PI3K/AKT信号通路在TGFβ1致人腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路在转化生长因子β1(TGFβ1)体外诱导的人腹膜间皮细胞(HPMC)上皮-间质细胞转分化(EMT)过程中的作用。方法从人腹膜组织中分离和培养人原代腹膜间皮细胞。观察TGFβ1对人腹膜间皮细胞Akt磷酸化的影响,在不同时间点检测p-Akt的表达水平。采用免疫印迹方法检测应用PI3K特异性抑制剂Wortmannin对TGFβ1诱导后细胞内p-Akt、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏附蛋白(E-Cadherin)表达的影响。结果10ng/mLTGFβ1刺激HPMC0.5h后p-Akt水平开始升高,1h后达到顶峰,2h后逐渐减弱。TGFβ1诱导HPMC48h后α-SMA表达显著升高,E-cadherin表达显著下降;同时加用Wortmannin则p-Akt、α-SMA表达明显抑制。结论PI3K/Akt信号系统参与TGFβ1介导的人腹膜间皮细胞EMT过程,提示对其通路的抑制可有效阻止TGFβ1介导的腹膜纤维化。     

PI3K/AKT信号通路在TGFβ11致人腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路在转化生长因子BI(TGFBl)体外诱导的人腹膜间皮细胞(HPMC)上皮-间质细胞转分化(EMT)过程中的作用.方法 从人腹膜组织中分离和培养人原代腹膜间皮细胞.观察TGFβ1 对人腹膜问皮细胞Akt磷酸化的影响,在不同时间点检测p-Akt的表达水平.采用免疫印迹方法检测应用PI3K特异性抑制剂Wortmannin对TGFβ1诱导后细胞内p-Akt、a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和E-钙黏附蛋白(E-Cadherin)表达的影响.结果 10ng/mL TGFβ1刺激HPMC 0.5 h后P-Akt水平开始升高,1 h后达到顶峰,2 h后逐渐减弱.TGFβ1诱导HPMC 48 h后a-SMA表达显著升高,E-cadhetin表达显著下降;同时加用Wortmannin则p-Akt、a-SMA表达明显抑制.结论 PI3K/Akt信号系统参与TGF β 1介导的人腹膜间皮细胞EMT过程,提示对其通路的抑制可有效阻止TGFβ1介导的腹膜纤维化.     

红细胞生成素对肾小管上皮-间充质细胞转化的抑制作用及其与VEGF表达变化的关系

目的探讨红细胞生成素（rHuEPO）对人肾小管上皮细胞（HKC）上皮-间充质细胞转化（EMT）的作用及其与该细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达变化的关系。方法体外培养HKC,以未处理的HKC为阴性对照,以8ng/ml的转化生长因子-β1（TGF-β1）处理的HKC为阳性对照,以不同浓度（0.1、1.0、10、50、100IU/ml）的rHuEPO与8ng/ml的TGF-β1共同处理HKC,或在不同时间（-24、0、12、24、36h）用同一浓度rHuEPO（100IU/ml）对8ng/ml的TGF-β1处理的HKC进行干预。应用RT-PCR方法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和VEGFmRNA转录水平,应用免疫印迹方法检测α-SMA、E钙黏蛋白以及VEGF的蛋白表达水平。结果rHuEPO以剂量和时间依赖的方式抑制TGF-β1诱导的HKCα-SMAmRNA和蛋白的表达（P〈0.05或P〈0.01）,保护性上调TGF-β1抑制的HKC细胞E钙黏蛋白的表达（P〈0.05或P〈0.01）;同时上调TGF-β1抑制的HKC细胞VEGFmRNA和蛋白的表达（P〈0.05或P〈0.01）。结论rHuEPO对TGF-β1诱导的EMT具有一定的抑制作用,并具剂量-时间依赖性;该作用可能与rHuEPO上调肾小管上皮细胞VEGF的表达有关。     

