结核分枝杆菌优势蛋白PPE37重组载体的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ppe37基因的重组原核表达质粒,并将其转化到E.coli BL21中诱导表达。方法以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增ppe37基因,将其克隆至pEasyE2克隆载体中,构建pEasyE2-ppe37重组质粒。经双酶切后将ppe37基因片段亚克隆到pET30a载体中,构建重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE及WesternBlot对表达产物进行鉴定。结果 PCR法扩增出约1600bp的条带。重组质粒pEasyE2-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE37蛋白基因序列一致。重组原核表达质粒pET30a-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确。SDS-PAGE鉴定表达的组氨酸标签重组蛋白相对分子质量约为50KDa,Western blot验证重组蛋白可与抗组氨酸单抗发生特异性反应。结论成功构建结核分枝杆菌ppe37基因重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并成功诱导表达,为PPE37蛋白作为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。     

基于同源重组和反向PCR扩增技术构建BRD7溴区结构域缺失突变体

目的：利用同源重组和反向PCR扩增技术构建溴区包含蛋白7 (bromodomain-containing protein 7,BRD7)的溴区结构域(bromodomain)缺失的真核表达载体。方法：设计一对反向PCR引物,以预先构建好的pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7质粒为模板,利用高保真酶的高保真性和较长的延伸能力,反向扩增出BRD7溴区结构域缺失突变体(pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd)的线性DNA片段,然后转化大肠杆菌,利用大肠杆菌同源重组修复能力即可自身环化,而不需要经连接酶连接或其他处理即可得到pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd重组表达质粒,通过测序和Western印迹进一步对该缺失突变体的序列和蛋白质表达性能进行验证。结果：通过酶切鉴定、测序和Western印迹证实pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd构建成功。结论：利用PCR反向扩增和同源重组技术,可以简便快速地构建pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd突变体,实验成本较低,并且发现质粒模板浓度会影响载体的同源重组效率,这种改进的技术可广泛应用到基因突变体的构建。     

人可溶性增殖诱导配体cDNA突变体的设计与构建

目的构建6种人可溶性增殖诱导配体(soluble a proliferation-inducing ligand, sAPRIL)cDNA突变体.方法采用PCR将可溶性增殖诱导配体(sAPRIL)cDNA进行突变,并分别在其N端和C端连接TEL Th表位序列,插入到pQE80表达载体上,最后转化至DH5α感受态细胞.重组质粒经酶切鉴定后进行测序.结果经PCR扩增分别得到了对应于6种突变体的sAPRIL序列,酶切和测序证实成功构建了含HEL Th表位的sAPRIL cDNA突变体表达质粒.结论成功构建了6种sAPRIL cDNA突变体的表达质粒,为进一步进行sAPRIL 突变体cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础.     

pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体的构建

【目的】构建pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体,为研究帕金森病奠定基础。【方法】设计特异引物,PCR扩增α-synuclein cDNA并引入FLAG标签,克隆入pEGFP-N1质粒,对重组质粒进行酶切及测序,鉴定正确后转化Ecoh．DH5（大肠杆菌）,大量扩增重组质粒。试剂盒纯化重组质粒。用Lipofectamine^TM 2000将重组质粒转染2937细胞,Western blotting检测融合蛋白在细胞内的表达。【结果】pEGFP-N1-α-synuclein重组质粒构建成功,Westernblotting检测融合蛋白分子量为47kd,符合预期值。【结论】成功构建了人野生型α-synuclein与绿色荧光蛋白基因融合并加入FLAG标签的真核表达载体pEGFP-N1-α-svnuclein。     

日本七鳃鳗Lj-RGD3缺失突变体Lj-113人工合成序列的基因克隆与蛋白表达

目的 获得突变体Lj-113的基因重组蛋白,为其与野生型活性比较打下物质基础.方法 对日本七鳃鳗RGD缺失突变体Lj-113进行基因全序列人工合成,并以Nde I与Hind III为酶切位点构建于pET23b载体上,获得阳性基因重组质粒pET23b-Lj113.CaCl2法将重组质粒转化入大肠杆菌BL21表达菌中,对其...     

嗜肺军团菌热休克蛋白60基因在大肠杆菌中的表达

目的 探讨大肠杆菌中表达嗜肺军团菌的热休克蛋白60（HSP60）的表达。方法 利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增嗜肺军团菌HSP60基因，将其定向插入载体pUC18构建重组原核表达质粒，重组质粒转化到大肠杆菌JM109后IPTG诱导表达。并对其表达产物进行SDS-PAGE和Westem-blotting分析。结果 重组质粒在大肠杆菌中成功表达，可被抗军团菌抗血清识别。结论 HSP60基因可在大肠杆菌中表达。并有免疫原性。     

