成肌细胞心脏移植的方法学研究

目的:建立成肌细胞与心肌细胞体外联合培养的模型,并研究其合胞体的形成。 方法:取1-3日龄新生大鼠,在体外分别分离提纯成肌细胞和心肌细胞,以1:1细胞数混合(浓度均为1×10~8 L~(-1))接种于培养板中,在联合培养的第4天收集细胞做电镜观察,活细胞玻片做微注射活化生物素,以德科萨斯红标记的卵白素作为二抗标记,荧光显微镜观察。结果:成肌细胞有约95％的细胞抗α-肌动蛋白,结蛋白染色阳性,在透射电镜观察成肌细胞与心肌细胞联合培养的细胞超微结构,发现了两种细胞能够形成桥粒连接,未见到间隙连接,而细胞微注射则显示活化生物素可以通过两种细胞形成的连接,即间隙连接。 结论:在体外,两种细胞联合培养可以形成桥粒连接和间隙连接,即电机械连接,为成肌细胞的心脏内移植可能形成合胞体提供了一个研究方法和有力证据。     

肝癌靶向液态氟碳脂质微球造影剂的体外寻靶实验研究

目的 制备液态氟碳脂质微球造影剂并研究其体外基本特性,再引入抗人肝癌细胞单克隆抗体,采用生物素亲和素法,进行体外靶向结合的研究.方法 采用旋转蒸发法和高压均质法制备一种纳米液态氟碳脂质微球造影剂,观察其外观、形态、大小及分布情况,计算其浓度,并测定其粒径、电位;制备生物素的抗人肝癌细胞单克隆抗体HAb18,用HABA/Avidin试剂盒检测抗体的生物素化程度;制备NBD标记的生物素化的微球,采用生物素亲和素法研究其体外靶向作用.结果 所制备的液态氟碳脂质微球造影剂外观呈乳白色的混悬液,镜下观察,微球形态圆整,大小均一,性质稳定,平均粒径171.9 nm;采用生物素亲和素法制备的NBD标记的生物素化的微球可靶向结合到靶细胞上.结论 成功制备出稳定的纳米液态氟碳脂质微球造影剂,并引入抗人肝癌细胞单克隆抗体,通过生物素亲和素系统可将其特异结合到靶细胞上.     

人白血病抑制因子受体单抗靶向脂质体微泡的制备及其体外荧光鉴定

目的 制备人白血病抑制因子受体( LIFR)单抗靶向脂质体微泡,并对其微泡微囊的连接可靠性进行体外免疫荧光鉴定.方法 利用生物素-亲和素桥连技术,构建LIFR单抗脂质体微泡(MB-BSB-LIFR-AB).以FITC荧光亲和素标记普通脂质体微泡(MB)、生物素化脂质体微泡(MB-B),以两个不同浓度梯度(1:4和1:16)的DTAF荧光二抗分别标记MB、MB-B、生物素-亲和素脂质体微泡(MB-BS)、MB-BSB-LIFR-AB;荧光显微镜下观察微泡荧光强度并分为0级、1级、2级、3级.结果 加入FITC荧光亲和素后,MB-B呈现3级明亮的绿色荧光,而MB无荧光显示(0级);以1:4和1:16浓度梯度的DTAF荧光二抗孵育后,MB-BSB-LIFR-AB均发出3级明亮的绿色荧光;而MB-BS、MB-B仅在1:4时显示1级微弱的绿色荧光;MB在两个浓度梯度下均无荧光显示(0级).结论 携LIFR单抗通过生物素-亲和素桥连技术有效连接在MB-B微囊;体外荧光法是鉴定靶向脂质体微泡配体连接可靠性的简便方法.     

腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌的血管再生

背景：骨髓间充质干细胞的存活率与良好的血液供应关系密切，在移植早期其自身所分泌产生的促血管生长因子不足以刺激血管新生而容易导致移植的细胞死亡。目的：观察骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠梗死心肌组织修复重建、血管再生的影响。设计、时间及地点：随机分组设计的细胞基因工程实验，于2006-01／2007-12在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。材料：选取具有相同遗传背景的雄性SD大鼠40只建立急性心肌梗死模型，6~8周龄．体质量250～300g。方法：体外分离、培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞，以BrdU标记骨髓间充质干细胞。腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞。将造模后大鼠随机分为4组．每组10只：基因转染骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射体外转染腺病毒介导血管内皮生长因子的骨髓间充质干细胞；骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射骨髓间充质干细胞；基因转染组，注射腺病毒介导的血管内皮生长因子；对照组，注射无血清IMDN培养液。主要观察指标：移植4周后观察移植细胞分化和新生血管的形成，并通过超声多普勒检测心功能变化。结果：细胞移植4周后，基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组移植区移植细胞表现为心肌肌钙蛋白T染色阳性，细胞呈肌样细胞形态，并且两组心功能都较移植前有明显改善，基因转染骨髓间充质干细胞组改善程度优于骨髓间充质干细胞组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞，参与构成了梗死区域新生毛细血管，相对于单纯细胞移植与细胞因子移植，细胞移植结合血管内皮生长因子基因转染促进毛细血管新生更明显。结论：骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染可以通过促进心肌再生和新生血管的形成来重建缺血心肌，明显改善心功能。     

SD乳鼠离体骨骼肌成肌细胞与心肌细胞间连接的初步研究

目的：探寻共同培养的骨骼肌成肌细胞与心肌细胞间连接的形态学证据。方法：将鼠心肌细胞与骨骼肌成肌细胞体外共培养,于第2、4、7、14天免疫组化染色钙粘素（Cadherin）、细胞间隙连接蛋白73（Connexin43）、神经细胞粘附分子（NCAM）3种蛋白,并行定量RT-PCR检查分组比较分析;于第4、7、10、14天透射电镜观察。结果：共同培养物中的骨骼肌成肌细胞表达Connexin43,且随时间延长而增加;Cadherin表达增加不明显;NCAM含量维持在较低水平,至2周时才表达较多;透射电镜下观察到两者间存在类似于缝隙连接的连接。结论：与心肌细胞共培养后骨骼肌成肌细胞融合、成熟延迟,Connexin43表达增多;两者间确有形成类似于缝隙连接的物质基础并可形成连接。     

气液界面培养体外构建角膜上皮的实验研究

目的：建立气液界面培养体外构建兔角膜上皮的方法。评价体外构建角膜上皮的生物学特性。方法：新西兰白兔15只30只眼，取角膜缘上皮组织。组织块接种原代培养。细胞融合生长后，消化传代。以去上皮细胞人羊膜组织为载体，接种培养传代细胞，细胞融合后，用气液界面培养方法继续培养2周。倒置显微镜对体外构建的角膜上皮进行观察。培养细胞膜片固定，苏木精一伊红(HE)染色；AE1细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色，光镜观察。常规制作电镜标本，透射电镜观察。以传统培养方法作为对照。结果：倒置显微镜观察，气液界面培养可以形成连续的上皮细胞层，细胞和载体之间连接较牢固。HE染色显示体外构建的角膜上皮具有复层扁平上皮的结构。免疫组化染色有较高的阳性率。透射电镜观察细胞之间有丰富的桥粒样连接。结论：气液界面培养方法可以构建复层鳞状角膜上皮。与传统培养方法比较，构建的角膜上皮组织具有较优越的生物学特性。     