PTEN抑制增生性瘢痕成纤维细胞转分化作用及其机制

目的观察染色体10上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)编码蛋白对TGF-β1刺激下瘢痕成纤维细胞转分化的抑制作用及其机制。方法用重组PTEN腺病毒转染体外培养的人瘢痕成纤维细胞,倒置荧光显微镜检测PTEN转染组及空载体转染组绿色荧光蛋白表达;将实验分为对照组、PTEN转染组、空载体转染组、TGF-β1刺激组(给予TGF-β1刺激)、PTEN+TGF-β1组(PTEN基因转染后给予TGF-β1刺激)、空载体+TGF-β1组(空载体转染后给予TGF-β1刺激),RT-PCR和Western blot分别检测对照组、PTEN转染组、空载体转染组中PTEN mRNA和蛋白表达;Western blot检测各组中α-SMA、Akt、p-Akt表达水平。结果 PTEN基因转染瘢痕成纤维细胞36h后可见明显绿色荧光蛋白表达,PTEN转染组PTEN mRNA及蛋白的表达明显升高,与对照组及空载体转染组相比,差异有统计学意义(P<0.05),而p-Akt和α-SMA的表达明显下降(P<0.05);TGF-β1组α-SMA表达较对照组明显升高,同时伴有p-Akt表达上升,与对照组、PTEN转染组、PTEN+TGF-β1组相比,差异均有统计学意义(P<0.01);空载体转染组与对照组相比,p-Akt、α-SMA蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05);空载体+TGF-β1组与TGF-β1刺激组相比,p-Akt、α-SMA蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。各组细胞的Akt表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 TGF-β1可促进PI3K/Akt通路活化,使瘢痕成纤维细胞α-SMA表达升高,促进其转分化;空载体转染对p-Akt、α-SMA的表达无明显影响,高表达PTEN可使瘢痕成纤维细胞α-SMA的表达明显降低,并且可拮抗TGF-β1对瘢痕成纤维细胞的转分化作用,其机制可能是抑制PI3K/Akt通路活化。     

PI3-K的激活在TGF-β1诱导GMC基质分泌过程中的作用

目的探讨磷脂酰肌醇3-激酶的激活在转化生长因子β1体外诱导人肾小球系膜细胞基质过度分泌中的作用及意义。方法GMCs体外培养,刺激1h后检测p-Akt及总Akt水平,48h检测FN的表达。结果Westernblot结果显示,加入TGF-β1刺激后磷酸化Akt水平显著升高,并且随着TGF-β1浓度升高而增加,人GMCs中p-Akt水平也逐渐升高,同时加入等浓度的Wortmannin(10nmol/L)后,磷酸化Akt水平较单纯加入TGF-β1显著减弱,且差异有显著性(P<0.05),但与正常对照组比较差异无显著性(P>0.05),刺激GMCs24h,TGF-β1刺激组蛋白质GMCs分泌的FN量明显增加。结论PI3-K也可被TGF-β1激活,并且在由TGF-β1所引起的GMCs基质过度分泌过程中发挥重要作用。     

高表达PTEN抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化

目的 研究PTEN高表达对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的抑制及其信号传导机制.方法 脂质体介导含人全长PTEN基因或空载体转染人肾小管上皮细胞(HKC细胞)48 h,倒置荧光显微镜检测PTEN转染组及空载体转染组绿色荧光蛋白表达;Western blot检测正常组、PTEN转染组、空载体转染组中PTEN蛋白表达;RT-PCR检测3组中PTEN mRNA表达.然后将实验分为正常组、TGF-β1刺激组(给予TGF-β1刺激)、PTEN+TGF-β1组(PTEN基因转染后给予TGF-β1刺激)、空载体+TGF-β1组(空载体转染后给予TGF-β1刺激),Western blot检测各组细胞E-cad-herin、α-SMA、Akt、p-Akt表达水平.结果 FTEN基因及空载体转染HKC细胞48 h后可见明显绿色荧光蛋白表达;PTEN转染组PTEN蛋白及PTEN mRNA表达较正常组及空载体转染组细胞均显著上升(均P<0.05).在正常组、TGF-β1刺激组、PTEN+TGF-β1组、空载体+TGF-β1组中,TGF-β1刺激组及空载体+TGF-β1组较正常组E-cadherin表达明显下降(均P<0.05),而a-SMA及p-Akt表达显著上升(均P<0.05);PTEN+TGF-β1组较TGF-β1刺激组及空载体+TGF-β1组a-SMA及p-Akt表达明显下降(均P<0.05).而E-cadherin表达上升(均P<0.05);各组细胞Akt表达水平差异不明显(P>0.05).结论 PTEN通过阻止PI3K/Akt通路活化而抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化.     

趋化因子受体CCR7介导树突状细胞抗凋亡机制研究

目的研究趋化因子受体CCR7对成熟树突状细胞（DCs）的抗凋亡作用，并对其机制进行探讨。方法体外培养大鼠骨髓来源DCs，脂多糖诱导成熟。加入CCR7配体CCL21进行刺激，以不加CCL21为对照组，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot检测磷酸化Akt、Akt蛋白表达，应用Wortmannin抑制PI3K/Akt信号通路进一步观察磷酸化Akt蛋白表达和细胞凋亡的变化。结果在CCL21的作用下，DCs细胞凋亡率明显低于对照组，而磷酸化Akt蛋白表达却明显增高（P〈0.05）。DCs经PI3K抑制剂预处理后，CCR7介导的Akt蛋白磷酸化及抗凋亡作用被阻断。结论在CCL21作用下，CCR7介导了抗凋亡效应，其对DCs的凋亡调控通过PI3K/Akt信号通路发挥作用。     

结缔组织生长因子对肾小管上皮细胞转分化的调节机制

目的 观察结缔组织生长因子（CTGF）对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的直接影响,并探讨阻断内源性CTGF表达对转化生长因子- β1（TGF-β）诱导人肾小管上皮细胞转分化的干预效果,以阐明CTGF在肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法 体外培养人近曲小管上皮细胞（HKC）。在观察CTGF对HKC的直接作用时,将HKC细胞分为三组：（1）对照组;（2）小剂量CTGF组：培养液中加入重组人CTGF（rhCTGF）,终浓度为2．5μg／L;（3）大剂量CTGF组：rhCTGF终浓度为5．0μg／L。在探讨CTGF在TGF-β诱导HKC转分化中的作用时,将细胞分为4组：（1）正常对照组;（2）TGF-β刺激组（培养液加入重组人TGF-β1蛋白,浓度为10．0μg／L）;（3）TGF-β1＋CTGF正义寡核苷酸（ODN）组（先以CTGF正义ODN转染HKC,再加TGF-β1刺激）;（4）TGF-β1＋CTGF反义ODN组（先以CTGF反义ODN转染HKC,再加TGF-β1刺激）。用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定HKC α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）和Ⅳ型胶原（col Ⅳ）mRNA水平的变化;间接免疫荧光方法检测HKC胞浆内α—SMA的表达;流式细胞仪检测α—SMA阳性细胞百分率;ELISA方法测定培养液上清中col Ⅳ的浓度。结果 不同浓度rhCTGF作用于HKC24h后,α-SMAmRNA水平显著升高（P〈0．01）,而colⅣmRNA表达水平明显下降（均P〈0．01）;刺激48h后,胞浆α—SMA表达明显增强,流式细胞仪测得三组细胞α-SMA阳性百分率依次为：2．4％、38．9％、65．5％（P〈0．01）;ELISA结果表明,rhCTGF抑制了colⅣ的分泌（P〈0．01）。TGF-β1可诱导HKC高表达CTGF和α-SMA。转染后6h,CTGF反义ODN可显著抑制HKC表达CTGF和α-SMA mRNA（P〈0．01）。转染后48h,CTGF反义ODN可明显抑制胞内α-SMA蛋白合成。结论 CTGF在体外能刺激肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞（MyoF）转分化,而CTGF反义ODN的导人可有效抑制TGF-β1诱导的转分化过程。因此,CTGF可能是调节肾小管上皮细胞转分化的重要因子。     

MCP-1诱导的肾小管上皮-间充质细胞转化与整合素连接激酶表达变化的关系

目的探讨单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）诱导体外培养的肾小管上皮细胞转分化的作用及其与细胞整合素连接激酶（ILK）表达变化的关系。方法体外培养的HKC,以未处理的HKC为阴性对照,以8ng／mlTGF-81处理的HKC为阳性对照,以不同浓度的MCP-1（0．1、1．0、10、100ng／m1）处理细胞,或以同一浓度的MCP-1（1ng／ml）在不同时间点（0h、12h、24h、36h、48h、72h）处理细胞。用半定量RT-PCR方法测定各组HKC细胞α—SMA mRNA的表达,Western blot方法测定各组HKC细胞α-SMA及ILK表达。在上述实验基础上进一步观察MEK抑制剂（PD98059,10μmol／L）,p38MAPK抑制剂（SB203580,5／μmol／L）和ROCK抑制剂（Y27632,500μmol／L）对HKC细胞ILK表达的影响。结果MCP-1（0．1、1．0ng／m1）作用后HKC细胞α-SMA mRNA和α—SMA、ILK蛋白表达显著高于阴性对照组（P＜0．01）,但低于阳性对照组（P＜0．01）;其中以1．0ng／ml MCP-1组作用后α—SMAmRNA和α—SMA、ILK蛋白表达水平增高更为显著（P＜1．001）。1．0ng／ml MCP-1作用后细胞α-SMA mRNA和α-SMA、ILK蛋白表达在0-48h内逐渐增加,48h达最高峰（P＜0．01）,72h时呈下降趋势。分别加入阻断剂PD98059、SB203580和Y27632后,HKC细胞ILK蛋白表达水平与MCP-1单独作用无显著性差异（P＞0．05）。结论MCP-1可诱导肾小管上皮细胞转分化并呈时间浓度依赖性,该作用可能与MCP-1上调ILK的表达有关;本研究未发现MCP-1上调ILK的信号传导途径与MEK1、p38MAPK、ROCK途径有关。     

TGF-β1对MSCs体外模拟缺血性损伤的保护作用

目的 观察转化生长因子β1(TGF-β1)对骨髓间充质干细胞(MSCs)体外模拟缺血性损伤的保护作用.方法 采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠MSCs,对培养第3代的MSCs进行鉴定;用1、2、5 μg/L 的TGF-β1分别预处理细胞8 h,然后用血清剥夺和低氧(SOD)处理建立MSCs体外模拟缺血性损伤模型,通过流式细胞术评价MSCs的凋亡及存活情况;用Western blot方法 检测2 μg/L的TGF-β1对Akt和p-Akt表达的影响.结果 密度梯度离心结合贴壁法能有效分离、纯化大鼠MSCs,免疫荧光检测显示培养的细胞CD29表达阳性,而CD34表达阴性.用2 μg/L的TGF-β1预处理MSCs后,可抑制SOD诱导的细胞凋亡,其早期凋亡率和中晚期凋亡率均明显下降,与凋亡模型组相比差异具有显著性(F=199.77、232.82,P<0.05),而PI3K抑制剂Wortmannin能明显抑制TGF-β1的抗凋亡作用.2 μg/L的TGF-β1可升高p-Akt的表达,p-Akt在8 h达到高峰,p-Akt/Akt显著增高,和其他时间点相比差异具有显著性(F=6.306,P<0.05).结论 TGF-β1对SOD诱导MSCs的凋亡具有抑制作用,其抗凋亡作用是通过激活PI3K/Akt实现的.     

骨桥蛋白通过PI3K/Akt信号通路激活胰腺星形细胞

目的探讨骨桥蛋白（OPN）对胰腺星形细胞（PSC）的影响及其机制。方法构建OPN慢病毒过表达载体（OPN-O/E）并转染PSC,设置空载体转染细胞作为对照组。分别采用CCK-8实验和Transwell小室检测OPN-O/E转染及OPN-O/E转染联合Akt抑制剂LY294002（10 μmol/L、50 μmol/L）处理后PSC增殖活性和趋化活性,采用蛋白质印迹法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达。结果 OPN-O/E转染上调OPN表达后,PSC增殖活性增高、趋化活性增高,细胞中磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化Akt（p-Akt）和α-SMA表达水平均增高,与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;细胞中PI3K和Akt表达水平与对照组相比差异均无统计学意义（P均>0.05）。使用10 μmol/L或50 μmol/L Akt抑制剂LY294002干预后,细胞中α-SMA及p-Akt的表达被抑制,与OPN-O/E组相比差异均有统计学意义（P均<0.01）,Akt的表达无明显变化。结论 OPN通过PI3K/Akt信号通路介导PSC活化,活化后PSC的增殖及趋化活性也增强。     

