利用家蚕丝腺表达人干扰素 -w 的研究

目的 建立家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的平台,并评估家蚕中表达的外源蛋白的实用性.方法 将人干扰素-w基因(huIFN-w),构建到来源于鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的piggyBac转座子基础载体中,以家蚕中部丝腺特异表达基因Ser1为启动子,眼睛和神经特异表达的增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为报告基因,构建家蚕中部丝腺特异表达载体pBac[ser1-huIFN-w,3xp3-EGFP].经显微注射入产后1-3h的大造(蚕种系大造P50)早期胚胎,筛选阳性个体.并对阳性个体进行分子和蛋白水平检测.结果 获得了家蚕转基因阳性个体,huIFN-w基因在家蚕中部丝腺高量转录表达,重组蛋白huIFN-w具有一定的抗细胞增殖活性.结论 利用家蚕丝腺生物反应器表达的huIFN-w蛋白正确并具有生物活性,表明可将家蚕丝腺作为“生物工厂”,大量和高效生产高附加值外源蛋白,同时也为生物制品的大量推广和应用奠定理论基础.     

脂质体介导的hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 观察脂质体介导的人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后mRNA及其蛋白的表达.方法 采用脂质体介导的真核细胞转染技术,将含hBMP-2编码序列的真核表达质粒转染兔BMSCs,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化及免疫印迹法(Western blot)等手段检测转染后hBMP-2 mRNA及其蛋白的表达.结果 通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因转入兔BMSCs,并经RT-PCR、免疫组化和蛋白印迹法证实,转染pcDNA3.1-hBMP-2 后的兔BMSCs内有大量hBMP-2 mRNA 的转录和蛋白的表达.结论 通过脂质体介导的真核转染方法可以将外源hBMP-2基因转染BMSCs,并使其获得较为稳定的表达.     

包涵体蛋白复性的研究进展

包涵体是指外源重组蛋白在细胞内凝集的无活性的固体颗粒。经分离、洗涤除去一些膜蛋白或膜碎片后,用适宜试剂溶解,如高p H值加低浓度的尿素缓冲液、不同羟基的醇类或含小分子的变性剂。传统的稀释、透析等复性方法效率一般较低,目前可通过高静水压、沸石的高通量筛选及高通量筛选结合实验设计软件的方法提高复性效率。希望可以找到一种适于所有重组蛋白的高效、简便的复性方法,实现不易获得的外源重组蛋白简易的规模化生产。     

髓鞘碱性蛋白的研究进展及其在胶质瘤中的应用

髓鞘碱性蛋白是中枢神经系统特有的蛋白质,目前髓鞘碱性蛋白的测定已经大量应用于临床,对于疾病的诊断及预后有较为重要的意义,大量的研究表明,髓鞘碱性蛋白与颅脑胶质瘤的关系十分密切,目前对于胶质瘤的治疗尚无有效治疗手段,临床上主要以手术治疗为主,但效果却不尽人意,是否可以通过对某些基因进行基因沉默从而抑制相应蛋白质的表达而达到治疗手段成为目前治疗胶质瘤的热点,本文将对髓鞘碱性蛋白结构、功能、作用及其对颅脑胶质瘤的影响做一综述。     

毕赤酵母高效表达外源基因的研究进展

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,Pp)表达系统是目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一[1,2].酵母被认为是一个很有前途的真核表达系统而受到广泛的关注.本文综述了Pp在生物学特性、遗传学特征、载体、基因整合、胞内表达和分泌表达、影响外源蛋白在Pp表达系统中高效生产因素的研究进展.     

噬菌体肽库技术及在肿瘤研究中的应用

噬菌体展示肽库技术是一种用于筛选蛋白、多肽的强有力的生物技术,将外源蛋白与噬菌体外壳蛋白融合而表达于噬菌体颗粒表面,被展示的外源蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性。目前,此技术已被广泛应用于生命科学研究的不同领域,尤其在肿瘤的诊断和治疗方面。     

聚乙二醇化干扰素治疗慢性丙型肝炎

将聚乙二醇(PEG)化学连接于治疗蛋白质能增加血浆半衰期、减少毒性、增强药物的稳定性和溶解性.PEG结合蛋白质通过减少免疫系统发现和攻击外源物的能力以增加其治疗效果.由活化的PEG单体与蛋白质偶联制备PEG蛋白结合物,这种偶联策略有多种选择.PEG化干扰素-α用于治疗慢性丙型肝炎病毒性感染已进行了大量临床研究工作,并获得肯定的疗效.已有3种PEG蛋白结合物被FDA批准,临床应用于治疗严重的复合性免疫缺陷病和治疗各种白细胞增多症.     

