HIV-1 env蛋白的制备活性鉴定与快速检测方法的建立

目的 制备具有生物活性的HIV-1 env蛋白,利用量子点的特殊光学性能结合免疫分析技术,建立快速、简便的免疫凝集分析检测HIV-1 gp41抗体方法.方法 以HIV-1 env基因质粒为模板,采用体外快速翻译系统(RTS)线性模板试剂盒制备线性模板,用RTS100试剂盒合成env蛋白,用磁珠法纯化蛋白,用Western Blot方法鉴定蛋白活性.纯化后的HIV-1 env蛋白采用量子点标记,与样品液中的抗HIV-1 gp41抗体进行免疫反应,根据量子点的荧光信号的变化,定量检测样品液中抗gp41抗体的浓度.结果 体外快速翻译系统表达出相对分子量约为97KD的env蛋白;Westem blotting证实纯化后的蛋白具有生物活性,量子点标记的env蛋白与山羊抗HIV-1 gp41抗体发生了免疫凝集反应.使量子点发生荧光淬灭,荧光信号强度与抗体浓度呈负相关.结论 HIV-1 env蛋白可采用RTS系统进行大量表达,分离纯化后的env蛋白具有生物学活性,建立的量子点标记的免疫凝集反应方法检测HIV gp41结果准确,方法简便.     

EB病毒BHRF1基因聚合酶链反应扩增及其鉴定

目的：ＢＨＲＦ１的研究对于认识ＥＢＶ有关肿瘤和其它疾病的发病机理、寻找预防、治疗途径有十分重要的意义。方法：以Ｂ９５８细胞ＤＮＡ为模板，设计一对引物，用ＰＣＲ方法扩增ＢＨＲＦ１基因，用目的基因内的两个限制性内切酶位点进行酶切鉴定。结果：扩增产物长５９２ｂｐ，与预期结果一致，两个酶所切下的四个片段长度也与理想值相符。结论：本研究首次采用ＰＣＲ方法，成功地获得完整的ＥＢ病毒ＢＨＲＦ１基因，从而为该基因的进一步研究和应用奠定基础。     

乳腺癌特异基因1在乳腺癌表达的意义

目的 检测乳腺癌特异基因1(BCSG1)在乳腺癌中的表达，评价其表达与乳腺癌临床病理因素的相关性。方法 利用逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR法)检测28例乳腺癌、7例乳腺增生症及5例乳腺纤维瘤中BCSG1的表达。结果 28例乳腺癌中有BCSG1表达12例(42．9％)，其中Ⅲ／Ⅳ期乳腺癌的表达率为69.2％(9／13例)，乳腺良性病变中BCSG1无一例表达。BCSG1的表达与乳腺癌分期密切相关(P=0．02)，与患者年龄、月经、肿瘤部位以及雌激素受体、孕激素受体、核增殖抗原、C—erbB2的表达等无相关性。结论 BCSG1可能是与肿瘤恶性进展有关的肿瘤标记物，是乳腺癌发生过程中的中晚期事件，为判定乳腺癌预后的新指标。     

UHRF1基因在食管癌中的表达和意义

目的研究UHRF1基因在食管癌组织及癌旁正常组织中的表达及临床意义。方法对62例食管癌组织及癌旁正常组织应用半定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测其中UHRF1 mRNA表达水平;应用Westemblot法检测62例食管癌组织及对应癌旁正常组织中UHRF1蛋白的表达;同时分析UHRF1的表达与患者临床病理特征之间的关系。结果食管癌组织中UHRF1 mRNA的表达水平显著高于正常组织（P〈0.01）;Westemb10t结果显示在70.9%（44/62）的食管癌组织中UHRF1蛋白表达较癌旁正常组织高（P〈0.001）;统计分析结果发现,UHRF1蛋白及mRNA的表达与食管癌患者的淋巴结转移、浸润深度等均无显著性相关（P〉0.05）,而与食管癌的分化程度呈负相关（r=-0.176,P〈0.05）,分化程度越低者UHRF1表达越高,各不同分化组间UHRF1表达差异具有统计学意义（P=0.001）,UHRF1高表达患者的五年生存率较差。结论 UHRF1在食管癌组织中的表达量显著升高,而且与食管癌分化程度和患者预后相关,可能成为判断食管癌及预后的重要分子生物标志。     