HBx基因缺失型突变体HBx-d382与HBx-d431原核表达载体的构建和鉴定

目的为探讨HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431在临床上应用的价值,构建HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431原核表达载体。方法以pGM-T/HBx-d382和pGM-T/HBx-d431质粒为模板,PCR扩增含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的HBx基因片段。HBx基因PCR扩增产物与载体pET-28a(+)经双酶切、连接,形成重组DNA后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经卡那霉素筛选、酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组HBx基因缺失型突变体原核表达载体。结果成功构建了重组pET-28a(+)/HBx-d382和pET-28a(+)HBx-d431原核表达载体,重组前后HBx基因片段序列一致。结论pET-28a(+)/HBx-d382和pET-28a(+)/HBx-d431原核表达载体构建成功,为HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431蛋白的免疫原性和临床应用的研究奠定了基础。     

Bcr-Abl酪氨酸蛋白激酶域及其突变体的构建和表达

目的:制备Bcr-Abl激酶域及其突变体-His的重组蛋白. 方法:用PCR方法从含有Bcr-Abl全长的质粒pGD210中扩增出Bcr-Abl激酶域片段,再通过重组PCR技术获得激酶域的几个主要突变体(T315I,Y253F,E255K,E255V),测序正确后将其克隆到原核表达载体pET-32a中,构建表达激酶域片段和His标签融合表达的载体,IPTG诱导表达,得到的融合蛋白用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖进行亲和层析纯化. 结果:成功得到了Bcr-Abl激酶域及其突变体序列,经序列分析证实后将重组质粒转入BL-21进行表达. 结论: 通过重组PCR技术获得了野生型激酶域及其突变体蛋白. 融合蛋白表达在包涵体,占菌体总蛋白的70%以上. 经Ni-NTA镍珠纯化后,纯度在95%以上.     

死亡素在大肠杆菌中的融合表达

目的:构建死亡素基因重组表达载体,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中诱导表达。方法:人工合成死亡素基因片段,克隆于质粒pUC18,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性菌落,提取重组质粒双酶切,电泳回收目的基因,与经相同酶切的pGEx-4T-l连接构建重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌落,抽提质粒进行鉴定,测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。结果:重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定,证明目的基因正确插入。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示出现目的条带,与预期结果一致。结论:成功构建了死亡素基因的原核表达载体,并诱导表达出目的融合蛋白。     

高通量端粒酶抑制剂筛选模型融合表达载体的构建及转化

目的 构建含不同结构域的人端粒酶逆转录酶(hTERT)酵母三杂交系统融合蛋白表达载体并转化酵母.方法 采用PCR法从pCLXSN-hTERT质粒中提取不同的hTERT cDNA片段,纯化分离定向克隆到pYESTrp3质粒,构建包含不同hTERT蛋白结构域的编码序列的重组质粒,转化大肠杆菌,经PCR、酶切、测序鉴定,将阳性重组质粒转化酵母菌,进行毒性和自激活检验.结果 经过测序验证,重组融合蛋白表达载体pYESTrp3-hTERT构建成功,转化酵母无毒性和自激活性.结论 成功构建能用于酵母三杂交系统的融合蛋白表达载体,可于酵母三杂交系统筛选端粒酶抑制剂及hTERT和hTR间的相互作用.     

Subcloning and high level expression of xylE gene coding for the catechol 2, 3 dioxygenase in E. coli

Itwasfoundin1974thattherewasaplasmidof115kbinPseudomonasputlda.Asthisplasmidencodesaseriesofenzymestodegradetolueneanditsderivativeswhichcanberecycledinecosystem,itiscalledTOLplasmidonwhichxylEgeneislocated.xylEgeneencodescatechol2,3aidioxygenase(catechol:oxygen2,3--oxidoreductase,EC1.13.11.2),theoptimaltemperatureforreactionbeing37"CLij,wherecatechol2,3--dioxygenasecanconvertcatecholintoyellow--colored2--hydroxymuconicsemialdehyde.Becauseitsassayissensitive,rapidandinexpensive,xylEgenecan…     

布鲁氏菌猪种标准株外膜蛋白OMP25的原核表达

目的克隆布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因并构建基因的原核表达系统。方法用聚合酶链反应技术扩增得到布鲁氏菌基因组，得Omp25基因片段，T—A克隆后测定核苷酸序列，将目的基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切和DNA测序测定，将构建的重组质粒转化大肠杆菌（E．coli HB101，TOP10），经IPTG诱导后，用SDS—PAGE检测重组蛋白rOrap25表达情况。结果经DNA测序显示Omp25DNA序列和插入位点正确，成功构建了重组质粒DGEX-4T-1-Omp25，经IPTG诱导，特异性表达出以包涵体形式存在48kDa的Omp25融合蛋白。结论制备、克隆了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因片段，并在大肠杆菌中表达出Omp25融合蛋白。     

结核分枝杆菌耐药性相关膜蛋白MmpL6的表达与纯化

目的 构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL6(Rv1557)表达载体,在大肠杆菌E. coli中诱导MmpL6蛋白高表达并进行纯化.方法 以结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段,构建pET21b-MmpL6表达载体将表达载体转化至大肠杆菌中,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,并针对不同表达菌株、温度进行优化,获取最优表达条件.采用Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤色谱纯化目标蛋白.结果 成功构建pET21b-MmpL6重组表达质粒,经 IPTG诱导后,在Rosetta菌株中25 ℃条件下获得最高表达量.结论 成功表达并纯化了 MmpL6蛋白,为该蛋白后续的结构与功能研究奠定了基础.     

