移植后肌肉萎缩盒F基因(muscle atrophy F-box,MAFbx)和肌肉环状指基因1(mLIsele ring finger 1,MuRFI)mRNA表达的变化,并探讨其与肌肉萎缩和肌肉功能的关系.方法 建立大鼠股薄肌原位游离移植的模型,以自身为对照,应用real-time PCR、电生理等方法,观察MAFbx和MuRFI mRNA表达、肌肉萎缩与肌肉功能的演变,统计学分析三者之间的相关性. 结果肌肉移植术后,肌纤维横截面积、肌肉湿重维持率、肌肉最大单收缩力和肌肉强直收缩力维持率均先降低后增加,术后晚期时仍低于对照侧水平(P<0.05)6肌肉移植后MAFbx和MuRFI mRNA在术后3～4周时达到最高然后逐渐降低,最高达对照侧的7.1倍和4.1倍,术后晚期时仍持续低水平高表达,与对照侧比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 肌肉移植后MAFbx和MuRFI mRNA的持续高表达,是肌肉萎缩引起肌肉功能降低的重要联系点.二者可以作为骨骼肌萎缩早期的标记物,也可以作为药物干预的潜在靶点用于治疗肌肉萎缩.     

S100A6对胃癌细胞侵袭转移的调控机制研究

目的探讨S100A6过表达对胃癌细胞侵袭转移的调控机制。方法收集1995年1月至2001年12月间经病理确诊的166例胃癌标本及其对应的癌旁组织、肝转移组织和淋巴结转移组织标本,采用免疫组织化学染色法检测标本中S100A6蛋白的表达情况及其与临床病理因素的关系：通过ChIP—Chip方法检测胃癌细胞株KAT03中S100A6可能调控的下游因子;将S100A6基因转染入胃癌细胞株AGS,通过细胞侵袭实验、RTQ—PCR方法分别检测转染组、阴性对照组和空白对照组中细胞的侵袭能力和侵袭转移相关因子CDK5和FLJ12438的mRNA表达。结果S100A6蛋白在癌旁组织细胞质中偶有低表达;而在胃癌、肝及淋巴结转移灶组织的肿瘤细胞质和（或）细胞核中均有高表达,且在侵袭边缘的肿瘤细胞的细胞核中表达较高,其高表达率为分别为67．5％（112／166）、92．9％（26／28）和100％（30／30）。S100A6表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、脉管癌栓、远处转移及TNM分期有关（均P〈0．05）。S100A6可能作用于26个细胞侵袭转移有关基因的启动子部位。SIOOA6转染组的过膜细胞数为31．3±5．5,多于阴性对照组的7．7±1．5和空白对照组的9.3±2．1,差异有统计学意义（均P〈0．05）。CDK5mRNA在转染组中的表达水平显著高于阴性对照组和空白对照组（均P〈0．05）,而FLJ1243mRNA在转染组中的表达水平与另外两组的差异则无统计学意义（均P〉0．05）。结论S100A6可能通过调控下游侵袭相关因子如CDK5的表达,进而影响胃癌细胞的侵袭转移等恶性生物学行为。     

miR-362-3p的表达及其靶基因与胆囊癌恶性特征的关系

目的:探讨miR-362-3p在胆囊癌中的表达及功能。方法:用qRT-PCR检测手术切除的44例胆囊癌患者手术标本中miR-362-3p的表达,并分析其表达与胆囊癌临床病理特征及预后的关系。miR-362-3p模拟物转染胆囊癌细胞后,分别用MTT法、细胞划痕试验及Transwell侵袭试验观察细胞增殖、迁移及侵袭的改变。通过生物信息学方法及双荧光素酶报告基因试验分析miR-362-3p的靶基因,并采用补救试验验证。结果:miR-362-3p在胆囊癌组织的表达明显低于相应癌旁组织(P0.05)。miR-362-3p的低表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移及远处转移明显有关(均P0.05)。低表达miR-362-3p患者总体生存率较高表达miR-362-3p患者明显降低(P0.05)。转染miR-362-3p模拟物后,胆囊癌细胞的增殖,迁移及侵袭能力明显减弱(均P0.05)。Nemo样激酶(NLK)被确定为miR-362-3p的潜在靶基因,转染NLK过表达载体后,miR-362-3p模拟物对胆囊癌细胞的上述作用被明显逆转(均P0.05)。结论:miR-362-3p在胆囊癌中表达下调,下调的miR-362-3p减少了对靶基因NLK的抑制,从而促进了胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭。