牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中融合表达,并鉴定、纯化其表达产物。方法克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建表达载体pET15b-FimA,转化大肠杆菌BL21（DE3）pLyS感受态细胞;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白,以抗6×His Tag单克隆抗体为一抗,Western blot鉴定、Co2+柱亲和层析纯化融合蛋白。结果克隆的FimA基因序列及插入表达载体中的FimA序列均与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后Western blot鉴定4.1×104处有目的蛋白表达;Co2+柱亲和层析法获得纯化的高浓度FimA蛋白。结论本实验成功构建了牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因的原核表达载体pET15b-FimA,并在大肠杆菌中获得成功表达和纯化,为进一步制备牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白单克隆抗体和研制开发预防牙周炎的亚单位蛋白疫苗奠定了实验基础。     

牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),并将其置于大肠杆菌中作融合表达.方法 利用PCR技术,克隆GAPDH,插入克隆载体pMD18-T中得到克隆重组子pMD18-T-GAPDH.克隆重组子与表达载体pET-32a双酶切后连接构建表达质粒pET-32a-GAPDH.重组原核表达质粒经酶切鉴定...     

牙龈卟啉单胞菌肽酰精氨酸脱亚氨酶的克隆与表达

目的:构建牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)克隆表达重组子,转化于大肠杆菌BL21中,并在最适宜条件下诱导表达。方法:以牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全基因组DNA为模板,利用PCR技术获得目的基因PAD,将扩增得到的PAD基因定向插入线性克隆载体PMD18-T Vector中,得到克隆重组子PMD18-T-PAD。经PCR和双酶切鉴定正确的克隆重组子PMD18-T-PAD与表达载体PET-28a经Xhol和Ncol双酶切后,在一定连接体系下,连接构建表达质粒PET-28a-PAD。鉴定正确的原核重组表达质粒PET-28a-PAD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,在不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及时间诱导下表达融合蛋白。以抗His Tag单克隆抗体为一抗,Western免疫印迹鉴定。结果:DNA测序结果表明,PAD与NCBI核酸数据库中收录的PAD序列同源性达100%;37℃,IPTG浓度为0.5mmol/L,250r/min振摇培养6h的诱导条件下,PAD可高效表达。结论:本实验成功构建了PAD的克隆表达重组子,并在大肠杆菌中表达了PAD蛋白,为进一步研究PAD的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关基因的克隆及表达纯化

目的 克隆牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）中负责c-di-AMP代谢的相关基因,并使其在大肠杆菌中正确表达及高效纯化。方法 通过聚合酶链反应（PCR）克隆牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三个基因,经过酶切后将目的基因片段与大肠杆菌表达质粒pET28a连接,分别构建出重组表达质粒pETpgn0523 pETpgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白,通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和鉴定。用镍离子金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化,BCA法检测目的蛋白的浓度。结果 目的基因pgn0523、pgn1187和pgn2003扩增产物条带与预期大小一致。重组表达质粒pET-pgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003及其PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证与预期大小相符,测序结果与GenBank中牙龈卟啉单胞菌ATCC33277国际标准菌株的基因序列100%一致。IPTG诱导后的菌体经SDS-PAGE检测得到3个大小分别为19.5×10³、39.9×10³、66.0×10³的蛋白质增强条带,与预期大小相符。镍离子金属亲和层析柱纯化得到的蛋白与预期目的蛋白分子量一致,BCA法测定目的蛋白的浓度分别为0.708、0.523和0.861 mg·mL^-1。结论 本研究成功克隆并表达纯化了牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关蛋白,得到了较高浓度和纯度的目的蛋白,为进一步探究牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP的生理功能及体内代谢途径奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因的克隆及表达纯化

目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因并使其在大肠杆菌中正确表达。方法利用PCR方法克隆牙龈卟啉单胞菌fimA基因,构建其原核表达质粒pT-BAD/fimA,获得其在大肠杆菌中的表达,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定重组蛋白。以不同质量浓度咪唑缓冲液（250、200、150、100、50 μmol·L-1）洗脱结合在His-tag纯化柱的目的蛋白,选择最佳洗脱质量浓度。结果克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列呈现99.9%同源性;诱导表达后可观察到相对分子量3.8×104的融合蛋白,经MALDI-TOF-MS检测进一步证实为FimA蛋白。100 μmol·L-1咪唑缓冲液洗脱得到的蛋白质纯度最高,其纯度为95%。结论本实验成功克隆了fimA基因,并获得在大肠杆菌中的正确表达,同时得到纯度较高的FimA蛋白,为后续研制增强免疫应答的高效牙周炎真核表达质粒奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因在大肠杆菌的融合表达

目的：克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因,并使其在大肠杆菌中融合表达。方法：利用PCR方法克隆fimA,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果：克隆基因测序结果与GenBank数据库中的序列呈现99．9％同源性;经诱导表达后可观察到Mr38kDa的融合蛋白。结论：成功克隆了fimA基因,并在大肠杆菌中表达了FimA蛋白,为后续研究奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌Hgp44基因的克隆表达与纯化