结核分枝杆菌复活促进因子B的原核表达、鉴定和纯化

目的:构建结核分枝杆菌复活促进因子B(RpfB)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfB基因(1089bp),然后用双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a( )载体连接,转入大肠杆菌Top10;阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定.测序正确后,将重组质粒转化到的大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了RpfB蛋白;利用Western-blot法对表达蛋白进行鉴定,最后对目的蛋白进行纯化.结果:双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致.经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现61KDa处有特异性蛋白条带.结论:成功克隆并构建了RpfB基因的重组表达质粒pET32a( )-RpfBv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础.     

耐辐射奇球菌超氧化物歧化酶基因的克隆和表达

目的 构建耐辐射奇球菌(D．rdiodurans)锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因的原核表达重组子,并在E．coli BL21(DE3)中表达。方法 用PCR方法自D.radiodurans基因组中扩增Mn-SOD目的片段。将该基因与原核表达质粒载体pET-30a( )连接,构建重组质粒pET-SOD,并转化表达宿主菌E．coli BL21(DE3)。用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组SOD蛋白表达,SDS-PAGE分析表达产物。结果 获得了D．radiodurans-Mn-SOD基因的pET原核表达重组质粒,该质粒经IPTG诱导能在E．coli BL21(DE3)中高效表达目的蛋白,蛋白活性可达51800u／g湿菌体。结论 成功构建了原核表达重组质粒pET-SOD,实现了SOD在原核细胞中的高效表达,表达产物活性较高,为重组D．radiodurans Mn-SOD的进一步研究和应用奠定了基础。     

表皮生长因子受体胞外区的原核表达和鉴定

目的 克隆表皮生长因子受体(EGFR)胞外区段基因序列(EGFR ECD),构建重组融合表达载体.方法 采用常规PCR方法 扩增EGFR的胞外区DNA序列,并将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1/EGFRECD,转化BL21(DE3)宿主菌;采用Sal Ⅰ和Not Ⅰ双酶切和序列分析鉴定插入序列的正确性:并用IPTG诱导工程菌,SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达.结果 双酶切鉴定表明,EGFR胞外区序列已经正确克隆到GST融合表达载体中,测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致.SDS-PAGE电泳显示,融合蛋白在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-EGFRECD的表达量占菌体总蛋白的12%左右.经Western blotting分析证实,重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别.结论 本试验成功克隆了EGFR胞外区DNA序列,构建了融合表达载体,并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFR功能及免疫学研究.     

人PRX3原核表达质粒的构建及表达

目的 构建人Peroxiredoxin 3（PRx3）原核表达质粒，并在大肠杆菌中进行表达。方法 采用基因工程技术将PRX3编码序列插入原核表达质粒载体pET-30（a），再将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，并对表达产物进行SDS—PAGE分析。结果 酶切鉴定和DNA测序证实人PRX3编码序列全长正确地插入表达质粒中，序列与GenBank报道的一致；重组PRX3在大肠杆菌获得高效表达，且易形成包涵体。结论 人PRX3原核表达质粒构建成功，并能在大肠杆菌中高效表达，为后续研究奠定了良好基础。     

GST-SRY融合蛋白原核表达和纯化

目的 构建GST-SRY融合蛋白原核表达载体, 在E.coli中诱导其表达, 并进行纯化.方法 PCR扩增SRY基因, 将SRY基因插入原核表达载体p GEX-6P-1, 经酶切和测序验证后, p GEX-6p-1-SRY转化到原核表达菌株E.coli Rosetta DE3, IPTG诱导表达GST-SRY融合蛋白, 用GST标签纯化树脂对其进行纯化.结果 经双酶切和测序证实p GEX-6P-1-SRY构建正确.重组质粒转化到Rosetta DE3经IPTG诱导后表达了分子质量单位约为49 KD的重组蛋白.结论 p GEX-6P-1-SRY原核表达载体构建成功, SRY蛋白成功诱导表达并纯化, 为今后深入研究SRY蛋白的功能奠定了实验基础.     

A型流感病毒株A/Henan/703/2001(H3N2)核蛋白部分序列的原核表达

目的构建A型流感病毒核蛋白（NP）基因部分序列的原核表达质粒。并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法采用PCB方法扩增NP基因部分序列,并定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中。转化大肠杆菌BL21．将阳性菌落经IPTG诱导目的基因融合蛋白的表达。结果扩增到NP基因部分序列,构建成重组表达质粒pGEX—S NP,并在大肠杆菌中进行了表达。结论成功构建A型流感病毒NP部分基因序列的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了目的基因融合蛋白。