TaqDNA聚合酶一步法获得TGF—β1基因片段的RT—PCR扩增产物

以组织细胞中提取的总ＲＮＡ为模板，加入ＴａｑＤＮＡ聚合酶和一对以ＴＧＦ－β１ｃＤＮＡ为模板设计的引物，经变性，退火，延伸共３０次循环后，可以得到ｃＤＮＡ为模板的扩增产物，实验证实ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有逆转录酶活性，用一步常规聚合酶锭反应即可获取逆转录聚合酶链反应的ＴＧＦ－β１４６８ｂｐ扩增产物。     

用cox1基因片段的PCR鉴别亚洲带绦虫和牛带绦虫

目的：用cox1基因片段的PCR技术对亚洲带绦虫和牛带绦虫的快速鉴别。方法：用亚洲带绦虫和牛带绦虫线粒体cox1基因片段的特异性引物以及带绦虫cox1基因片段的通用引物,对贵州省都匀地区和从江地区的带绦虫虫卵和节片DNA进行常规PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测和核酸序列测定,并用NC-BI Blast对扩增产物的核酸序列与NCBI数据库中带绦虫的cox1基因进行比对。结果：5株都匀带绦虫DNA样品经亚洲带绦虫cox1基因片段的特异性引物PCR,均扩增出约260 bp的产物,PCR产物的核酸序列与NCBI数据库中亚洲带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为100%;2株从江带绦虫的DNA样品用亚洲带绦虫特异性引物和牛带绦虫特异性引物的PCR均未见扩增产物,而通用引物PCR则扩增出约1 000 bp的产物,核酸序列与NCBI数据库中牛带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为99%,在牛带绦虫特异性引物的结合位点存在一个碱基差异。结论：常规PCR扩增特异性的cox1基因片段可快速鉴定亚洲带绦虫;从江牛带绦虫株的cox1基因特异性片段部分存在变异,导致与特异性引物结合能力的差异,可采用cox1基因通用引物PCR结合测序进行鉴定。     

乳腺癌扩增基因1表达与乳腺癌预后的相关性研究

目的探讨乳腺癌扩增基因1(amplified in breast cancer 1,AIB1)表达与乳腺癌预后的相关性。方法利用免疫组化的方法检测113例乳腺癌标本的AIB1表达,并整理临床资料,用SPSS 18.0软件进行单因素及多因素分析,研究AIB1表达是否与乳腺癌生存具有相关性。结果单因素分析显示,AIB1表达与腋窝淋巴结转移、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体-2(Her-2)表达、病理类型、绝经状态、生存时间均有相关性,差异有统计学意义(P<0.05);而与远处转移部位、是否三阴型无相关性,差异无统计学意义(P>0.05)。COX回归模型多因素分析结果显示,AIB1不是影响乳腺癌总生存的独立预后因素(OR=0.548,P=0.128),影响乳腺癌总生存的独立预后因素分别是远处转移部位的多少(OR=1.526,P=0.002)和腋窝淋巴结转移的数目(OR=1.813,P=0.034)。结论 AIB1表达与乳腺癌临床病理特征密切相关,检测AIB1蛋白表达情况有助于判断乳腺癌的预后。     

TaqDNA聚合酶一步法获得TGF-β_1基因片段的RT-PCR扩增产物

以组织细胞中提取的总ＲＮＡ为模板，加入ＴａｑＤＮＡ聚合酶和一对以ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ为模板设计的引物，经变性、退火、延伸共３０次循环后，可以得到以ｃＤＮＡ为模板的扩增产物。实验证实ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有逆转录酶活性，用一步常规聚合酶链反应即可获取逆转录聚合酶链反应的ＴＧＦβ１４６８ｂｐ扩增产物。     