心脏MRI在体示踪移植细胞的可行性研究

目的：寻找一种能够对移植细胞进行在体示踪的标记方法,为细胞移植的动物和临床实验中细胞的存留、迁移提供重要手段。方法：从中华小型猪髂骨处抽取骨髓,体外培养扩增MSCs。将SPIO和MSCs共同孵育培养36h。普鲁士蓝染色评价细胞的标记效率;通过MTT比色实验评价SPIO对细胞生长能力的影响;台盼蓝染色检验标记后细胞的活性;使用Costar Transwell方法评价铁离子对细胞迁移能力的影响;用细胞分化诱导液培养标记后的细胞评价其向成脂肪细胞和成骨细胞的分化能力。在体内实验中将SPIO标记或未标记的自体MSCs注射到心肌或冠状动脉内,通过心脏磁共振检查对移植细胞进行在体示踪观察。在细胞移植后不同时期取材动物心脏切片进行普鲁士蓝染色观察移植细胞。结果：MSCs经铁离子标记后普鲁士蓝染色阳性率在98%以上,可见蓝染颗粒位于细胞浆内,标记细胞电镜切片观察可见高密度铁颗粒位于细胞浆内。MTT比色实验发现随着培养液中SPIO浓度的增加细胞增殖能力没有明显改变;台盼蓝染色显示标记后98％的细胞保持活性;细胞经SPIO标记后仍可保持原有的细胞形态,可继续培养、传代。细胞迁移试验发现细胞标记后对SDF-1和VEGF诱导的迁移能力没有明显的减低。铁离子标记后细胞仍可向成脂肪细胞和成骨细胞分化。注射到心肌或冠状动脉内的SPIO标记的MSCs可通过心脏磁共振检查进行在体示踪,动态观察显示SPIO标记细胞在磁共振影像上表现为低密度灶影或信号缺失,并且在移植后4周仍可显影。病理学检查可以看到移植细胞呈普鲁士蓝染色阳性,并和影像学有很好的一致性。结论：临床使用的SPIO磁共振对比剂可以安全、有效的标记MSCs。利用心脏磁共振对移植的标记细胞可以实现移植细胞的在体示踪观察。此标记方法结合心脏磁共振技术为移植细胞的在体示踪和细胞存留、迁移的研究提供了良好的手段。     

兔骨髓基质细胞的生物学特性及植人心肌后的存活状况

目的：观察兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，MSCs)的部分生物学特性及植人心肌后的存活状况。方法：密度梯度离心与贴壁粘附得到高纯度的兔下肢骨MSCs，建立体外培养体系，光镜、电镜、细胞周期等观察其生物学特性，4^ ，6-二脒基-2-苯吲哚(4^ ，6-dia midino-2-phenylindone，DAPI)标记培养的MSCs，植人心肌后检测植入细胞在6周内不同时相点的存活状况。结果：体外培养的MSCs显示良好的贴壁扩增生长能力，88％的培养细胞为静止期细胞，96.4％细胞为活细胞，电镜证明培养细胞显示幼稚细胞的结构。标记的MSCs植人心肌后至少生存6周并且植入细胞扩散融合于植入区宿主心肌中。结论：体外培养的MSCs显示幼稚细胞形态，标记的培养MSCs植人心肌后可以长期存活并扩散融合于宿主心肌。     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景：体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题。 目的：观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法。 设计：单一样本观察。 单位：四川大学生命科学院细胞生物学实验室。 材料：孕14dSD大鼠10只。DMEM／F12 1：1，碱性成纤维细胞生长因子，表皮生长因子；巢蛋白抗体IgG，β-微管蛋白Ⅲ抗体IgG，胶质纤维酸性蛋白抗体IgG，生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗。 方法：实验于1999／2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成。①从胎鼠前脑取出脑组织，采用酶消化．机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆。②神经干细胞以2&;#215;10^8 L^-1密度接种培养，分4组，每组6瓶细胞，DMEM／F12组：加入DMEM／F12（1：1）培养基含体积分数为0．1的小牛血清；碱性成纤维细胞生长因子组：培养基为含20μg／L碱性成纤维细胞生长因子；表皮生长因子组：培养基含30μg／L表皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子＋表皮生长因子组：先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2h后再换成含表皮生长因子的培养基培养。培养24h后更换培养瓶，培养14d后显微镜下计数原代克隆数，免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达。 主要观察指标：①神经干细胞的原代克隆。②单细胞克隆培养结果。③诱导分化结果。 结果：①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力，免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高（0．630％）。③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞。 结论：①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法。     

