胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素-3双基因转染大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经样细胞的研究

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和神经营养素3(NT-3)双基因修饰诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞的可行性以及GDNF和NT-3的表达变化.方法 全骨髓法分离培养BMSCs,流式细胞术检测BMSCs标志CD90和造血干细胞标志CD45.转染带荧光的GDNF和NT-3基因,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及细胞形态变化;免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和神经胶质酸性蛋白(GFAP)表达;Western blot 检测细胞中GDNF及NT-3蛋白表达.对照组为未转染GDNF和NT-3基因的BMSCs.结果 BMSCs能在体外成功分离培养,细胞高表达CD90(92.7%),不表达CD45.诱导分化后,BMSCs胞体变圆,伸出明显突起,并可见多数细胞相互交织成网状结构,呈神经细胞样形态.免疫荧光标记检测可见实验组细胞表达NSE和NF,而不表达GFAP.而对照组阴性.Western blot检测可见细胞GDNF及NT-3蛋白表达增强.结论 GDNF和NT-3双基因修饰诱导的BMSCs可分化为神经样细胞并表达神经元的标志,为基因治疗神经系统疾病如先天性巨结肠提供实验基础.     

c-kit在肠神经节细胞发育过程中的作用

目的 初步探讨c-kit在肠神经节细胞发育中的作用.方法 体外培养大鼠肠神经节细胞及骨髓间充质干细胞(BMSCs),并在GDNF与胎肠培养基(FGCM)培养的条件下诱导BMSCs分化为肠神经节细胞.免疫组织化学方法 鉴定原代培养的肠神经节细胞神经丝蛋白(neurofilament,NF)的表达,用血管活性肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)及NF鉴定BMSCs诱导分化的肠神经节细胞.RT-PCR分别检测原代肠神经节细胞、BMSCs以及诱导之肠神经节细胞的c-kit的表达.结果免疫组化结果显示纯化后的肠神经节细胞表达NF,流式细胞学检测第四代后的BMSCs高表达CD90,而不表达CD45,诱导后的肠神经节细胞可表达VIP及NF,而其余两组则不表达.RT-PCR结果示原代肠神经节细胞及BMSCs不表达c-kit,诱导后的肠神经节细胞可表达c-kit.结论 在体外能成功培养大鼠肠神经节细胞及BMSCs并纯化,BMSCs可被诱导为肠神经节细胞并表达肠神经递质.在肠神经系统的发育过程中,c-kit可能在某一阶段起到一定作用,在肠神经细胞逐渐发育成熟时接受到某些信号而关闭.     

丹参诱导人脐血间充质干细胞分化为神经样细胞

目的探讨丹参注射液对人脐血单个核细胞来源的间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的诱导作用。方法利用FACScan流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD29、CD44、CD59、CD33,用丹参注射液诱导人脐血原代细胞和脐血来源的间充质干细胞向神经细胞方向分化,并与神经生长因子(NGF)和神经常苷脂(GM1)的诱导作用比较,用免疫细胞化学方法对分化和未分化细胞进行鉴定。结果人脐血原代细胞中MSCs的表耐标记CD29、CD44、CD59阳性率分别为10.7%、37.27%和66.67%,而造血细胞的表面标记CD33阳性率仅为0.33%。人脐血传代细胞(第5代)MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59的阳性率分别为40.2%、70.5%和95.4%。原代培养的贴壁细胞形态呈大小不等圆形和条形,用丹参诱导可表达神经细胞的标记。传代培养的间充质干细胞,可维持在未分化状态稳定增殖。用丹参可诱导这种细胞向神经样细胞分化,表达神经干细胞标记nestin,神经元的标记β-Ⅲ类神经微管(β-TubulinⅢ)、神经微丝(NF)和神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。与NGF和GMI的诱导作用比较,细胞形态类似,表达相同的神经细胞标记,丹参的诱导速度较快,诱导后细胞表达神经元标记的比例较高。结论人脐血是MSCs的来源之一,丹参可诱导人脐血干细胞分化为神经样细胞,丹参可作为神经诱导剂,人脐血干细胞可作为神经干细胞的来源。     

