缺氧对体外培养的大鼠脑星形胶质细胞存活的影响

OBJECTIVE: To investigate the effect of hypoxia on the viability of rat brain astrocytes in vitro and determine the optimal duration of hypoxic treatment for studying the biological behavior of the in vitro cultured cells in response to hypoxia. METHODS: Rat astrocytes were cultured and identified by glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunofluorescent staining. After incubation with 5%; CO(2)+95%; N(2) for different time to induce hypoxia, the cells were harvested and observed microscopically for morphological changes and counting of the dead cells. The culture media of the cells were also collected and pO(2), concentrations of glucose and lactate as well as lactate dehydrogenase (LDH) activity were analyzed. RESULTS: As the hypoxia prolonged, the astrocytes appeared swollen and floating in the medium with some becoming necrotic. Compared with the cells in the control group, the changes in the number of necrotic cells, concentrations of glucose and lactate, and LDH activity in the cells of the hypoxic group were significantly different after 10 h of hypoxia (P<0.05). However, the flat and polygonal morphology of the astrocytes almost remained unchanged after 8 h of hypoxia in spite of significant changes in the concentrations of glucose and lactate and LDH activity. CONCLUSION: Hypoxia induced injury and necrosis of rat brain astrocytes in vitro, and 8 h of hypoxia can be the optimal time point for studying the biological behaviors of the cells in response to hypoxia.     

瘦素对缺血缺氧损伤脑星形胶质细胞凋亡的影响

目的 研究瘦素对缺血缺氧/复氧损伤星形胶质细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 制作缺血缺氧大鼠脑皮质星形胶质细胞损伤模型,MTT法检测星形胶质细胞活力;采用Annexin V-FITC试剂盒检测星形胶质细胞凋亡;RT-PCR和Western blot方法检测凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3的表达.结果 与缺血缺氧损伤组比较,瘦素干预组星形胶质细胞存活率升高(P<0.01)、凋亡率下降(P<0.01);抑凋亡基因bcl-2 mRNA和蛋白表达水平上调(P<0.01),促凋亡基因bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达水平下调(P<0.01),呈剂量依赖性.结论 瘦素能够使凋亡相关基因bcl-2表达上调、bax和caspase-3表达下调,从而抑制缺血缺氧损伤星形胶质细胞发生凋亡.     

VEGF对大鼠星形胶质细胞的缺氧保护作用及其机制

目的 观察缺氧对体外培养的大鼠星形胶质细胞的影响,探讨外源性血管内皮细胞生长因子（VEGF）对大鼠星形胶质细胞缺氧的保护作用及其可能的机制。方法 体外原代培养大鼠脊髓星形胶质细胞并鉴定（胶质原纤维酸性蛋白GFAP阳性）。星形胶质细胞分别经不同时间的缺氧处理、缺氧处理前加入不同浓度（10～100ng／ml）VEGF处理以及同时加入VEGF受体Flk一1阻断剂SU1498处理后,应用光镜、细胞计数、MTT法、TUNEL标记及免疫组化技术检测星形胶质细胞形态、细胞增殖活性和凋亡、VEGF和Flk-1的表达改变。结果 纯化培养1周的细胞,经鉴定其星形胶质细胞纯度达98％;8～12h缺氧可明显诱导星形胶质细胞活化,表现为细胞胞体变大、胞突变粗、GFAP表达升高,细胞增殖活性降低、凋亡指数增加、VEGF和Flk-1表达增加;缺氧处理前20～24h加入50ng／ml VEGF可使细胞活力明显增强,细胞凋亡指数明显降低,细胞缺氧损伤明显改善;而700ng／ml SU1498可明显阻断或抑制VEGF对星型胶质细胞的缺氧保护作用。结论 缺氧可诱导大鼠星形胶质细胞反应性活化,外源性VEGF可能通过VEGF受体Flk-1发挥对大鼠星形胶质细胞的缺氧保护作用。     