亲和素桥连构建携抗P选择素单抗靶向超声微泡及体外荧光鉴定

目的 体外荧光方法鉴定生物素-亲和素-生物素(BSB)桥连技术构建携带抗P-选择素单抗靶向超声微泡(MB-BSBp)的町靠性.方法 不同荧光标记物分别标记MB-BSBp的不同部位,观测微泡荧光强度(0、1、2和3级),以普通脂质超声微泡(MB)作对照.结果 加入FITC荧光亲和素孵育,生物紊化脂质微泡(MB-B)呈现明亮的绿色荧光(3级),而MB无荧光显示(0级).以两个浓度梯度(1:4和1:16)的DTAF荧光二抗(抗抗P-选择素单抗抗体)标记MB、MB-B、MB-BS和MB-BSBp,MB-BSBp在两个浓度梯度下均发出明亮的绿色荧光(3级);而MB-B、MB-BS仅在1:4时显示微弱的绿色荧光(1级),MB在两个浓度梯度下均无荧光显示(0级).结论 抗P-选择素单抗通过亲和素桥连有效装配在MB-B表面,体外荧光法是鉴定靶向微泡配体连接可靠性的简便方法.     

抗内皮细胞黏附分子-1靶向微泡介导hAng-1基因转染治疗兔心肌缺血的实验研究

目的 探讨应用抗心肌内皮细胞粘附分子-1（ICAM-1）靶向微泡能否提高血管生成素-1基因在缺血心肌中的转染效率.方法 体外实验检测抗ICAM-1靶向微泡与经人白细胞介素-1β刺激后的ECV304细胞结合的程度.体内实验分三组：①对照组：hAng-1基因＋超声照射;②非靶向微泡组：携hAng-1基因微泡＋超声照射;③靶向微泡组：携hAng-1基因的抗ICAM-1靶向微泡＋超声照射.制作兔急性心梗模型,分别用上述三种方法从静脉导入hAng-1基因.2周后心肌造影检测梗死心肌灌注状况聚合酶链反应（RT-PCR）检测hAng-1基因的mRNA表达以评价转染疗效.结果 携抗ICAM-1抗体的微泡在体外能大量靶向结合到产生炎性反应的ECV304细胞周边.应用靶向微泡转染2周后,左室内径减小,射血分数升高,但与非靶向微泡比较,差异无统计学意义（P〉0.05）,而心肌造影显示心肌内造影剂填充量较非靶向微泡组增多,且 RT-PCR定量灰度分析hAng-1mRNA（1.04±0.08）高于非靶向微泡组（0.53±0.04）,差异有统计学意义（P〈0.01）.结论 微泡与抗ICAM-1抗体连接后形成靶向微泡载体,可明显提高hAng-1基因在体内的转染效率,增加心肌梗死后局部的血管新生效应.     

与甲壳素缝线体外复合培养大鼠成肌细胞株L6细胞的形态学

目的：探讨甲壳素作为骨骼肌组织工程支架材料的可行性。 方法：实验于2002-06／12在南方医科大学应用解剖学研究所完成。大鼠成肌细胞株L6与甲壳素医用缝合线体外复合培养。倒置相差显微镜下观察细胞的形态和排列情况。并分别在体外复合培养的第1，2，3，4，5，6天，取出细胞支架复合体，扫描电镜观察成肌细胞的形态和排列情况。 结果：①扫描电子显微镜观察显示，甲壳素医用可吸收缝线的表面比较粗糙。②倒置相差显微镜下可见大鼠L6细胞与甲壳素制备的医用可吸收缝合线间黏附良好，细胞沿缝线排列呈现串珠样，并可以见到细胞聚集现象。③扫描电子显微镜观察，接种24h后，细胞主要为圆球形，随后细胞迁移、伸展、并见突起；第3天，成肌细胞主要为梭形，并见融合趋势；4d后，细胞沿材料纵轴排列并相互融合，并见肌小管样结构形成及细胞外基质分泌。 结论：甲壳素具有作为支架以构建组织工程化骨骼肌的潜能，支架的平行排列有助于工程化骨骼肌纤维良好方向性的形成。     

