亚低温抑制大鼠弥漫性脑损伤后细胞凋亡的研究

目的探讨大鼠不同程度弥漫性脑损伤后脑组织的凋亡变化过程及亚低温治疗对脑细胞凋亡的抑制作用.方法采用大鼠Marmarou颅脑创伤装置制作弥漫性脑损伤模型,然后将128只Wistar大鼠分为未损伤组(对照组)、重度损伤组、轻度损伤组和亚低温治疗组.通过电子显微镜、组织切片原位末端标记DNA片段(TUNEL染色)、琼脂糖凝胶电泳(DNA Ladder法)等方法,观察和比较不同程度脑损伤后,大鼠脑皮层及海马区凋亡细胞的形态、特点和数量.结果(1)损伤后24～48 h,皮层及海马区可见大量细胞皱缩、核碎裂、核不规则等细胞凋亡现象,48 h较24 h更为严重;亚低温治疗后24～48 h,电子显微镜观察皮层及海马区未见细胞皱缩、核碎裂等细胞凋亡现象.(2)TUNEL染色结果显示,随着损伤程度的加重凋亡明显加重,损伤后48 h达高峰,然后逐渐下降.轻度损伤组细胞凋亡主要限于海马CA2和CA3区;重度脑损伤组细胞凋亡涉及整个海马结构,同时还广泛累及额顶区皮质.损伤后第24、48、72 h,皮层及海马区的凋亡细胞数量较同期未治疗组明显减少.(3)重度损伤后48 h,海马和皮层区细胞琼脂糖电泳可见典型的DNA梯状带,其他时间未见梯状带.亚低温治疗组、轻度脑损伤组及未损伤组亦未见梯状带.结论轻度弥漫性脑损伤后,脑细胞凋亡多发生于海马CA2和CA3区;重度脑损伤后皮层及海马区细胞可发生广泛凋亡.细胞凋亡随着损伤程度的加重而加重,高峰位于伤后第2 d.亚低温治疗可有效地抑制大鼠弥漫性脑损伤后的细胞凋亡.     

亚低温对大鼠弥漫性脑损伤后海马CA3区HSP70表达及细胞凋亡的影响

目的 观察亚低温对大鼠弥漫性脑损伤(DBI)后海马CA3区HSP70在蛋白质和mRNA水平的表达及细胞凋亡上的影响,探讨亚低温脑保护分子生物机制。方法 将大鼠随机分成空白对照、假手术、单纯DBI和DBI后亚低温治疗四组,按Marmarou氏方法制作大鼠DBI模型,采用免疫组化法、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及流式细胞仪(FCM),分别观察各组动物脑海马CA3区HSP70在蛋白质和mRNA水平的表达及细胞凋亡率。结果 与对照组相比,大鼠DBI后海马CA3区HSP70表达水平及细胞凋亡率均升高(P<0.05);亚低温治疗后,大鼠脑海马CA3区HSP70表达水平较单纯DBI组显著增高(P<0.01),而细胞凋亡率则明显降低(P<0.05)。结论 亚低温对创伤性脑损伤的脑保护机制可能与促进HSP70表达,并减少神经细胞凋亡有关。     

亚低温对创伤性脑损伤后线粒体α-酮戊二酸脱氢酶活性的影响

目的研究亚低温对脑损伤后病理学，α-酮戊二酸脱氢酶（α—ketoglutarate dehydrogenase complex，α-KGDHC）活性以及Caspase-3活性的影响。方法雄性SD大鼠50只随机分七组：假手术组（n=5），液压脑损伤常温组（1．8～2．2atm）（n=25），液压脑损伤亚低温组（n=20）。常温组伤后6h，24h，72h，7d检测创伤侧皮层、海马及丘脑线粒体α—KGDHC活性及Caspase-3的活性。伤后15min应用亚低温，30min内脑温降至33℃并维持4h，检测24h及72h酶活性以及Caspase-3的活性。以及亚低温对损伤后24h皮层丘脑及海马CA3区神经病理的影响。结果Fluoro—jade染色显示亚低温显著减少损伤后24h坏死神经元数目（P〈0．05），伤后24h及72hKGDHC酶的活性显著增加（P〈0．05）。伤后24hCaspase-3的活性显著降低（45％）。结论创伤性脑损伤后早期亚低温能够恢复能量代谢酶的活性，抑制神经元凋亡，减轻损伤后神经元的变性。     