大鼠脑皮质星形胶质细胞的纯化培养

目的获取纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞，用于进一步实验。方法取新生大鼠大脑，用酶消化结合机械吹打方法分离皮质细胞制成细胞悬液，差速贴壁法去除成纤维细胞，培养融合时，恒温摇床振荡法去除少突胶质细胞、小胶质细胞等，纯化后，观察星形胶质细胞生长变化规律，并通过GFAP免疫细胞化学方法鉴定星形胶质细胞。结果大鼠脑皮质细胞接种后24h全部贴壁，部分细胞已伸出突起；3～5d时细胞增殖最明显，细胞数目增加，体积增大，突起相互交织成网状；原代培养7～10d时细胞基本融合并开始分层生长。振荡纯化处理后，GFAP免疫细胞化学染色阳性细胞可达98％。结论用差速贴壁和恒温振荡方法可获得高纯度皮质源性星形胶席细胸．     

缺氧处理后鼠脑星形胶质细胞基因表达谱的初步分析

目的：本实验利用基因芯片技术研究缺氧处理后鼠脑星形胶质细胞基因表达谱的变化，以深入认识星形胶质细胞在缺氧处理后基因表达变化规律，为进一步全面认识神经胶质细胞在缺血情况下基因变化规律以及神经胶质细胞与神经元在损伤条件下相互依存关系提供实验依据和理论基础。方法：用TRIzol试剂经过多个步骤提取各组制备好的星形胶质细胞样本总RNA；利用基因芯片技术获取缺氧处理后鼠脑星形胶质细胞的基因表达谱；利用Gene Ontology Consortium分析系统、Gene Cards数据库和Pubmed检索系统对基因表达谱进行初步分析。结果：基因表达谱：在基因芯片上测定了4096个点，共有差异表达基因153个，其中，已知差异表达基因45个，未知差异表达基因108个(EST片段)；己知差异表达基因：在45个已知差异表达基因中，表达下调的基因有22个，表达上调的基因有23个，未见报道的与缺氧处理相关基因28个，已报道的有17个；已知差异表达基因功能聚类：共8类。结论：本实验获得鼠脑星形胶质细胞缺氧处理后的基因表达谱；首次发现28个与缺氧相关的未见报道基因；初步明确已知差异表达基因在缺氧处理后的基本变化规律．     

大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法的改进

目的改进大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,获得纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞。方法取出生后1d内SD大鼠大脑皮质,用机械吹打法使细胞分散制成初细胞悬液,10μm尼龙膜过滤除去成纤维细胞后接种。待7d细胞铺满瓶底后,"十"字形震荡培养液5min后传代接种。传代2次后行GFAP免疫组化染色鉴定。结果通过微孔尼龙膜过滤和传代前"十"字形震荡培养液等操作可以得到形态典型、纯度较高的星形胶质细胞。通过纯度计算可得离体培养的星形胶质细胞的纯度平均值为95.49%(n=6)。结论改进的星形胶质细胞体外培养方法,降低了实验操作难度,方法稳定有效,得到的星形胶质细胞纯度较高。     

缺氧对大鼠脑星形胶质细胞释放NO、PGI2、TXA2、ET-1的影响

目的观察缺氧和(或)谷氨酸对星形胶质细胞释放一氧化氮(NO)、前列腺环素(PGI2)、血栓素A2(TXA2)及内皮素-1(ET-1)的影响.方法新生Wistar大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代、传代培养后,分为4组:对照组(c组),谷氨酸组(G组),缺氧组(H组)和缺氧 谷氨酸组(H G组).每组包括5个时相点:0、3、6、12、24 h(以缺氧后开始记时).G和H G组加入100μnol/L的L-谷氨酸.H和H G组用95%N2/5%CO2缺氧.到规定时间后,测培养上清中NO、6-酮-前列腺素F1α、TXB2、ET-1的含量.结果①培养上清中NO的含量,缺氧组、谷氨酸组及缺氧 谷氨酸组显著高于对照组,各组随时向延长(24 h内),培养上清中NO的含量上升.培养上清中NO升高的幅度,谷氨酸组、缺氧组、缺氧 谷氨酸组依次显著升高.②对照组及谷氨酸组星形胶质细胞PGl2的释放量无显著差异.缺氧组及缺氧 谷氧酸组星形胶质细胞PGI2的释放量显著高于对照组及谷氨酸组,且时间延长越长,增加越多(24h内).缺氧 谷氧酸组PGI2增高的幅度显著高于缺氧组.③缺氧和/或谷氨酸对各组各时相点星形胶质细胞释放TXA2及ET-1无显著影响.结论缺氧引起星形胶质细胞释放NO、PGI2增多,可能是缺氧脑血管舒张的机制之一.     