转基因DT40细胞导入早期鸡胚后的分布及绿色荧光蛋白表达的研究

目的 为了研究经过基因修饰的体细胞导入到禽类胚胎以后,供体细胞及外源基因是否能在受体胚胎中成活并且外源基因是否可以长期表达.方法 筛选得到稳定整合绿色荧光蛋白基因的鸡DT40细胞作为外源蛋白的运载工具,通过血管微注射的方法将其导入到于38.5℃温度条件下孵化65～70 h的鸡胚中,并将操作后的鸡胚在原孵化条件下继续孵化.在孵化的不同时期取移植了DT40细胞的嵌合体胚胎在荧光显微镜下观察荧光细胞的存活与分布情况.并通过PCR以及免疫组织化学方法检测供体细胞在受体中的位置以及绿色荧光蛋白的表达情况.结果 荧光标记的DT40细胞可以存活于受体不同的组织器官中,包括:脑、心脏、肝脏等.导入胚胎的整合外源基因的DT40细胞可以存活到胚胎出雏之前,并且外源基因能够正常表达.结论 可以通过此方法将外源基因导入到受体中,并使目的 蛋白在受体胚胎中持续表达,为胚胎期导入外源蛋白诱导免疫耐受的研究以及将转基因细胞移植到动物体内生产目的 蛋白的研究提供科学依据和技术平台.     

外源蛋白在毕赤酵母表达系统中高效表达的培养条件的优化策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的真核外源蛋白表达系统之一。本文从培养基的成分、培养温度、培养基的pH值，溶解氧的量和甲醇浓度等角度对国内外在毕赤酵母表达系统中高效表达外源蛋白的培养条件的优化策略做了较详细的综述．     

Delta1-IRES-EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体.方法利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES-EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1-IRES-EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP E86和PA317,嘌呤霉素(puromycin)筛选获得阳性表达克隆;"乒乓球"法提高病毒滴度;重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞仪(FACS)及RT-PCR法分别检测细胞荧光和Delta1 mRNA表达变化;C2C12共培养实验检测蛋白的功能.结果酶切、PCR鉴定及DNA测序证实逆转录病毒表达载体pDelta1-IRES-EGFP构建正确;经体外包装,获得最高滴度9.7×105 CFU/ml的重组病毒液;重组病毒液感染NIH3T3细胞,FACS检测部分细胞荧光强度显著提高;RT-PCR证实细胞内有外源基因Delta1表达;C2C12共培养实验证实外源蛋白Delta1可抑制C2C12细胞的分化.结论逆转录病毒基因转移系统安全,效率较高,可获得外源基因长期、稳定的表达.     

噬菌体随机肽库技术与寄生虫病免疫诊断

噬菌体随机肽库技术是 2 0世纪 90年代发展起来的一项新型基因表达筛选技术。 1 985年Smith[1]首先利用基因工程手段 ,将外源DNA片段 (基因 )插入到噬菌体外壳蛋白基因组中 ,使外源基因所编码的氨基酸序列与噬菌体外壳蛋白一起 ,以融合蛋白形式呈现于噬菌体表面。从而形成特定长度不同序列的肽段集合 ,这些表达有各种外源肽段的众多噬菌体便组成了噬菌体随机多肽文库。由于被展示的外源蛋白或多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性 ,并能被相应的抗体或受体识别[2 ] ,因此 ,利用靶分子 (抗体、酶、细胞表面受体等 )与表达在噬菌体表面的…     

Livin基因在肺癌中的研究进展

Livin基因是近年发现的一种新的凋亡抑制蛋白（IAPs）家族成员.由于其首先在黑色素瘤中被发现,故也称为ML-IAP;而且也是通过IAP同源序列从人类肾基因组cDNA文库中筛选克隆获得,故又称为KIAP.Livin在大多数正常成人组织中并不表达,但在某些肿瘤组织和细胞中却高表达.目前,关于Livin与肺癌的关系已越来越受关注,以Livin为基础的各种手段有可能成为肺癌早期诊断和药物靶向治疗的新方法.本文现就Livin基因在肺癌中的研究进展综述如下.     

间充质干细胞在放射医学中的研究前景

随着核能在军事和民用领域的广泛使用,放射医学已成为一门重要学科。而目前对放射损伤的治疗效果却不理想。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)由于具有易分离获得、可在体外大量扩增且仍保持增殖与多向分化潜能、可归巢到损伤部位、低免疫原性、易于外源基因转染和表达、可分泌多种细胞生长因子利于组织修复等优点,将其应用于放射损伤的治疗具有广阔应用前景。本文主要介绍MSCs在放射损伤治疗中的应用前景及辐射对MSCs生物学特性的影响。     

噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达,融合蛋白则表达在病毒颗粒的表面,而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内.噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系,可以通过检测病毒内部的DNA,使得各种靶分子的多肽配体通过淘选的体外选择程序而快速鉴定.其在生物医学的诸多领域有着...     