亚低温对大鼠脑创伤后海马区凋亡相关蛋白表达的影响

目的观察亚低温对大鼠创伤性脑损伤(TBI)后海马CA3区细胞凋亡及相关蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3表达的影响,探讨亚低温脑保护的分子生物学机制.方法将大鼠随机分成假手术、单纯脑损伤和脑损伤后亚低温治疗3组,应用改良Marmarou方法制作大鼠TBI模型,分别用流式细胞仪(FCM)和免疫组化法检测各组动物脑海马CA3区细胞凋亡率和Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表达.结果与假手术组相比,大鼠TBI后海马CA3区细胞凋亡率及Caspase-3表达增高(P<0.05),Bcl-2/Bax表达比下降(P<0.05).亚低温治疗后,大鼠脑海马CA3区细胞凋亡率及Caspase-3表达较单纯脑损伤组降低(P<0.05),而Bcl-2/Bax表达比升高(P<0.05).结论亚低温对TBI的脑保护作用机制可能与干预伤后凋亡相关基因表达并减少神经细胞凋亡有关.     

头孢曲松对大鼠弥漫性轴索损伤后细胞凋亡的影响

目的探讨头孢曲松对大鼠弥漫性轴索损伤后海马CA1区神经元凋亡的影响。方法选择雄性Wistar大鼠120只,随机分为药物干预组(n=36):制作弥漫性轴索损伤模型,于制作模型后即刻给予头孢曲松200 mg·kg-1。假手术组(n=36):仅行头皮切开缝合处理,给予等量生理盐水腹腔注射。脑损伤组(n=36):制作弥漫性轴索损伤模型,给予等量生理盐水腹腔注射。正常对照组(n=12):不给予任何干预措施。采用免疫组化技术检测干预后12、24和36h时相海马CA1区凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)蛋白的表达水平。结果脑损伤组和药物干预组大鼠海马CA1区Apaf-1蛋白表达水平均于12 h开始增加,24 h达高峰,此后逐渐下降。药物干预组大鼠海马CA1区Apaf-1蛋白表达水平在各个时相点均低于脑损伤组,均差异有统计学意义。结论弥漫性轴索损伤可引起大鼠海马CA1区神经元凋亡,头孢曲松可改善凋亡的发生、发展。     

大鼠脑创伤后海马CA3区细胞凋亡及相关基因表达研究

目的研究弥漫性脑损伤后不同时间,大鼠海马CA3区细胞凋亡及相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表达情况,探讨脑创伤后神经细胞凋亡的分子生物学机制.方法应用流式细胞仪和免疫组化法,分别检测脑创伤后不同时间海马CA3区细胞凋亡率及Bcl-2,Bax和Caspase-3基因在蛋白质水平的表达情况.结果脑创伤后海马CA3区存在不同程度细胞凋亡,Bcl-2在脑损伤后表达下降,而Bax和Caspase-3在脑创伤后表达升高;Caspase-3表达的峰值时间(72 h)出现在Bax之后(48 h).结论弥漫性脑损伤后,大鼠海马CA3区存在细胞凋亡及Bcl-2,Bax和Caspase-3的表达变化.Bcl-2/Bax表达比值下降早于Caspase-3的上升,Bcl-2/Bax表达比值改变可能与Caspase-3活化有关,进而启动并加重脑损伤后神经细胞凋亡.     

