构建的人白细胞介素ⅡcDNA表达载体在肝癌细胞中的表达

为进一步开展人白细胞介素Ⅱ（ＩＬ－２）基因修饰的肿瘤疫苗的研究,在已构建的人白细胞介素ⅡｃＤＮＡ表达载体（ｐｃＤＮＡ１／ＩＬ）的基础上,利用脂 本,将其引入人肝癌细胞檄７７２１,通过Ｇ４１８抗性筛选获得阳性克隆,用活细胞计数法检测阳性克隆的细胞培养上清中的Ｌ１－２活性,结果表明ｐｃＤＮＡ３／ＩＬ－２转染的７７２１细胞氛发泌的ＩＬ－２水平明显高于阳性对照ｐＢｃ１２／ＨＩＶ／ＩＬ－２转染的７７２１细胞     

利用杆状病毒载体在昆虫细胞中表达人白细胞介素2

利用杆状病毒载体在昆虫细胞中表达人白细胞介素２金立杰刘东升薛伟钢将人白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ在ＢａｍＨⅠ－ＰｓｔⅠ位点插入到苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的转移载体ｐＶＬ１３９２中。经ＢａｍＨⅠ、ＰｓｔⅠ、ＸｂａⅠ、ＥｃｏＲⅤ等限制...     

应用重组PCR技术克建人单链白细胞介素12融合基因

目的 构建人单链白细胞介素１２（ｈｓｃＩＬ－１２）融合基因并在真核细胞中进行表达,为进一步研究ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法 应用重组ＰＣＲ技术将ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位两段编码序列的ｃＤＮＡ通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３碱基序列进行前后拼拼（ＩＬ－１２ｐ４０－多肽接头－ｐ３５）,构建ｈｓｃＩＬ－１２融合基因,并进行核苷酸序列测定,进一步将ｈｓｃＩＬ－１２融合基因插入ｐｃＤＮＡ３．１真核表达载体中,转染ＣＯＳ－７细胞表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白,并行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 该融合基因经ＤＮＡ序列分析表明：ｐ４０、ｐ３５、ｌｉｎｋｅｒ的连接顺序、方向及序列完全正确,融合基因可在ＣＯＳ－７细胞中表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示该融合蛋白分子     

人白细胞介素6逆转录病毒表达载体的构建

实验以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌｋｓ质粒为载体，构建了人白细胞介素６次级克隆ｐＢＩＬ－６。用限制性内切ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＩＬ－６，分离并回收了ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段，并在其平未端加入了ＢａｍＨＩ接头。实验将带有ＢａｍＨＩ粘性末端的ＩＬ－６全基因片段插入到了逆转录病毒载体ｐＺＬＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１的ＢａｍＨＩ位点上，构建了重组质粒ｐＺＬＰＩＬ－６。经对重组予ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳、限制住内切酶分析和核酸杂交鉴定，筛选出了含有ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段及插入方向正确的ｐＺＬＰＩＬ－６。     

恶性疟原虫疫苗研究VIPfCMR基因与人白细胞介素-2基因的连接与克隆

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ将恶性疟原虫复合抗原基因ＰｆＣＭＲ从质粒ｐＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ中切下，插入质粒ｐＢＶ２２０／ＩＬ－２中人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因的ＥｃｏＲＩ位点。重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，通过ＰＣＲ扩增和酶切鉴定，筛选出正向插入的重组载体ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２。为表达ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２融合蛋白打下基础。     

人IL-12的克隆、表达及生物活性的鉴定

目的：克隆中国人ＩＬ－２ｐ４０基因,构建ＩＬ－１２的真核基因表达载体。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ从北京地区人脐血树突状细胞（ＤＣ）中克隆ＩＬ－１２ｐ４０ｃＤＮＡ基因,并进行序列分析。利用ｐｃＤＮＡ３．１和ｐＬＸＰＸＳＮ构建ＩＬ－１２表达载体,转染人肝癌细胞后对其进行生物学和免疫学分析。结果：北京地区人ＤＣ中ＩＬ－１２ｐ４０ｃＤＮＡ基因２１０位密码子有独特的结构,为ＧＣＣ（Ａｌａ）。并且２３９和２９１位     