靶向超声微泡MB_(ICAM-1)的制备及靶向实验研究

目的制备载抗ICAM-1(细胞间黏附分子-1)的靶向超声微泡MBICAM-1,鉴定制备微泡的基本性质,研究其在体内及体外的靶向能力。方法通过"生物素-亲和素"桥接法将抗ICAM-1结合到生物素化脂质微泡,制成MBICAM-1;检测制备微泡的浓度、粒径,观察微泡的形态;检测抗ICAM-1与微泡的结合率;ICAM-1质粒转染Hela细胞,观察转染后的Hela细胞与MBICAM-1结合,验证MBICAM-1体外靶向功能;制备家兔左侧跟腱炎症模型,用制备的微泡对家兔双侧跟腱行造影检查,验证MBICAM-1体内靶向能力。结果三种微泡平均粒径1.00~2.4μm,浓度2.4×108~10/ml;微泡的形态完整、规则,分布较匀;微泡和抗ICAM-1单抗的平均结合率为(86.5±5.3)%。MBICAM-1环绕在转染后的Hela细胞周围。MBICAM-1对家兔左侧跟腱造影呈高增强。结论采用"生物素-亲和素"桥接法可制备MBICAM-1;MBICAM-1在体外、体内均具有靶向功能。     

人类胚胎来源成肌细胞的培养和鉴定

背景：人类胚胎骨骼肌含有成肌细胞,其在体外条件下的培养及在体外能否融合形成肌管,以及表达的相应的标志物,目前尚不明确。目的：验证源于人类胚胎骨骼肌的成肌细胞在体外条件下的培养条件,能否在体外融合形成肌管,能否表达神经细胞的标志物。方法：采用组织块培养法对人类胚胎肌肉来源的成肌细胞进行原代培养,以免疫细胞化学染色检测培养的细胞肌肉细胞标志物desmin、myogenin、平滑肌肌动蛋白、myosin和神经细胞标志物β-tubulinⅢ、nestin、neurofilament200（NF200）、胶质纤维酸性蛋白的表达。结果与结论：从人类胚胎肌肉组织中成功培养出成肌细胞,表达成肌细胞的标志物desmin和myogenin,同时也表达神经元特异性烯醇化酶、nestin和NF200,细胞能够在体外融合形成含有多个细胞核的肌管,融合的肌管可以表达NF200、β-tubulinⅢ和胶质纤维酸性蛋白等神经细胞的标志物。结果证实,人类胚胎肌肉来源的成肌细胞能够同时表达神经细胞和肌肉细胞的标志物,培养的成肌细胞和肌管细胞表达神经元特异性烯醇化酶、β-tubulinⅢ、nestin、NF200和胶质纤维酸性蛋白。说明这几种神经细胞标志物不能用于肌肉来源的细胞向神经细胞跨分化的鉴定研究。     