小鼠肠神经嵴干细胞体外神经元亚型分化的研究

目的 研究胚鼠(E14～17)、新生鼠(P1、P5)肠神经嵴干细胞(GNCSCs)在体外培养中经诱导向一氧化氮合酶(NOS)和血管活性肠肽(VIP)神经元分化的特点;研究标本取材和细胞消化分离间隔时间对P5鼠收获GNCSCs克隆球数量和诱导分化能力的影响.方法 分离并培养胚鼠、新生鼠GNCSCs,采用血清联合多聚赖氨酸或单纯多聚赖氨酸促分化,SABC法进行nNOS和VIP免疫细胞化学染色;将P5鼠按标本取材和细胞分离的间隔时间分为0、15、30、45、60 min组,对培养72h GNCSCs克隆球进行计数,再采用血清联合多聚赖氨酸促分化,SABC法进行nNOS和VIP免疫细胞化学染色.结果 血清联合多聚赖氨酸对胚鼠、新生鼠GNCSCs克隆球诱导分化作用明显强于单纯使用多聚赖氨酸(P＜0.05);胚鼠、新生鼠GNCSCs经体外培养、血清联合多聚赖氨酸诱导,均可分化出nNOS和VIP阳性细胞;P5鼠0min组获得的GNCSCs克隆球数和经联合诱导分化出的阳性细胞数明显高于其他各组(P＜0.05),15、30min均明显高于45、60min组(P＜0.05).结论 血清联合多聚赖氨酸对GNCSCs向NOS和VIP神经元分化的诱导作用明显优于单纯使用多聚赖氨酸;胚鼠和新生鼠GNCSCs经体外培养、血清联合多聚赖氨酸的诱导,可分化出NOS和VIP神经元;P5鼠肠管获得GNCSCs数和NOS、VIP神经元分化能力随标本取材、细胞分离间隔时间延长而降低.     

人脐带间充质干细胞的生物学特性及向神经样细胞分化的研究

目的 研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞（MSCs）的特性及向神经细胞分化的可能性,为神经移植寻找新的细胞来源。方法 检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记;丹参和B巯基乙醇诱导人脐带来源的MSCs向神经细胞分化,用免疫细胞化学方法对分化和未分化的细胞进行鉴定;半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞的神经相关基因表达。结果 从人脐带分离、培养的贴壁细胞,体外生长形态类似于成纤维细胞,可以维持在未分化状态稳定增殖,体外增殖超过10代。这类细胞MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59、CD105仿呈现高表达,造血细胞表面标记CD14、CD33、CD34、CD27、CD45、CD117和与移植免疫排斥相关的表面标记CD80（137—1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L不表达或低表达。丹参和β巯基乙醇均可诱导人脐带MSCs向神经样细胞分化,分化的细胞表达神经干细胞的标记巢蛋白（Nestin）,神经元的标记类神经微管（β-TubulinⅢ）和神经微丝（NF）,以及神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。RT-PCR检测证实,经丹参诱导后的MSCs表达神经干细胞相关基因Nestin,诱导前和诱导后的MSCs均表达神经细胞基因Pleiotrophin,诱导后的表达明显增强。结论 人脐带华尔通胶含有丰富的MSCs,易于培养扩增,其表达MSCs的表面标记。不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞标记。人脐带来源的MSCs能分化为神经细胞,表达神经细胞的相关标记和基因,这种细胞可能成为中枢神经系统细胞移植的一个干细胞来源。     