阑尾炎单病种患者的费用分析

目的分析实行医保单病种后医保病人与非医保病人阑尾炎治疗的费用差距,提出对医保进一步改革的思索.方法用Excel 2003建数据表,对我院2005年2月至2006年8月期间收治的单病种收费阑尾炎患者和非单病种收费患者的费用和并发症进行分析并进行统计学处理.结果阑尾炎治疗并发症发生率及痊愈率在两组间无显著性差异,费用比较两组间差异显著.结论目前的单病种收费标准基本可以满足临床治疗阑尾炎的需要,同时在实行单病种收费后可以节约大量医疗费用.如进一步扩大单病种范围,用经济手段调动医院的自律机制,医疗费用有进一步下降的空间.     

人糖皮质激素受体GRα基因表达载体的构建和GRα蛋白的表达

目前检测糖皮质激素受体采用的是放射配体法[1,2],存在着放射污染、实验结果不稳定、需血量大(6～7 ml)等问题,因此建立一种简便、无放射污染、需血量少、易于推广的检测方法显得很重要.而ELISA检测法基本符合以上条件.要建立ELISA检测法,首先须表达糖皮质激素受体蛋白.人糖皮质激素受体(hGR)有hGRα和hGRβ两种不同的蛋白,hGRα可与糖皮质激素结合而发挥生理作用,而hGRβ不能与糖皮质激素结合,因此无生理活性[3,4].目前hGRα蛋白的表达多采用真核细胞表达,此种表达方式虽能保持蛋白的天然空间结构而具有生理活性,但要大量制备并纯化却存在困难.本研究拟构建可诱导的hGRα基因表达载体,并大量表达hGRα蛋白,为hGRα ELISA检测法的建立奠定基础.     

噬菌体展示技术应用于肿瘤的研究进展

噬菌体肽库展示技术是一种用于筛选功能性多肽的生物技术.编码多肽的外源DNA片段与噬茵体表面蛋白的编码基因重组后,以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达出多肽序列,通过与特定的靶标反应.使展示特定蛋白的噬菌体从佑表达有各种外源性蛋白的噬茵体肽库中筛选出来,通过感染大肠杆菌使选择出的噬茵体扩增,然后进行序列测定,获得相应的结构和功能信息,实现了高通量筛选,成为一种有效的分子筛选方法.     

探寻我国卫生事业改革的突破口

面对目前的卫生改革困境,提出居高的次均医疗费用是目前的众多矛盾的汇集之处.降低次均医疗费用要着力于医疗费用上涨的微观基础.为此作者提出了医疗机构竞争性获得补偿的理论,切断医院补偿与经营收入的直接联系,不仅可以降低次均医疗费用,转化医疗机构运行机制,还能有助于其他卫生问题的解决.     

金黄色葡萄球菌多药耐药调节基因MgrA蛋白的纯化

目的:获得大量重组MgrA蛋白,为深入研究其功能提供必要的材料.方法:用构建好的含有目的基因mgrA的His融合表达载体,转化大肠杆菌感受态细胞,在IPTG诱导下进行高密度发酵,对所得蛋白进行纯化、复性,以SDS-PAGE凝胶电泳检测鉴定其特性.结果:①表达诱导菌体的裂解上清经金属螫合亲和层析,聚丙烯酰胺凝胶电泳证实获得初步纯化的蛋白中仍含一些杂蛋白.②重组获得多个蛋白洗脱峰,再经聚丙烯酰胺凝胶电泳法证实获得纯度较高的目的蛋白.结论:获得了纯化的MgrA蛋白重组蛋白.     

利用蛋白转导技术将α-烯醇化酶导入心肌细胞的实验研究

目的 探讨将外源α-烯醇化酶导入心肌细胞的可行性,为后续的蛋白功能研究奠定基础.方法 原代培养WKY乳鼠心肌细胞,将纯化的α-烯醇化酶与蛋白转导载体Charoit共孵育后转染心肌细胞,同时设置阳性对照β-半乳糖苷酶转染组,光镜下计数转染阳性细胞的百分率;蛋白免疫印迹检测细胞总蛋白中α-烯醇化酶的表达;荧光共聚焦显微镜下观察α-烯醇化酶的亚细胞定位.结果 Charoit能够将外源蛋白成功导入原代培养的心肌细胞中,光镜下可见β-半乳糖苷酶的导入效率约为81%,Western blot结果表明外源α-烯醇化酶成功导入了心肌细胞,免疫荧光显示导入的外源α-烯醇化酶与内源α-烯醇化酶相似,主要定位于胞浆.结论 利用Charoit介导的蛋白转导技术能够成功将外源α-烯醇化酶导入心肌细胞.