生物素-亲和素介导以KDR为靶点的脂质体超声造影剂体外靶向实验研究

目的 以与VEGF的主要受体KDR特异性结合的小肽K237为配体研制靶向脂质体超声造影剂并进行体外性能鉴定.方法 采用"生物素一亲和素"桥接法构建靶向微泡(P-Bio-Av-Bio-Mbs),将KDR不同程度表达的细胞LOVO、HUVECs和LS174T分别与P-Bio-Av-Bio-Mbs孵育,同时另将荧光标记生物素-亲和素桥接靶向脂质体微泡(FITC- P-Bio-Av-Bio-Mbs)、荧光标记的单纯小肽微泡复合物(FITC-P-Mbs)及荧光标记的普通脂质体微泡(FITC-Mbs)分别与LOVO细胞孵育,光镜及荧光显微镜观察微泡与细胞结合的花环形成率及荧光强度;分别以10 ?g、50 ?g的小肽K237预先与LOVO细胞孵育,再将P-Bio-Av-Bio-Mbs与LOVO细胞孵育,观察细胞周围微泡分布.结果 KDR强阳性表达的LOVO细胞周围花环形成率高达90.52%,荧光强度3级,KDR阳性表达的HUVECs周围花环形成率53.46%,荧光强度2级,KDR阴性表达的LS174T细胞周围少数微泡黏附,花环形成率5.57%.荧光强度0～1级,组间花环形成率比较差异有统计学意义(P<0.05).FITC-P-Bio-Av-Bio-Mbs、FITC-P-Mbs及FITC-Mbs与LOVO细胞结合,花环形成率分别为89.62%、7.56%、0%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05),荧光强度分别为3级、0～1级、0级.10?g预处理组靶细胞周围花环结构明显减少,50 ?g封闭组靶细胞周围无花环形成.结论 以KDR为靶点携小肽K237的靶向脂质体造影剂通过生物素-亲和素桥介导成功制备,在体外能与靶细胞高效特异结合.针对KDR为靶点进行肿瘤新生血管分子靶向显像可能为肿瘤早期诊断提供新的思路.     

兔骨髓间充质干细胞体外向心肌样细胞诱导分化:缝隙连接蛋白43的表达变化

背景:骨髓间充质干细胞经过诱导因素刺激后,能够分化为心肌细胞,同时表达缝隙连接蛋白43,移植后可改善心功能或修复受损的心脏起搏传导系统.而缝隙国连接蛋白43在维持心脏正常功能中发挥着重要作用.目的:观察兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞过程中缝隙连接蛋白43的表达变化,及诱导后骨髓间充质干细胞间隙连接通讯功能的改变.方法:采用Percoll非密度梯度离心法与贴瞳法分离培养兔骨髓问充质干细胞,正常组不进行任何干预,诱导组加入5-氮胞苷向心肌样细胞诱导,免疫荧光及流式细胞仪检验细胞诱导前后缝隙连接蛋白43的表达.将原代培养1 d的乳鼠心肌细胞分别接种于上述两组细胞爬片上,免疫荧光观察兔骨髓间充质干细胞与心肌细胞形成间隙连接的情况.划痕试验设立正常组、诱导组以及添加甘草次酸的阻滞剂组,观察兔骨髓间充质干二细胞诱导前后细胞间隙连接的功能变化.结果与结论:正常组骨髓间充质干细胞缝隙连接蛋白43呈弱表达,5-氮胞营诱导2,4周后缝隙连接蛋白43的表达均显著增加(P<0.01),细胞间隙连接通讯功能明显增强(P<0.001),且随诱导时间的延长呈依赖性增强(P<0.05).骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养后,诱导组缝隙连接蛋白43明显呈线状表达在两个相邻细胞的接触面.与诱导4周时比较,阻滞剂组细胞问隙连接通讯功能明显受到抑制(P<0.001).提示骨髓间充质干细胞能够自发衷达缝隙连接蛋白43,在移植后早期能与心肌细胞形成间隙连接,从而有利于移植后心肌电传导,并发挥骨髓间充质干细胞的旁分泌效应.     