神经干细胞移植治疗大鼠无神经节细胞症的初步研究

目的观察神经干细胞（NeuralStemcells,NSCs）在无神经节细胞症大鼠直肠壁内移植的存活和分化情况,以及对肠道运动和反射功能的改善,探讨神经干细胞移植对肠无神经节细胞症的治疗作用。方法用0．5％苯扎氯铵溶液浸湿造模,造模成功后,随机分为两组,每组各30只。模型组用免疫荧光标记的提纯好的脐带间充质神经干细胞150汕（浓度107／mL）分3处注入大鼠无神经节细胞肠壁内,对照组用生理盐水注射。并分别于注射后2,4,8周取材,观察大体表现,免疫荧光显微镜观察神经干细胞在病变肠管中的成活情况,免疫组化检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）和S-100蛋白表达情况,钡灌肠检查肠道功能情况。结果本组造模成功60例,无试验过程中死亡。模型组移植后2周取材,其中22只移植后可检测到肠壁内移植细胞存活,证明神经干细胞移植成功;4周取材可见分化为神经节细胞和星型胶质细胞,免疫组化可见肠壁内NSE和S-100蛋白表达;8周取材与4周结果相同。注射生理盐水组无一只有神经节细胞存活。免疫组化检测,移植组病变肠段肠壁内神经细胞表达明显高于对照组。钡灌肠结果显示,神经干细胞移植前后结肠形态上有明显不同。结论脐带间充质干细胞来源的NSCs在无神经节细胞的肠壁内可以存活和分化,并在一定程度上恢复肠神经功能,从而为NSCs移植治疗无神经节细胞性巨结肠病提供了实验依据。     

新生大鼠神经干细胞的分离培养

目的 探讨新生大鼠神经干细胞的分离培养方法及其外源报告基因在神经干细胞中的表达情况。方法 采用无血清细胞培养技术，间接免疫细胞化学染色法及其绿色荧光蛋白转导技术。结果 从新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续克隆能力，表达神经上皮干细胞蛋白，诱导分化后的细胞表达成熟神经细胞和星形胶质细胞特异性的蛋白。绿色荧光蛋白报告基因转导神经干细胞后能够有效表达。结论 该方法分离培养的神经干细胞保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新、增殖能力和多分化潜能，而且外源报告基因在神经干细胞中能够有效表达。     

新生大鼠神经干细胞的分离培养

目的： 探讨新生大鼠神经干细胞的分离培养方法及其外源报告基因在神经干细胞中的表达情况。方法： 采用无血清细胞培养技术，间接免疫细胞化学染色法及其绿色荧光蛋白转导技术。结果： 从新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续克隆能力，表达神经上皮干细胞蛋白，诱导分化后的细胞表达成熟神经细胞和星形胶质细胞特异性的蛋白。绿色荧光蛋白报告基因转导神经干细胞后能够有效表达。结论： 该方法分离培养的神经干细胞保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新、增殖能力和多分化潜能，而且外源报告基因在神经干细胞中能够有效表达。     

复方丹参注射液诱导鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的研究

骨髓间充质干细胞(bone mesenehymal stem cells,BMSCs)移植治疗新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是近年来研究的新方法,但目前发现BMSCs移植后神经性分化率仅约10％左右。如何提高BMSCs神经性分化效率,更有效重建神经网络以显著改善脑功能值得深人研究。抗氧化剂可诱导BMSCs分化为神经元样细胞,丹参主要成分为丹参酮类及酚酸类物质,     

干细胞向神经细胞诱导分化的研究进展

干细胞的无限自我更新和增殖分化的特性,为治疗神经系统疾病带来了希望,其中间充质干细胞(MSCs)具有分化成间质起源的任意组织包括神经组织的潜能,使其作为最佳种子细胞在组织工程中令人看好.但不少学者对间充质干细胞的这种可塑性持相反意见.神经干细胞可分化为不同类型的神经细胞,大多神经干细胞移植实验显示胶质细胞占较大比例.胚胎干细胞可分化为包括神经谱系在内的各种细胞谱系,目前有3种分化为神经细胞的方法,包括视黄酸诱导法、谱系选择法及基质细胞诱导法.少突胶质前体细胞是一种重要的神经前体细胞,表达趋化因子受体CXCR4,并受到CXCLl2的调节.血小板衍生生长因子、纤毛状神经营养因子与白血病抑制因子都可促进其分化.     