大鼠星形胶质细胞的体外培养与鉴定

目的探讨大鼠星形胶质细胞的最优体外培养方法与培养条件。方法采用差异贴壁等手段进行组织原代培养,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和即用型SP-9001免疫组化试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果镜下培养细胞生长多呈多彤性、扁平状,胞体较大,胞突较多较长,细胞核呈圆形或卵圆形,常偏于胞体的一侧,免疫组化染色显示细胞浆为掠褐色,细胞核为蓝色,呈阳性表达,星形胶质细胞的纯度在95％以上。结论本法可获纯度高、结构和功能良好的大鼠星形胶质细胞,可作为体外的细胞模型为研究细胞因子对其功能的调控作用奠定实验基础。     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法改良

目的建立大鼠大脑皮层星形胶质细胞(As)的培养方法,以进一步对大脑皮层As进行体外实验研究。方法在M cCarthy方法基础上改用出生后5 d的SD大鼠的大脑皮层,制备单细胞悬液后,接种于培养瓶,培养箱中1 h后换瓶,3 d后换液,细胞融合成单层后传代,传3代后采用间接免疫荧光法监测As特异性标志胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。阳性细胞确认为As。结果体外培养的大脑皮层As经历了贴壁、去除成纤维细胞、纯化和传3代,GFAP阳性细胞达95%以上。结论大脑皮层As体外培养成功,并有较高的纯度,为进一步进行As的研究创造了条件。     

肝细胞生长因子对星形胶质细胞缺氧缺糖损伤的影响

目的：研究肝细胞生长因子(HGF)对缺氧、缺糖诱导的星形胶质细胞（As）损伤及凋亡的影响。方法：以缺氧、缺糖来诱导原代培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞损伤。用不同终浓度（20～100ng/mL）的HGF处理星形胶质细胞,以乳酸脱氢酶（LDH）漏出率作为细胞损伤指标,四甲基偶氮唑盐（MTT）还原试验检测细胞活力,流式细胞术检测凋亡细胞,透射电镜观察细胞超微结构。结果：缺氧缺糖引起LDH漏出率增高,细胞活力下降,细胞凋亡率增高。HGF处理后,LDH漏出率降低,细胞活力增高,同时细胞凋亡率降低（P＜0.05）,最大效应剂量为60ng/mL。结论： HGF对星形胶质细胞缺氧缺糖损伤具有保护作用,能减少星形胶质细胞凋亡,并呈一定的剂量依赖关系。     

电针对体外培养星形胶质细胞机械性损伤后反应性胶质化的影响

目的观察电针对体外培养星形胶质细胞(Astrocyte,Ast)机械性损伤后反应性胶质化的影响。方法取新生3d龄SD大鼠的大脑皮层进行Ast原代培养,取第三、四代细胞制作细胞机械性损伤模型,电针刺激,用倒置相差显微镜及免疫细胞化学荧光染色观察细胞生长增殖,细胞形态及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达的变化。结果模型组Ast机械性损伤后,细胞增生,体积变大,GFAP表达增强。电针组较模型组细胞增生减少,细胞体积变化不大,GFAP表达较弱。结论电针刺激可以抑制体外培养Ast机械性损伤后的增生,降低细胞内GFAP的表达,即电针可以抑制Ast的反应性胶质化。     