Krev—1基因在白血病中表达的研究

Ｋｒｅｖ－１基因在白血病中表达的研究孟庆祥王立郝玉书王建祥卞寿庚薛艳萍晁恒军李克Ｋｒｅｖ－１ｃＤＮＡ是在恢复为贴壁生长的ｖ－Ｋ－ｒａｓ转化的ＮＩＨ３Ｔ３细胞中发现的，它可能是通过其产物ＳｍｇＰ２１拮抗ｒａｓ癌基因产物ｒａｓ－Ｐ２１的作用而发挥抑癌效应...     

D1S80座位的等位基因扩增片段长度多态性分析

目的：对天津地区１１２ 名无关个体的Ｄ１Ｓ８０ 基因座位进行了扩增片段长度多态性分析，检测其等位基因和基因频率。方法： 应用聚合酶链反应，小型聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染方法观察长度多态性。结果：发现了２６ 个等位基因，大小在３５５～７７１ｂｐ 之间，基因频率为０．００４５～０．１３８４，杂合度为７３％ 。７０ 种基因型，个人鉴别力为０．９８５。对６ 个家系２３ 名相关个体的分析结果符合孟德尔定律。结论： Ｄ１Ｓ８０ 基因座位个人鉴别力高，ＰＣＲ方法简便、灵敏，可在个人识别和亲子鉴定中发挥重要作用     

胃癌高表达基因erk的PCR扩增,克隆和鉴定

对在胃癌高表达的EPH家族基因erk胞外的配体结合区基因扩增及克隆．方法：从胃癌患者手术切除标本中提取RNA，反转录为cDNA，以计算机辅助分析设计并合成引物进行RT－PCR，并将扩增片段克隆入pUC19质粒，用酶切及PCR方法筛选鉴定阳性克隆．结果：RT－PCR扩增片段与设计相符，且特异性好，无非特异产物出现，表明所设计引物符合要求．酶切及巢式PCR、PCR－RFLP方法证明克隆片段正确插入pUC19的HindIII和BamHI位点，并将重组克隆命名为pGE42．结论；克隆的完成为进一步研究该基因在胃癌的发生中的作用，寻找其胞外配体及进行表达产物的细胞定位等工作打下基础．     

Amplification，cloning，sequencing and expression of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii isolated

Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅｍａｊｏｒｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎｏｆＴｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉｉｓｏｌａｔｅｄｉｎＣｈｉｎａ￥ＣｈｅｎＸｉａ...     

青年乳腺癌中同源异型盒基因A5表达的研究

目的：探讨青年乳腺癌组织中同源异型盒基因（HOX）A5mRNA及其蛋白表达,研究乳腺癌肿瘤组织临床病理参数与其关联性.方法：运用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real-time RT-PCR）技术检测120例青年乳腺癌（其中96例浸润性导管癌,原位癌16例、腺癌4例、硬癌4例）和96例青年乳腺良性病变中HOXA5mRNA表达,分析HOXA5基因表达强度与乳腺癌肿瘤原发灶组织临床病理参数间的相关性.结果：HOXA5 mRNA在乳腺癌肿瘤组织中相对表达量0.82 ～ 189.06,平均为20.69±29.15,乳腺良性病变中相对表达量5.84～80.72,平均为31.05±17.06;乳腺癌HOXA5mRNA表达显著低于乳腺良性病变（P＜0.01）.乳腺癌伴腋窝淋巴结转移阳性患者HOXA5mRNA表达强度较淋巴结未转移者显著降低（P＜0.01）.HOXA5mRNA表达与乳腺癌肿瘤原发灶大小、临床分期、组织学分型未见相关性（均P＞0.05）.结论：青年乳腺癌肿瘤原发灶组织细胞中HOXA5mRNA表达强度较乳腺良性病变组织显著下降.HOXA5mRNA表达明显降低与乳腺癌腋窝淋巴结癌转移关联性较大.     