RET/GDNF signalling in vagal neural crest-derived neurons of the chick embryo cloaca

Introduction  The growth factor, ‘Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor’ (GDNF), is involved in the development of enteric ganglia, using the tyrosine kinase receptor ‘REarranged during Transfection’ (RET) to stimulate the proliferation and differentiation of neural crest-derived precursor cells. To date, the presence of these signalling molecules have not been studied in the developing cloaca, thus the aim of this study was to investigate the distribution of RET and GDNF, and analyse their co-localisation in vagal-derived neurons of the cloaca using quail-chick chimera embryos. Materials and methods  Chicken embryos were incubated until the 10–12 somite stage. The vagal neural tube was microsurgically ablated in ovo and replaced with the vagal neural tube from age-matched quail embryos. Quail-chick chimera embryos were harvested at E12, fixed and embedded in paraffin wax, and serially sectioned. Immunohistochemistry was performed using human natural killer-1 (HNK-1), quail-cell-specific perinuclear (QCPN), GDNF and RET antibodies. Results  HNK-1 labelled all ganglia in the myenteric and submucosal plexuses of the cloaca, while the quail-specific QCPN antibody labelled all ganglia derived from the transplanted quail vagal neural tube (Fig. 1, a, b). RET and GDNF were found both co-localised and expressed in separate ganglia in the cloaca (Fig. 1, c, d). The majority of QCPN-labelled vagal-derived neurons also expressed RET and GDNF. Fig. 1  HNK-1 (a), QCPN (b), GDNF (c) and RET (d) immunoreactivity in the chick cloaca at E12. Arrows show ganglia displaying co-immunoreactivity for all four antibodies

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Conclusion  Results show that GDNF and RET signalling play a major role in ENS development in the chick embryo cloaca. We have shown, for the first time, that the majority of vagal neural crest-derived neurons co-express RET and GDNF, thus highlighting the importance of these signalling factors in cloacal development.     

多药耐药基因在K562细胞诱导分化过程中的表达

目的　通过组织血浆酶原激活剂 (TPA)诱导K5 6 2细胞分化 ,探讨白血病的多药耐药性。方法　应用体外细胞培养技术 ,通过细胞形态、细胞化学染色观察细胞分化 ;用免疫组化 (IC)、流式细胞术 (FCM )、聚合酶链反应 (RT PCR)等技术检测P 糖蛋白 (P gP)的表达和功能及多药耐药基因 1信使核糖核酸 (mdr1mRNA)的表达。结果　TPA诱导K5 6 2细胞向单核 /巨噬细胞分化 ;在此分化过程中mdr1mRNA表达随作用时间延长而渐增加 ,P gP表达及功能增强。 结论　mdr1mRNA、P gP表达及功能在TPA诱导K5 6 2细胞向单核 /巨噬细胞分化过程中随细胞分化而上调     

小鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及其机制研究

目的探讨小鼠巨细胞病毒(MCMV)对体外培养的神经干细胞(NSCs)分化的影响及其机制。方法体外分离、培养BABL／c胎鼠NSCs,利用NSCs向神经细胞分化模型,用感染复数(MOI)为1的含Lacz报告基因的重组MCMV毒株RM461进行感染,通过免疫组化、流式细胞术和RT-PCR检测MCMV感染后Nestin、GFAP和NSE阳性细胞比率及对神经干细胞分化相关信号分子Wnt-1和neurogenin 1(Ngn1)基因表达的影响。结果体外分离培养的NSCs,神经干细胞特异性标志Nestin表达强阳性,并可进一步分化为GFAP阳性的星形胶质细胞和NF-200、NSE阳性的神经元。当NSCs分化培养2 d,感染组和未感染组Nestin阳性细胞分别为(62．2±1．8)％和(37．2±2．4)％(t= 4．62,P<0．01),差异有统计学意义;而GFAP阳性细胞的比例分别为(37．4±1．6)％和(50．3±1．8)％(t=9．89,P<0．01),NSE阳性细胞的比例分别为(8．9±0．8)％和(23．4±1．3)％(t=5．09, P<0．01),差异均有统计学意义。感染组和未感染组Wnt-1基因的相对表达量分别为0．14±0．03和0．32±0．04(t=7．21,P<0．01),Ngn1基因的相对表达量分别为0．09±0．01和0．21±0．02(t= 10．73,P<0．01),差异均有统计学意义。结论(1)CMV可抑制NSCs分化,这可能是CMV致脑发育异常的重要机制;(2)CMV感染可抑制Wnt-1和Ngn-1的基因表达而影响NSCs分化,人为调控这两条通路可能为探寻防治CMV感染致脑发育异常的方法提供新策略。     