银杏叶提取物对TGF β1诱导α-SMA和Ⅰ型胶原表达的抑制作用

目的探讨银杏叶提取物(EGb)对转化生长因子(TGF-β1)诱导肾纤维化相关细胞因子及细胞外基质表达的影响。方法体外培养的人肾小管上皮细胞(HKC)分为正常对照组(无药物处理)、单纯TGF-β1(8 ng/mL)处理组和TGF-β1(8 ng/mL)与不同浓度EGb(25、50、100、150 mg/L)共刺激组。各组HKC经不同处理72 h后,细胞免疫组化ABC法检测α-SMA表达,实时定量PCR和Western blotting法检测I型胶原表达。结果与正常对照组比较,单纯TGF-β1处理组HKC中α-SMA和Ⅰ型胶原表达明显上调;与单纯TGF-β1处理组比较,TGF-β1与不同浓度EGb共刺激组HKC中α-SMA和I型胶原表达呈剂量依赖性减少。结论银杏叶提取物可抑制TGF-β1诱导的HKC中α-SMA和I型胶原表达,其机制可能与银杏叶提取物抑制肾小管上皮细胞转分化发生有关。     

内源性结缔组织生长因子介导转化生长因子β1对肾小管上皮细胞的转分化效应

目的：探讨内源性结缔组织生长因子（CTGF）在人肾小管上皮细胞（HK2）转分化过程中的作用。方法：将HK2细胞分为4组：对照组;转化生长因子β1（TGF-β1）5ng／ml刺激组;TGF-β1 5ng／ml刺激4-CTGF反义0DN 3 mmol／L干预组;TGF-β1 5ng／ml刺激＋CTGF正义ODN3mmol/L对照组。用倒置显微镜观察各组细胞的形态学变化,用RT-PCR检测各组细胞中CTGF、上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤连蛋白（FN）mRNA表达变化。结果：TGF-β1刺激使HK2细胞形态由椭圆形转为梭形;下调E-cadherinmRNA表达。上调CTGF、α-SMA和FNmRNA表达．且CTGFmRNA表达变化在时间上早于E-cadherin、α-SMA和FNmRNA表达变化;CTGF反义ODN可对抗TGF-β1引起的细胞形态学改变和E-cadherin、CTGF、α-SMA、FiNmRNA表达变化效应。结论：内源性CTGF介导了TGF-β1对HK2细胞的转分化效应。     

糖基化终产物通过PI3k/Akt信号通路诱导肾小管上皮细胞转分化

目的:观察PI3k/Akt信号通路在糖基化终产物(AGEs)诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法:大鼠肾小管上皮细胞随机分为对照组(C组),糖基化终产物组(D组)和PI3K抑制剂组(W组)。D、W组加入AGE-BSA(100mg·L-1);W组在AGE-BSA处理前用PI3K抑制剂预处理1h。加AGE-BSA1,6,12,24,48h时用免疫细胞化学和Westernblot检测α-SMA和p-Akt的表达。结果:D组α-SMA在6h时出现阳性表达,24h达高峰;p-Akt在1h出现阳性表达,12h达高峰,48h开始下降。结论:PI3k/Akt信号转导系统触发了糖基化终产物诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化。     