亚低温抑制大鼠创伤性神经细胞凋亡的实验研究

目的 研究创伤性脑损伤后神经细胞凋亡机理及其时序空间分布,并探讨亚低温脑保护机理。方法 末端标记法(TUNEL)、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞技术检测大鼠重度脑损伤后不同脑区神经细胞凋亡的动态变化过程。实验分假手术组、常温脑伤组、亚低温治疗6、12、24h三组。结果 创伤后12h皮层、皮层下、白质、海马等脑区神经细胞凋亡明显增加,其高峰在伤后12～72h,持续可达14d,与对照组相较,相差显著或非常显著。琼脂糖凝胶电泳显示创伤脑组织DNA出现特异凋亡电泳带。流式细胞检测呈现典型亚二倍体核型峰(AP峰)。亚低温治疗明显抑制创伤性神经细胞凋亡。结论 创伤性脑损伤后存在神经细胞凋亡现象。亚低温对创伤性神经细胞凋亡具有明显抑制作用。     

亚低温对大鼠短暂全脑缺血后神经元凋亡的影响

目的 探讨亚低温对大鼠脑缺血后神经元凋亡的影响，揭示亚低温的部分神经保护机制。方法 采用“双侧颈总动脉阻断＋全身低血压”方法来建立大鼠短暂性全脑缺血模型。用神经元尼氏体亚甲兰特殊染色法观察大鼠脑缺血后海马CA1区神经元损害情况；原位细胞凋亡检测法（TUNEL染色）及电镜观察脑缺血后CA1区神经元凋亡情况。结果 与假手术组、低温缺血组相比，常温缺血组海马CA1区神经元缺失明显（P＜0．01）。常温及低温缺血组海马CA1区均存在神经元凋亡，但低温缺血组海马CA1区凋亡神经元数明显少于缺血组（P＜0．01）。结论 经“双侧颈总动脉阻断＋全身低血压”方法建立的大鼠短暂全脑缺血模型证实了亚低温的脑保护作用。全脑缺血后的迟发性神经元死亡很可能经由凋亡途径，而亚低温可通过抑制缺血性神经元凋亡而发挥一定的神经保护作用。     

大鼠颅脑损伤后亚低温治疗对Calpain及作用底物MAP-2表达的影响

目的探讨亚低温治疗对颅脑损伤后Calpain、MAP-2基因和蛋白表达的影响。方法将54只SD大鼠随机分为假手术组（n=6）、常温脑损伤组（n=24）和亚低温脑损伤组（n=24）。亚低温脑损伤组在液压打击伤后即接受持续4h的亚低温治疗。伤后6h、12h、24h和72h4个时间点分别处死3只常温脑损伤组和亚低温脑损伤组大鼠。荧光PCR、Western blot半定量检测皮质Calpain及MAP-2基因转录和蛋白的表达。结果颅脑损伤后12h及24h亚低温使Calpain mRNA表达增加（P〈0．05）,伤后6h、12h、24h和72h亚低温均可减少Calpain蛋白的升高,伤后12h及72h尤其显著（P〈0．05）。与假手术组比较,常温脑损伤组和亚低温脑损伤组MAP-2基因转录均减少（P〈0．05）;与常温脑损伤组比较,伤后6h、12h和24h亚低温可抑制MAP-2基因转录的下调,但亚低温脑损伤组MAP-2蛋白的表达均比同时间点常温组低（P〈0.05）。结论颅脑损伤后亚低温治疗的脑保护机制可能与调节Calpain蛋白的表达有关,而亚低温与MAP-2的关系还有待进一步研究。     

亚低温对缺血性神经元凋亡、细胞色素C释放的影响

通过大鼠短暂全脑缺血模型来探讨亚低温对大鼠脑缺血后细胞色素C(CytochromeC ,CytC)释放及缺血性神经元凋亡的影响 ,揭示亚低温的部分神经保护机制。用原位细胞凋亡检测法 (TUNEL染色 )检测及电镜观察脑缺血后大鼠脑海马CA1区神经元凋亡发生情况 ;免疫组织化学法测定脑缺血后大鼠脑海马区神经元中细胞色素C释放情况。结果显示 :①低温缺血组海马CA1区凋亡神经元数明显少于常温缺血组 (P <0 .0 1) ;②低温缺血3h组海马CA1区神经元CytC阳性表达低于常温缺血 3h组 (P <0 .0 1)。据此认为 ,全脑缺血后的迟发性神经元死亡很可能经由凋亡途径 ,而CytC激活、释放是缺血性神经元凋亡的一个关键事件。亚低温可抑制CytC的释放 ,推测经此途径减少缺血性神经元凋亡而发挥一定的神经保护作用。     