目的 克隆表达牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)牙龈素中黏附素区域的Hgp44基因,并纯化目的蛋白.方法 通过聚合酶链反应(PCR)和基因重组技术,克隆得到PgATCC33277的Hgp4基因,插入到克隆载体pMD18-T中并测序鉴定.经过酶切后将目的基因片段与表达载体pET22b相连,构建出表达质粒pET22b-Hgp44.将重组质粒转化到感受态细胞BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹法进行分析.用固定化金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化.结果 目的基因片段约为1100 bp,与预期大小相符,测序结果与GenBank中ATCC33277国际标准菌株的RgpA的等位基因序列U15282一致.IPTG诱导后的菌体经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后形成一个以包涵体形式存在的44 000的融合蛋白.蛋白质印迹法检测证实其具有免疫原性.用镍离子金属螯合层析柱纯化出了目的蛋白,最后得到约3.5 mg/L的目的蛋白.结论 成功克隆表达了PgHgp44基因,并纯化出了目的蛋白.     

牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白和IL-15真核共表达质粒的构建与鉴定

目的 构建含编码牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白和IL-15基因的真核共表达质粒,并检测其在哺乳动物细胞中的表达。方法 应用基因重组技术,构建真核表达载体pIRES-fimA和真核共表达载体pIRES-fimA:IL15,通过酶切、PCR及DNA序列测定鉴定获得的质粒,用Lipofectamine 2000介导转染CHO细胞,用Western blot检测重组质粒在哺乳动物中的表达,酶联免疫吸附试验检测培养上清中的蛋白表达。结果 PCR扩增获得的fimA和IL-15目的基因与预计相同,定向插入真核表达质粒pIRES中,插入位相正确,未改变阅读框架。转染的CHO细胞能够检测到目的基因的表达,在培养上清中也可以检测到蛋白质的表达。结论 本实验成功构建了牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白和IL-15的真核共表达质粒pIRES-fimA:IL15,为研制增强免疫应答的抗牙龈卟啉单胞菌DNA疫苗奠定了基础。     

变形链球菌SBR基因表达载体的构建和表达

目的 :构建可用于大肠杆菌表达系统的含变形链球菌唾液结合区段 (SBR)基因的表达载体。方法 :采用定向克隆方法将变形链球菌唾液结合区段 (SBR)基因插入表达载体 pcMVT7,构建重组原核表达质粒pcMVT7 SBR ,转化大肠杆菌JM 10 9(DE3 ) ,IPTG诱导表达 ,亲和层析纯化目的蛋白。结果 :经酶切鉴定及DNA序列测定 ,重组质粒 pcMVT7 SBR序列及阅读框架正确 ,亲和层析纯化得到SBR融合蛋白。 结论 :SBR表达载体构建成功 ,为防龋疫苗的动物实验研究奠定基础。     

大鼠磨牙牙根发育相关基因mrp1的克隆及其原核表达载体的构建

目的:从大鼠磨牙胚组织中克隆大鼠磨牙牙根发育相关基因mrp1,构建原核融合表达载体,利用大肠杆菌表达其C端肽。方法:从生后 3dSD大鼠仔鼠磨牙胚中提取总mRNA,通过RT-PCR扩增出mrp1C端肽段基因并克隆进中间载体,然后将插入基因克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-1,以大肠杆菌DH5α为宿主菌,在 28℃下进行IPTG诱导。结果:克隆载体序列酶切鉴定、序列测定完全正确;含重组质粒的工程菌经诱导后在SDS-PAGE上出现一条新生蛋白带,Mr为 36×103,与预期C端肽Mr大小一致,约占菌体总蛋白的 19%。结论:成功地鉴定了mrp1C端肽段基因,通过基因克隆构建了其原核表达载体pGEX-4T-mrp1,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K催化结构域的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆牙龈卟啉菌蛋白酶K催化结构域 (kgpcd)基因 ,并使其在大肠杆菌中获得表达。方法 :利用PCR方法克隆kgpcd ,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果 :克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列一致 ,经诱导表达见Mr为 5 6× 1 0 3 的融合蛋白。结论 :成功克隆了kgpcd的基因 ,并在大肠杆菌中表达了KGPcd蛋白 ,为后续研究奠定了基础     

融合防龋DNA疫苗pGLUA-P的构建及其细胞表达研究

目的 将变形链球菌（Streptococcus mutans)表面蛋白PAc编码A区和P区（A－P）的序列克隆到真核载体pGLU中，构建出GTF－PAc融合防龋DNA疫苗，并检测其在原核细胞和真核细胞中的表达。方法 将pCIA-P质粒中A－P片段序列与pGLU质粒连接，构建出GTF－PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P。将pGLUA-P转化大肠杆菌BL21（DE3），以SDS－PAGE电泳鉴定目的蛋白GLUA－P的表达。通过脂质体将pGLUA-P转染大鼠原代肌母细胞，以免疫组织化学检测GLUA－P的表达。结果 GTF－PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P经酶切分析证实携带GLU和A－P片段。pGLUA-P转化的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导能够表达完整的融合蛋白。pGLUA-P转染的大鼠原代肌母细胞中可检测到融合蛋白的表达。结论 成功地构建了融合防龋DNA疫苗pGLUA-P，所携带的基因序列正确，能够在原核和真核细胞中表达正确的融合蛋白。     