人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆中国人的肥胖基因,并在大肠杆菌中高效表达人瘦素蛋白。方法 用RT-PCR从培养的中国人脂肪细胞提取的总RNA中扩增出肥胖基因,与TA载体连接后进行核酸序列测定,并将该基因定向克隆至高效表达质粒pBV220,在大肠杆菌中表达。结果 克隆出中国人肥胖基因,其cDNA序列与文献报道的一致,构建了重组质粒pBV220-OB,并成功地实现了人肥胖基因在大肠杆菌中的表达。结论 人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达,为进一步研究该基因在肥胖症及其相关疾病中的作用,以及在脂肪代谢与脂肪细胞分化中的调控机制奠定基础。     

人骨桥蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建人骨桥蛋白(hOPN)表达载体,体外表达及表达产物的纯化.方法培养人脐静脉内皮细胞,提取总RNA,反转录合成cDNA第一链,以此cDNA为模板经PCR合成插入片段,连接至载体pGEX-6P-1,转化到XL1-blue中进行诱导表达.表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,切下目的蛋白进行洗脱纯化.结果构建的表达载体经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA测序,证明所构建的质粒是pGEX-6P-OPN.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳发现该重组质粒经IPTG诱导后表达一种新的蛋白(表达量为16.7%),这种蛋白不存在于诱导后的pGEX-6P-1表达产物中,纯化后蛋白纯度为99%.结论成功构建了hOPN表达载体,并进行体外表达.     

VEGF、c-Met、MMP-9在大肠癌中的表达及意义

目的探讨VEGF、c-Met、MMP-9在大肠癌组织中的表达及意义。方法分别采用RT-PCR法、W estern印记法、免疫组织化学法测定MMP-9、VEGF、c-Met在大肠癌组织及旁边正常组织的表达情况。结果大肠癌组的MMP-9明显高于正常对照组,两组相比较有显著差异(p<0.05)。大肠癌组的VEGF W estern印记光密度值明显高于正常对照组,两组相比较有显著差异(p<0.05)。c-Met表达方面,正常对照组50例标本中,其阳性表达率为12.0%;大肠癌组50例标本中其阳性表达率为74.0%。比较两组的阳性表达率有显著差异(p<0.05)。结论VEGF、c-M et和MMP-9参与了大肠癌临床病情进展和发病机制。     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。     

肿瘤坏死因子凋亡相关配体基因的克隆和表达

目的：克隆、表达和鉴定肿瘤坏死因子凋亡相关配体(TRAIL)．方法：从培养的人外周血淋巴细胞中提取总RNA，经RT-PCR获得TRAIL基因．将该基因克隆到pGEM-Teasy载体中，测序鉴定．将TRAIL基因插入pBV220表达载体中，42℃诱导表达4～5h，进行SDS-PAGE分析．免疫印迹法鉴定TRAIL蛋白的表达．结果：DNA测序证明，获得了TRAIL基因，其序列与GenBank中报道序列完全一致．SDSPAGE分析表明，TRAIL蛋白获得高效表达，分子质量为17ku，表达量约占菌体总蛋白的300k，．免疫印迹法鉴定显示，该蛋白可与鼠抗人TRAIL mAb产生阳性反应．结论：成功克隆和表达了TRAIL基因．     

人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人核心蛋白聚糖（DCN）真核表达载体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。 方法：采用聚合酶链反应（PCR）扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体pcDNA3分别双酶切后进行连接,并转化入大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体。 结果：PCR获得与预期大小一致的、约1 000 bp的特异性DNA片段,PCR产物与表达载体经双酶切后连接,构建重组载体pcDNA-dec,经双酶切鉴定及测序证实,人DCN基因cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论：成功构建人DCN真核表达载体pcDNA-dec。