亚低温对大鼠创伤性脑损伤后海马CA3区细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响

本研究采用流式细胞仪 (flowcytometer ,FCM )及免疫组化法 ,分别观察亚低温对大鼠创伤性脑损伤 (TBI)后脑海马CA3区细胞凋亡率及Bcl 2、Bax和Caspase 3蛋白表达的影响 ,探讨亚低温抗细胞凋亡的脑保护机制。1　材料和方法1 1　研究对象 :雄性SD大鼠 4 8只 ,体重 350～ 375g ,随机分成空白对照、假手术、单纯脑损伤及脑损伤后亚低温治疗 4组 ,每组1 2只 ,6只用于检测细胞凋亡率 ,另 6只用来观察Bcl 2、Bax及Caspase 3蛋白表达。空白对照组不作任何处理 ,假手术组除了不给予头部打击外 ,其余操作同单纯脑损伤组 ,亚低温治疗组于伤后立…     

Cyt-C Bcl-XL和Bcl-XS在大鼠创伤性脑损伤模型中的表达意义

目的 观察大鼠创伤性脑损伤(TBI)后细胞色素C释放及凋亡因子Bcl-XL和Bcl-XS的表达意义.方法 采用大鼠自由落体建立脑损伤模型,分别于伤后2h、6h、12 h、24 h、72 h、120 h、168 h检测大鼠脑挫裂伤侧海马CA2-CA3区细胞色素C染色阳性细胞(免疫组化法),应用Bcl-XL和Bcl-XS原位杂交法检测Bcl-XL和Bcl-XS mRNA表达.结果 脑挫裂伤后,海马CA2-CA3区Cyt-C阳性染色的神经细胞出现具有明显时相性,脑损伤后大鼠脑组织内Bcl-XL、Bcl-XS mRNA出现相应改变.结论 大鼠脑挫裂伤后海马CA2-CA3区细胞有相应变化并出现细胞凋亡.     

弥漫性脑损伤神经细胞凋亡及神经生长因子干预的实验研究

目的探讨弥漫性脑损伤后神经细胞凋亡及脑组织水肿情况及神经生长因子对此的干预作用。方法采用Marmarou脑损伤模型。将Spraque—Dawley鼠40只随机分成脑损伤组,神经生长因子治疗组和生理盐水对照组。治疗组分别于致伤后10min和60rain腹腔内注射神经生长因子（30mg／kg）,对照组注射等量生理盐水,于伤后24h、48h、72h和96h断头取脑,采用原位末端标记法检测凋亡细胞,对比各时段脑水肿和神经细胞的凋亡情况。结果神经细胞从伤后24h出现细胞凋亡,48～72h达高峰,治疗组与损伤组在24h,48h,72h和96h时脑组织含水量有显著性差异（P〈0．05）,对照组与损伤组含水量无显著性差异（P〉0．05）。结论神经生长因子对脑损伤性脑水肿及神经细胞凋亡有治疗作用。     

神经生长因子对大鼠前脑缺血再灌注后细胞凋亡及FaS蛋白表达的影响

目的：研究神经生长因子（NGF）对大鼠前脑缺血再灌注后海马CA1区Fas蛋白表达和细胞凋亡的影响。方法：夹闭大鼠双侧颈总动脉造成前脑缺血，30min后松夹再灌注，NGF组和生理盐水组于再灌注开始时分别肌肉注射NGF30μg·mL^-1和生理盐水0．1mL，应用免疫组化法和TUNEL法检测各组大鼠海马CA1区Fas蛋白表达和细胞凋亡。结果：再灌注后6和24h，NGF组Fas蛋白平均吸光度值小于生理盐水组（P〈0．001和P〈0．05）。再灌注后48h两组比较差异无统计学意义（P〉0．5）。再灌注后6、24和48h，NGF组TUNEL阳性细胞率均低于生理盐水组，差异有统计学意义（P〈0．005）。结论：NGF可以减少大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区Fas蛋白表达，抑制细胞凋亡，从而发挥其神经保护作用。     