产前补充牛磺酸对宫内生长受限胎鼠脑组织PKA-CREB通路及GDNF mRNA表达的影响

目的探讨牛磺酸对宫内生长受限(IUGR)胎鼠大脑蛋白激酶A-cAMP反应元件结合蛋白(PKA-CREB)通路及胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)mRNA表达的影响。方法采用妊娠期全程饥饿法制作IUGR模型,将20只孕鼠随机分为4组(n=5):对照组、IUGR组、小剂量(每天100mg/kg)及大剂量(每天300mg/kg)牛磺酸用药组。利用逆转录-聚合酶链反应方法检测各组胎鼠大脑PKA、CREB及GDNF mRNA水平变化。结果与对照组相比,IUGR组胎鼠大脑PKA、CREB及GDNF mRNA表达均明显增多(P<0.05)。与IUGR组相比,小剂量和大剂量牛磺酸组胎鼠脑组织的PKA和CREB mRNA表达水平增高(P<0.05),大剂量牛磺酸组胎鼠脑组织GDNF mRNA水平亦明显增高(P<0.01)。结论牛磺酸可增加IUGR胎鼠大脑PKA-CREB通路及GDNF mRNA的表达,提示产前补充牛磺酸可能通过增强中枢神经系统神经发生能力、增加神经营养因子的分泌等途径来改善IUGR胎鼠脑损伤,发挥对脑组织的保护作用。     

全反式维甲酸诱导K562细胞铁代谢变化的研究

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)对K562白血病细胞中铁代谢相关基因表达产物(H-Fn、TfR及IRP2)的影响及其相互关系.方法 应用联苯胺、瑞氏、非特异性酯酶、硝基四氮唑蓝还原试验4种染色方法 ,观察ATRA对K562细胞的诱导分化特点;应用流式细胞术检测经ATRA处理后,K562细胞表面抗原CD71及CDl3表达水平的变化;应用RNA/蛋白带移动分析方法 (RNA/protein band-shift assay)检测铁调节蛋白(IRP)的结合活性;采用放射免疫分析法测定K562细胞内铁蛋白含量的变化;采用RT-PCR方法 对ATRA处理的K562细胞H-Fn、TfR及IRP2 mRNA水平的表达进行检测,同时对RT-PCR产物克隆测序.结果 K562细胞经ATRA诱导,出现粒系分化的形态学特征,中幼粒细胞及以后阶段的细胞数明显增多.细胞表面抗原CD71下降而CD13表达升高.ATRA处理组的H-Fn mRNA水平较对照组升高,而IRP2及TfR mRNA减少;处理组IRP结合活性较对照组明显下降,但铁蛋白含量升高.结论 ATRA诱导K562细胞向粒系方向分化过程中,伴有一系列铁代谢相关基因表达产物的改变,其上游调控机制有待进一步探讨.     

产前补充牛磺酸对宫内生长受限胎鼠脑组织PKA-CREB通路及GDNF mRNA表达的影响

目的:探讨牛磺酸对宫内生长受限（IUGR）胎鼠大脑蛋白激酶A-cAMP反应元件结合蛋白（PKA-CREB）通路及胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）mRNA表达的影响。方法:采用妊娠期全程饥饿法制作IUGR模型,将20只孕鼠随机分为4组(n=5):对照组、IUGR组、小剂量(每天100 mg/kg)及大剂量(每天300 mg/kg)牛磺酸用药组。利用逆转录-聚合酶链反应方法检测各组胎鼠大脑PKA、CREB及GDNF mRNA水平变化。结果:与对照组相比,IUGR组胎鼠大脑PKA、CREB及GDNF mRNA表达均明显增多(P<0.05)。与IUGR组相比,小剂量和大剂量牛磺酸组胎鼠脑组织的PKA和CREB mRNA表达水平增高(P<0.05),大剂量牛磺酸组胎鼠脑组织GDNF mRNA水平亦明显增高(P<0.01)。结论:牛磺酸可增加IUGR胎鼠大脑PKA-CREB通路及GDNF mRNA的表达,提示产前补充牛磺酸可能通过增强中枢神经系统神经发生能力、增加神经营养因子的分泌等途径来改善IUGR胎鼠脑损伤,发挥对脑组织的保护作用。［中国当代儿科杂志,2009,11（11）：923-926］