骨髓基质干细胞体内和体外分化为心肌细胞的条件

目的：探讨5-氮胞苷和心肌内环境对骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)向心肌细胞转化的影响。方法：体外分离培养纯化MSCs，用Brdu标记MSCs，用不同浓度的5-氮胞苷诱导MSCs3周后，计算心肌细胞转化率。利用免疫组化方法测定诱导后MSCs中心肌特异性抗体(肌钙蛋白Ⅰ，肌凝蛋白重链)的存在。在体实验中，将体外标记的MSCs分为对照组，未诱导组，诱导组，移植给正常鼠，于移植后第1，2和4周取鼠心肌组织的HE病理切片镜下观察，使用免疫组化法检测Brdu阳性细胞中心肌特异性抗体的存在并观察MSCs向心肌细胞转化情况。结果：5-氮胞苷可以在体外诱导MSCs分化为心肌样细胞，而且在5μmol／L浓度的情况下，心肌样细胞转化率最高。同时，心肌内环境也可以诱导MSCs分化为心肌样细胞，而且避免了5-氮胞苷的副作用。结论：MSCs在5-氮胞苷和心肌内环境的作用下均可以分化为心肌样细胞，并具有心肌特异性蛋白结构，可以作为心肌细胞移植的理想种子来源。     

成人心肌干细胞的体外培养纯化与鉴定

目的：自成人心脏组织培养获得的细胞中分选得到心肌干细胞,体外培养并鉴定其表面标记。方法：手术中取下的非心肌病患者心脏组织标本,通过组织块培养法及冲洗获得的细胞,以免疫磁珠进行分选,纯化后的细胞在条件培养基中培养,待增殖至一定数量后进行表面标记的流式细胞鉴定。结果：心肌组织块培养可获得小、圆、亮细胞,将其冲洗下来后以c-kit磁珠分选,之后在通过胎鼠成纤维细胞制备的条件培养基中培养,可增殖并形成心球样细胞团结构,流式细胞仪鉴定其为c-kit^＋。结论：通过本实验的方法可以在成人心肌组织中分离并纯化得到c-kit^＋的心肌干细胞,其可在体外增殖形成典型的心球样细胞结构并可保持表面的c-kit干细胞标记。     

周期性张应力下成肌细胞中半胱天冬氨酸蛋白酶9参与力学信号传导

背景：功能矫形使面颌部肌肉发生适应性改建,以纠正错颌畸形。成肌细胞是适应性改建的主要体现者,周期性牵张应力导致成肌细胞凋亡,而半胱天冬氨酸蛋白酶9是线粒体凋亡通路中的重要因子。 目的：明确半胱天冬氨酸蛋白酶9在不同时间周期性张应力作用下的表达变化。 方法：以大鼠L6成肌细胞为实验对象,在成功构建成肌细胞体外培养-力学刺激模型的基础上,通过多通道细胞牵张应力加载系统,分别对待测细胞持续施加1,6,12,24 h的周期性张应力,不加力组为对照组。倒置相差显微镜下观察成肌细胞的形态学改变和生长状况;运用RT-PCR和Western Blot技术检测周期性张应力作用下半胱天冬氨酸蛋白酶9的mRNA和蛋白含量变化。 结果与结论：倒置相差显微镜观察结果显示成肌细胞施加周期性张应力后贴壁生长情况良好,细胞无变性并且脱落率极低,说明成功构建了成肌细胞体外培养-力学刺激模型。RT-PCR和Western Blot检测结果显示,随着加力时间的延长,半胱天冬氨酸蛋白酶9 mRNA含量和活化型半胱天冬氨酸蛋白酶9的蛋白含量均显著增加,而半胱天冬氨酸蛋白酶9前体蛋白含量随着加力时间的延长均显著降低。可见半胱天冬氨酸蛋白酶9参与了周期性张应力作用下的力学信号传导。     

微电流脉冲体外诱导神经干细胞增殖分化的研究

目的探讨微电流脉冲对神经干细胞体外增殖分化的诱导作用。方法采用联合培养和微电流脉冲技术改变神经干细胞生长的微环境,通过免疫细胞化学技术及电子显微镜技术观察神经干细胞增殖分化情况。结果骨骼肌成肌细胞及微电流脉冲均可诱导神经干细胞分化(细胞ChAT阳性率分别为5.90%和6.48%),与神经干细胞自然分化组相比差异显著(细胞ChAT阳性率为4.03%)。结论微电流脉冲对神经干细胞的体外增殖分化具有一定的诱导作用。