亚低温对大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马CA1区c-Jun蛋白表达的影响

目的研究亚低温对大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马CA1区神经元的保护作用,并探讨其可能的机制。方法采用四血管阻断法建立大鼠全脑缺血模型。SD大鼠,随机分为假手术组(SH组)、常温组(IR组)和亚低温组(HIR组)。各组在全脑缺血15min后分别再灌注6h、12h、1d、3d,采用苏木素-伊红(HE)染色观察各时间点海马CA1区细胞形态学变化和TUNEL法检测海马CA1区神经元凋亡,免疫印迹检测c-Jun蛋白表达。结果(1)HE染色结果 IR组和HIR组于全脑缺血再灌注后6h,HE染色未见明显改变,IR组缺血再灌注1d时CA1区出现严重改变,3d时损伤最严重,出现细胞数目减少,细胞胞体缩小、胞核固缩深染,损伤严重,排列紊乱,核膜不清,核仁消失。而HIR组海马存活的锥体细胞数较之IR组12h、1d、3d时间点均明显增加(P<0.05)。(2)TUNEL标记IR组于缺血再灌注后6h在海马CA1区阳性细胞开始增多,缺血再灌注1 d时阳性细胞数最多。而HIR组各时间点阳性细胞数均较IR组明显减少(P<0.01)。(3)免疫印迹结果全脑缺血再灌注后6h c-Jun蛋白在IR组海马CA1区表达开始增加,12h达高峰,持续到3d;HIR组在各时间点的表达均弱于IR组(P<0.01)。结论亚低温通过减少海马CA1区c-Jun的表达,抑制海马CA1区神经元的凋亡,可能是亚低温脑保护作用的机制之一。     

亚低温对大鼠弥漫性脑损伤后海马 CA1区Apaf-1蛋白表达的影响

弥漫性脑损伤(diffuse brain injury)是闭合性脑外伤的一种,致残率及死亡率均较高[1-2].目前,国内外学者对亚低温治疗脑外伤进行了相关的基础和临床研究,但关于亚低温与神经细胞凋亡之间的关系研究相对较少.本研究通过探讨亚低温对大鼠弥漫性脑损伤后海马CA1区凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)蛋白表达及学习记忆功能的影响,旨在为临床治疗颅脑创伤患者提供科学依据.     

亚低温对缺血性神经元凋亡、细胞色素C释放的影响

通过大鼠短暂全脑缺血模型来探讨亚低温对大鼠脑缺血后细胞色素c(Cytoehrome c,CytC)释放及缺血性神经元凋亡的影响,揭示亚低温的部分神经保护机制.用原位细胞凋亡检测法(TUNEL染色)检测及电镜观察脑缺血后大鼠脑海马CAi区神经元凋亡发生情况;免疫组织化学法测定脑缺血后大鼠脑海马区神经元中细胞色素C释放情况.结果显示:①低温缺血组海马CAi区凋亡神经元数明显少于常温缺血组(P<0.01);②低温缺血3 h组海马CA1区神经元CytC阳性表达低于常温缺血3 h组(P<0.01).据此认为,全脑缺血后的迟发性神经元死亡很可能经由凋亡途径,而CytC激活、释放是缺血性神经元凋亡的一个关键事件.亚低温可抑制CytC的释放.推测经此途径减少缺血性神经元凋亡而发挥一定的神经保护作用.     