Study on Remodeling of Astrocytes in Facial Neuclus after Peripheral Injury

To observe the glial reactions surrounding facial motor neurons following facial nerve anastomosis. At 1,7,21 and 60 d following facial nerve anastomosis, the recovery process of facial movement was observed, the glial fibrillary acidic protein （GFAP） immunoreactivity was analyzed by a combined method of fluorescent retrograde tracing and immunofluorescent histochemical staining, and the uhrastructure of astrocytes were observed under a transmission electron microscope （TEM）, respectively. Postoperatively the function of facial muscles could not return to normal, often accompanied with hyperkinetic syndromes such as synkinesis at the late stage. Motor neurons in every facial subnucleus could be retrogradely labeled by fluoro-gold （FG）, and displayed an evident somatotopic organization. Normally there was a considerable number of GFAP-positive cells in nonnucleus regions but few inside the facial nucleus region. Postoperatively the GFAP immunoreactivity in the anastomotic side increased significantly, but gradually decreased at the late stage. The ultrastructure of astrocytes in our experiment showed that the sheet-like process of astrocytes invested and protected the injured facial motor neurons. The present study shows that reactive astrocytes undergo some characteristic changes during the process of facial nerve injury and regeneration. The plastic change at the late stage may be involved in the mechanism of synkinesis.     

异氟烷对新生大鼠皮质星形胶质细胞形态和幼鼠行为学的影响

目的：探讨长时间吸入低浓度异氟烷对新生大鼠皮质星形胶质细胞的形态及幼鼠空间学习和记忆能力的影响。方法43只新生Wisrar大鼠随机分成两组,I组吸入1.1％的异氟烷6 h,C组吸入压缩空气和氧气的混合气体6 h,两组均维持吸入氧浓度为30％。在吸入麻醉后12、24、72、168 h两组分别取5只幼鼠,灌注取脑后用免疫荧光法标定星形胶质细胞,用Image J软件分析星形胶质细胞形态学的改变。在吸入异氟烷后6周,记录剩余幼鼠的存活率并将剩下的动物进行Morris水迷宫实验测试其空间学习和记忆能力。结果与C组相比,I组12 h和24 h激活星形胶质细胞的数目减少（P＜0.05）,12 h时抑制状态的星形胶质细胞的数目明显上升（P＜0.05）,其余时间点两组之间星形胶质细胞数目差异无统计学意义。两组幼鼠定位航行实验和空间探索实验结果差异无统计学意义。结论长时间吸入低浓度异氟烷会导致星形胶质细胞形态的暂时性改变,但是对于幼鼠成年后的认知功能无明显影响。     

星形胶质细胞在糖尿病脑病中的变化及作用

糖尿病可引起中枢神经系统病变,功能上表现为学习和记忆能力的减退,病理学证实脑内结构和功能改变,即糖尿病脑病。星形胶质细胞是中枢神经系统的重要组成部分,数量庞大且功能广泛。现已发现,在糖尿病的早期,脑内星形胶质细胞就已发生改变,表现为细胞体积和数量的变化,随后相继发生糖原、能量供应、递质转运体和酶活性、以及炎症介质和神经营养因子释放的改变,对糖尿病脑病的发生可能有重要作用。     

星形胶质细胞活化后瞬时受体电位通道6在TBI中的作用

目的 探讨大鼠颅脑损伤(TBI)后星形胶质细胞(AST)瞬时受体电位通道(TRPC)6在TBI中扮演的角色.方法 将健康成年雄性SD大鼠39只分为假手术组、致伤组和去铁胺(DFX)组,每组13只.参照Feeney法建立大鼠大脑冲击伤模型,完成Morris水迷宫实验、大脑缺损体积,免疫荧光检测TRPC6与神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)共表达,以及Western blot定量检测TRPC6水平.结果 DFX组比致伤组大鼠大脑缺损体积明显减小[(115.35±13.70)mm3 vs.(209.99±16.70)mm3,P＜0.05],Morris水迷宫实验发现DFX组平台搜索策略[(3.13±0.35)分]和搜索时间[(36.15±26.63)s]均较致伤组[(2.13±0.64)分和(110±47.34)s]明显改善(P＜0.05).免疫荧光双标发现DFX组GFAP高表达,且与TRPC6共表达增多.Western blot定量检测发现DFX组TRPC6明显下调(P＜0.01).结论 大鼠TBI早期DFX治疗后AST活化,TRPC6高表达,进而起到神经保护作用.     