高迁移率蛋白B1对血管平滑肌细胞迁移的影响及分子机制研究

目的：探讨高迁移率蛋白B1（HMGB1）对血管平滑肌细胞（VSMCs）迁移的影响及 TLR4依赖的 TLR4／PI3K／Akt信号通路介导的分子机制。方法体外分离培养大鼠胸主动脉VSMCs ,采用不同浓度 HMGB1（0．1～1000．0 ng ／mL）处理,分为对照组（未经任何处理）、HMGB1组、HMGB1＋ TLR4 siRNA转染组、Control siRNA转染组和磷脂酰肌醇3‐激酶（PI3K）抑制剂（LY294002）干预组,观察各组细胞活性及 HMGB1对 VSMCs 迁移的影响;实时定量 RT‐PCR与 Western blot 分别检测TLR4、Akt、p‐Akt、PI3K mRNA和蛋白的表达;ELISA测定PI3K的活性。结果 HMGB1（0．1～1000．0 ng／mL）呈剂量依赖性促进VSMCs迁移（P＜ 0．05）;经细胞活性测定,HMGB1在使用的浓度范围内对 VSMCs未造成细胞毒性作用（P＜ 0．05）;HMGB1（100 ng／mL）处理的 VSMCs细胞组 PI3K 活性及 Akt磷酸化水平明显增加（P＜ 0．05）;经 TLR4 siRNA 转染发现, HMGB1引起的VSMCs迁移明显减弱（P＜0．05）,同样在PI3k抑制剂干预组,PI3K／Akt途径活化和HMGB1介导的VSMCs迁移也被明显抑制（P＜0．05）。结论 HMGB1呈剂量依赖性促进VSMCs迁移,TLR4依赖的 TLR4／PI3K／Akt信号通路参与了此过程,提示以TLR4依赖的PI3K／Akt途径为靶点,可为阻塞性血管疾病的治疗提供新思路。     

片仔癀通过PI3K/Akt信号通路诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡

目的探讨片仔癀诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）途径的关系。方法采用不同浓度片仔癀（0.4，0.8，1.2mg/mL）作用U2OS细胞，采用MTT法检测片仔癀对U2OS细胞增殖的影响；Hoechst 333258染色观察细胞凋亡情况；Western blot检测PI3K调节亚基p85α（PI3K p85α）、磷酸化PI3K调节亚基p85α（p-PI3K p85α）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、核多聚（ADP-核酶）聚合酶（PARP）、裂解PARP（Cleaved PARP）等PI3K/Akt途径相关蛋白的表达。结果片仔癀可明显抑制U2OS细胞的增殖，呈时间和浓度依赖性，诱导U2OS细胞凋亡；Western blot显示p-PI3K p85α、p-Akt蛋白表达明显下调，Cleaved PARP表达量增加，与空白对照组相比有明显差异（P<0.05）。结论片仔癀可通过抑制PI3K/Akt信号途径PI3K p85α、Akt磷酸化，促进PARP裂解，诱导骨肉瘤U2OS凋亡。     

RhoGDI2调控PI3K/Akt信号通路促进气道上皮间质转化研究

目的：探讨PI3K/Akt信号通路活化在RhoGDI2诱导的气道上皮-间质转化（EMT）中的作用。方法：体外培养人气道上皮细胞16HBE,通过质粒转染过表达RhoGDI2,然后加入PI3K抑制剂LY294002,荧光显微镜观察质粒转染后不同时间的细胞形态变化,评估转染效率。Western blot法检测RhoGDI2、EMT标记蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Snail）以及PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平。结果：细胞转染36小时后荧光表达量达到高峰,转染效率70%~80%。转染组RhoGDI2表达量明显高于正常组和空载组,证明转染成功（P<0.001）;转染组PI3K、Akt及p-Akt表达较正常组、空载组明显升高（P<0.001）,表明PI3K/Akt信号通路被激活。PI3K抑制组PI3K（P<0.01）、Akt（P<0.05）及p-Akt（P<0.01）表达量较转染组明显下降,说明PI3K/Akt信号通路被成功抑制。与正常组、空载组比较,转染组E-cadherin表达明显减少（P<0.001）,N-cadherin（P<0.01）、Snail（P<0.001）表达明显升高,差异均有统计学意义,表明RhoGDI2可以促进气道上皮细胞间质转化;与转染组比较,LY294002抑制组E-cadherin蛋白表达明显升高（P<0.001）,N-cadherin（P<0.05）、Snail（P<0.001）表达明显降低,差异均有统计学意义,表明阻断PI3K/Akt信号通路可有效控制EMT过程。结论：RhoGDI2可以通过调控PI3K/Akt信号通路促进气道上皮-间质转化。     