创伤性脑损伤后大鼠脑组织CtyC与AIF的变化及其对神经细胞的影响

目的 探讨创伤性脑损伤后大鼠脑组织中细胞色素C(ctyC)与凋亡诱导因子(AIF)的变化及其对神经细胞的影响.方法 70只SD大鼠按随机数字表法分为假损伤组(n=10)和脑损伤组,脑损伤组按伤后1、6、24、48、72和168 h观察时间点分为6个亚组(n=10).用Feeny氏自由落体撞击法制作重型颅脑损伤模型.利用免疫荧光和共聚焦显微镜技术测定损伤后不同时间点CtyC和AIF的荧光表达强度.用免疫荧光双标记技术观察损伤后24 h时CtyC及AIF对神经细胞的影响.结果 (1)脑损伤后脑组织中CtyC变化:伤后1、6、24、48 h,皮层CtyC分别增高为1.89±0.03、2.69±0.07、2.99±0.06、3.05±0.05,海马CtyC分别增高为1.34±0.04、1.87±0.03、2.60±0.03、2.80±0.06,明显高于假损伤组,差异有统计学意义(P<0.05).72h皮层与海马CtyC分别降为1.94±0.05及1.12±0.04,亦明显高于假损伤组,差异有统计学意义(P<0.05).168 h皮层与海马CtyC与假损伤组比较差异无统计学意义(P>0.05).(2)脑损伤后脑组织中AIF变化:伤后1、6、24、48 h,皮层AIF分别增高为1.82±0.16、2.16±0.34、2.75±0.22、2.87±0.12,海马AIF分别增高为1.27±0.06、2.01±0.05、2.49±0.02、2.62±0.05,明显高于假损伤组,差异有统计学意义(P<0.05).72 h皮层与海马AIF分别降为1.35±0.09及1.32±0.05,亦明显高于假损伤组,差异有统计学意义(P<0.05).168 h皮层与海马AIF恢复正常水平,与假损伤组比较差异无统计学意义(P>0.05).(3)CtyC与AIF都能引起神经细胞凋亡.结论 创伤性脑损伤后CtyC和AIF可从线粒体释放,并起到凋亡因子的作用,诱导神经细胞发生凋亡.     

亚低温对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护研究

目的观察亚低温对大鼠全脑缺血再灌注后海马CAI区神经元凋亡的影响,探讨亚低温对缺血再灌注脑损伤的保护作用。方法SD大鼠30只随机分为对照组（n=10）,常温缺血组（n=10）,亚低温组（n=10）,采用改良的Pulsinelli-Brierley4血管法建立全脑缺血再灌注动物模型,缺血30min后再灌注72h,尼氏体染色观察海马区存活锥体细胞数,TUNEL法检测缺血后海马CAI区神经元凋亡情况,电镜下观察神经细胞形态学改变。结果与对照组比较,常温缺血组的海马CAI区存活的锥体细胞数目减少（P〈0.01）;与常温缺血组比较,亚低温组海马CAI存活的锥体细胞数目明显增多（P〈0.01）。对照组、亚低温组的海马CAI区神经元凋亡数目和凋亡指数明显低于常温缺血组。在电镜下观察亚低温能明显减轻缺血后脑组织病理形态学的损害程度。结论亚低温可以抑制脑缺血再灌注后的神经细胞凋亡,对神经细胞有保护作用。     

心肺复苏大鼠神经元凋亡和内质网应激相关因子 GRP78及CHOP表达的变化

目的 研究心跳骤停复苏后大鼠脑内质网应激相关因子葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和 CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）表达的动态变化及其与神经元凋亡的关系,从而探讨内质网 应激与脑缺血再灌注损伤的机制。方法 将48只SD大鼠随机分为对照组和复苏组,采用经食道起搏诱 发室颤法制备大鼠心肺复苏模型;应用尼氏染色观察各组大鼠海马CA1区6 h、12 h、24 h、48 h存活神经 元形态;应用TUNEL染色法,观察各组大鼠海马CA1区神经元凋亡情况,并进行凋亡阳性细胞计数;应 用免疫组化法检测GRP78及CHOP抗原的表达、应用Western Blot法检测GRP78及CHOP蛋白的表达量。 结果 与对照组比较,复苏组大鼠海马CA1区神经元细胞变性更严重,出现凋亡细胞,随着再灌注时间 的延长,凋亡细胞明显增多。与对照组比较,复苏组GRP78阳性细胞于再灌注 6 h逐渐增多,于12 h明显 增高,此后表达逐渐减少;复苏组CHOP于再灌注6 h开始阳性细胞即有表达,逐渐增多,于再灌注 24 h 显著增加,直至48 h。结论 心跳骤停复苏后诱发内质网应激,早期通过上调促生存因子GRP78蛋白的 表达达到自我保护作用,晚期通过上调凋亡因子CHOP诱导神经元凋亡。