BDNF对脊神经根结扎大鼠脊髓背角星形胶质细胞活化的影响

目的观测脊神经根结扎(SNL)大鼠脊髓背角中脑源性神经营养因子(BDNF)与星形胶质细胞活化标记蛋白胶质细胞纤丝酸性蛋白(GFAP)表达的变化,以及BDNF清除剂TrkB/Fc对GFAP表达和疼痛的影响。方法取18只SD大鼠,随机分为空白对照组、假手术组和SNL组(n=6)。分别于术前、术后第1～6天测定大鼠50%机械缩爪阈值(50%PWT),末次测定后取腰膨大处脊髓背角经Western blotting检测GFAP和BDNF的表达。另取18只SD大鼠,随机分为对照组、SNL+安慰剂组和SNL+TrkB/Fc组(n=6),其中对照组仅行鞘内置管术;SNL+安慰剂组和SNL+TrkB/Fc组分别在行SNL术前,予鞘内注入PBS或TrkB/Fc 10μL,术后1次/d×6 d,每次注药前1 h测定50%PWT,末次给药后1 h取大鼠腰膨大处脊髓背角经Western blotting检测GFAP的表达。结果术后第1～6天,SNL组手术同侧后肢50%PWT均较术前基础值显著下降(P<0.01);术后第6天,SNL组手术同侧脊髓背角BDNF和GFAP表达均较空白对照组显著升高(P<0.01);SNL+TrkB/Fc组大鼠手术同侧50%PWT与基础值比较无明显变化(P>0.05),手术同侧脊髓背角GFAP表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BDNF活化的脊髓星形胶质细胞对SNL诱发的神经病理性疼痛具有调控作用。     

新生大鼠缺氧缺血后不同脑区神经元变性的动态观察

目的：观察新生大鼠缺氧缺血（HI）后不同脑区神经元变性的动态变化,探讨其与星形胶质细胞反应的关系。方法：采用Fluoro-Jade B（FJB）染色法及免疫组化法分别观察变性神经元荧光染色强度及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的动态变化。结果：正常新生大鼠各脑区内均未见FJB阳性细胞,GFAP呈弱表达。HI后1d即可见FJB阳性细胞,3d阳性细胞增多,5d达高峰,以纹状体受累最重,皮质次之,海马各区易损顺序为CA1、CA4、CA2、CA3、齿状回。GFAP表达的强度与FJB阳性细胞数密切相关。结论：新生大鼠HI后脑易损部位为纹状体、皮质、海马,FJB染色是一种标记变性神经元的有效方法,反应性胶质细胞增生是应答神经元损伤的结果。     

大鼠脑皮层星形胶质细胞培养与鉴定

目的：介绍一种新的脑组织星形胶质细胞培养方法，为进一步研究奠定基础。方法：常规分离纯化星形胶质细胞，将其低密度种植，维持在含10％新生牛血清DMEM培养基中培养，并在长时期内不给予更换或补加培养液。利用GFAP—FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。结果：经原代及传代培养，获得大量几乎为单一种类细胞，其特点为细胞突起细长、胞体明显缩小、形态多样，最后细胞突起之间相互连接形成星形胶质细胞网络，并在相当长的时间内保持不变。GFAP—FITC免疫荧光染色为强阳性。结论：在限制细胞种植密度和限制给予培养液的培养条件下星形胶质细胞的体外形态发育与在体的情形基本一致，提示该细胞培养方法可能有助于研究中枢神经系统中星形胶质细胞的生理功能。