槲皮素诱导肝星状细胞凋亡:基于调控miR-146影响PI3K/Akt信号通路

目的 探讨槲皮素(Que)通过调控肝星状细胞内miR-146水平影响PI3K/Akt信号通路诱导细胞凋亡的作用机制。方法 以大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)为研究对象,设计实验分组：空白对照组、TGF-β组、TGF-β+Que-L(40μmol/L)、TGF-β+Que-M(60μmol/L)和TGF-β+Que-H(80μmol/L)为药物治疗部分;各组阴性对照组、miR-146模拟剂(mimic)和抑制剂(inhibitor)为细胞转染部分。CCK-8法检测不同浓度的Que对细胞抑制情况,选出低、中、高3个剂量浓度用于后续细胞实验;细胞凋亡流式细胞术检测Que对HSCs细胞凋亡的影响;RT-qPCR法检测HSC-T6细胞药物治疗以及细胞转染后miR-146、α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K和Akt mRNA表达情况;Western blot法检测以上各组中α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达情况;免疫荧光实验检测HSC-T6细胞药物治疗中α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达强弱。结果 CCK-8实验结果显示,相同时间...     

PI3K/Akt调控糖尿病冠状动脉平滑肌细胞BK通道的作用机制

目的：探讨PI3K/Akt对糖尿病冠状动脉平滑肌细胞BK通道的调节作用。方法：采用正常糖浓度（5 mmon/L）、高糖浓度（15 mmon/L）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）抑制剂GKT137831、PI3K抑制剂Wortmannin作用于人冠状动脉平滑肌细胞（human coronary artery smooth muscle cell,HCASMC）。以GKT137831喂饲链脲霉素（streptozocin,STZ）诱导的糖尿病大鼠,免疫印迹测定HCASMC、大鼠冠状动脉PI3K超家族DNA?Pkcs、Akt、p?Akt（S473）及BK?α亚基、BK?β1亚基的表达,2’,7’?二氯二氢荧光素二乙酸酯测定HCASMC及大鼠冠状动脉ROS表达。结果：高糖浓度下HCASMC及糖尿病大鼠冠状动脉ROS、DNA?Pkcs、Akt、p?Akt（S473）表达量增高,BK?β1表达量降低（P < 0.05）。GKT137831作用后的HCASMC及糖尿病大鼠冠状动脉中,ROS、DNA?Pkcs、Akt、p?Akt（S473）表达量降低,BK?β1表达量明显增高（P < 0.05）。Wortmannin作用后的HCASMC p?Akt（S473）表达量降低,BK?β1表达量明显增加（P < 0.05）。结论：PI3K/Akt通路参与糖尿病冠状动脉平滑肌细胞BK通道的调控。     

CTGF诱导的人胚肺成纤维细胞转分化中PI3K/Akt与p38MAPK磷酸化的关系

目的 探讨结缔组织生长因子(CTGF)诱导的人胚肺成纤维细胞(HFL-I)转分化中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路的活动状态以及相关性的研究.方法 将体外培养的HFL-I分成4组:(1)CTGF处理组(20 ng/ml);(2) LY294002(10 μmol/L)预处理60min,再行CTGF刺激(20 ng/ml):(3)SB203580 (10 μmol/L)预处理60 min,再行CTGF刺激(20 ng/ml); (4)LY294002(10 μmol/L)和SB203580(10 μmol/L)联合作用60 min,再加入CTGF(20 ng/ml).选取不同时相点,Western blot测定平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、p-Akt和Akt的蛋白表达:RT-PCR检测PI3K和p38MAPKmRNA表达.结果 与对照组相比,CTGF诱导15 min后p-Akt水平升高,30 min时达至顶峰(P＜0.01).CTGF诱导24h后α-SMA表达显著升高(P＜0.01),可被LY294002阻断.LY294002和SB203580单独或联合预处理后,显著抑制CTGF诱导的p-Akt活化(P＜0.01).结论 CTGF诱导的成纤维细胞-肌成纤维细胞转分化中有PI3K/Akt通路的激活,PI3K和p38MAPK均可以调节Akt的活性,其特异性抑制剂均可阻断Akt的磷酸化.