小鼠重组PeriostinC端肽在大肠杆菌中的表达及其产的的活性检测

目的：利用大肠杆菌系统表达小鼠重组PeriostinC端肽。方法：将编码小鼠PeriostinC的基因自然克隆到大肠杆菌表达载体pRSET-B上,使其受控于T7启动子,构建成表达质粒pRS－B－Peri,以大肠杆菌E．coli BL219(DE3)为宿主菌。对工程菌用异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（sopropylthio－β－D－galacto-side,IPTG)诱导表达,表达产物纯化后进行复性处理,再通过观察成骨细胞的伸展性检测其生物活性。结果：经IPTG诱导5h,工程菌在SDS－PAGE上出现一条新蛋白带,相对分子质量（Mr）与预期的一致,约为36000,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化和复性处理,得到纯度高于95％的有良好活性的小鼠重组PeriosinC端肽。结论：小鼠重组PeriostinC端肽在大肠杆菌中得到表达并具有良好的生物学活性。     

白色念珠菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达

目的 构建白色念珠菌3-磷酸甘油醛脱氧酶（GAPDH）的表达载体并使其在大肠杆菌中正确表达.方法 提取基因组总RNA,PCR方法获得GAPDH基因,构建其原核表达质粒pET-32a（＋）-GAPDH,转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导产生蛋白,用SDS-PAGE和Western Blotting检测GAPDH蛋白表达情况.结果 构建的白色念珠菌GAPDH基因表达质粒经序列测定证实,与GenBank数据完全一致.双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入pET-32a（＋）载体.在1.0 mmol·L-1的IPTG浓度诱导下表达,可观察到相对分子量51kDa的蛋白,经SDS-PAGE和Western Blotting检测证实为GAPDH蛋白.结论 实验成功克隆白色念珠菌GAPDH基因,并在大肠杆菌中正确表达,为白色念珠菌感染的候选疫苗奠定工作基础.     

变异链球菌乳酸脱氢酶与霍乱毒素B亚单位嵌合表达质粒的构建和表达

目的:构建含变异链球菌乳酸脱氢酶(LDH)和霍乱毒素B亚单位(CTB)嵌合原核表达质粒,并诱导表达融合蛋白。方法:应用PCR技术扩增LDH编码基因ldh和CT编码基因ctxB,定向克隆至原核表达质粒pET32a(+)上,通过限制性内酶切、PCR和序列测定分析鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达融合蛋白。结果:PCR扩增得到了ldh和ctxB;构建的质粒pET-LDH/CTB经KpnⅠ、XhoⅠ双酶切和目的基因PCR检测,均得到1.4 kb大小的片段,与预计目的基因片段大小相同;质粒pET-LDH/CTB中插入的ldh序列与GeneBank中ldh比较同源性为98%,ctxB的同源性达99%,插入的相位正确;经IPTG诱导表达了约70×103的蛋白。结论:成功构建了变异链球菌LDH和CTB嵌合表达质粒pET-LDH/CTB,并正确表达融合蛋白。     

小鼠cbfa1部分编码区在大肠杆菌中的表达和纯化

目的 在大肠杆菌中表达cbfal肽段并进行纯化，为进一步制备抗体奠定基础。方法 构建pRSETA-cbfal原核表达重组质粒，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导蛋白表达，采用Ni-NTA亲和层析柱进行初步纯化。结果 成功地将204bp的cbfal片段插入pRSET A原核表达载体中，且位于T7启动子下游、读框正确，在0．1mmol／L的IPTG诱导下，SDS-PAGE电泳可见在约14KD处有蛋白新生带，用Ni-NTA柱亲和层析纯化融合蛋白，得到的cbfal蛋白纯度大于95％。结论 转录因子cbfal部分编码区能够在体外大肠杆菌中获得融合表达。     

大鼠釉原蛋白基因表达的载体构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 观察釉原蛋白（ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ,Ａｍ）基因聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）产物在大肠杆菌中的表达。方法 利用谷胱苷肽巯基转移酶表达载体４Ｔ－２型（ｐｔａｃ ｇｌｕｔａｈｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ,ＰＧＥＸ－４Ｔ－２）载化大肠杆菌ＤＨ５α,通过异丙基硫代半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ,ＩＰＴＧ）诱导,收菌。聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果 电泳分析表明,釉原蛋白基因ＰＣＲ产物在大肠杆菌中成功地获得了表达。结论 构建了ＰＧＥＸ－４Ｔ－２／Ａｍ融合表达载体,获得了融合表达的目的蛋白。