HL-60细胞中IL6基因的克隆及鉴定

目的：为探索性构建重组人白细胞介素６－绿脓杆菌外毒素融合蛋白（ＩＬ６－ＰＥ４０）以选择性杀伤高表达ＩＬ６受体（ＩＬ６Ｒ）的白血病细胞,本研究试图从人急性早幼粒细胞白血病细胞株（ＨＬ－６０）中克隆Ｎ－末端缺失２４个氨基酸的人ＩＬ６基因（ＩＬ６ｃＤＮＡ）并构建含此基因的重组质粒。方法：根据ＩＬ６基因序列设计合成可扩增ＩＬ６ｃＤＮＡ的特异性引物;利用基因重组技术,构建含ＩＬ６基因的重组质粒ｐＵＣ－ＩＬ６。结果与结论：本文首次从ＨＬ－６０中扩增出预期４８０ｂｐ的ＩＬ６ｃＤＮＡ,将其克隆至ｐＵＣ１８质粒中,命名为ｐＵＣ－ＩＬ６,并经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ双酶切电泳及序列分析鉴定加以确证,为进一步构建重组人ＩＬ６－ＰＥ４０奠定了坚实基础。     

IL—11 cDNA—逆转录病毒载体的构建及亲本细胞系的转染

本文采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导法，将构建的带有白细胞介素１１（ＩＬ－１１）ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体导入制备人Ｂ细胞杂交瘤的亲本细胞系ＨＦ２、Ａｇ８．６５３和Ｓｐ２／０中，Ｇ４１８筛选稳定表达的抗性细胞，经克隆化后获得稳定分泌ＩＬ－１１的新型亲本细胞系。     

人重组IL—1受体拮抗剂在大肠杆菌的高效表达

利用ＰＣＲ技术从分裂素刺激的人外周血细胞ｃＤＮＡ文库扩增出人白细胞介素－１受体拮抗剂（ｈＩＬ－１ｒａ）的成熟分子编码区ｃＤＮＡ，将其克隆化插进高效表达的质粒载体ｐＫｐＬ－３α后，在大肠杆菌中高效表达出ｒｈＩＬ－１ｒａ，其Ｎ端序列与预期结果一致。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，ｒｈＩＬ－１ｒａ的表达量占菌体蛋白的３０％以上。体外试验证明，该表达产物对单核细胞衍生的ＩＬ－１活性有明显抑制作用。     

小鼠白细胞介素6的cDNA克隆及其在昆虫细胞中的表达

本文采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＬＰＳ刺激后的小鼠腹腔巨噬细胞，扩增小鼠ＩＬ－６ｃＤＮＡ，并克隆构建ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）ＩＬ－６质粒，继将小鼠所得ｃＤＮＡ克隆到ｐＶＬ１３９２载体上，利用杆状病毒ＡｃＮＰＶ表达系统在Ｓｆ９中进行瞬间表达，用ＩＬ－６依赖细胞株ＭＨ６０·ＢＳＦ２检测其表达活性，结果表明，感染后４８ｈ后就具有明显ＩＬ－６表达，由此可见，利用该系统可成功地表达小鼠ＩＬ－６基因。     

免疫刺激DNA及IL-2表达质粒对乙肝病毒DNA疫苗诱导抗体的影响

分别将含免疫刺激ＤＮＡ序列（ＩＳＳ）的质粒ｐＵＣ１９、ｐｃＤＮＡ３及编码ＩＬ ２的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３ ＩＬ ２,与乙肝病毒ＤＮＡ疫苗共同注射于小鼠胫前肌内。定量检测免疫小鼠体内ＨＢｓＡｇ的表达及血清中抗ＨＢｓ的水平。结果显示：ｐＵＣ１９、ｐｃＤＮＡ３及ｐｃＤＮＡ３ ＩＬ ２对乙肝病毒ＤＮＡ疫苗在肌肉内表达ＨＢｓＡｇ无影响或有抑制,但它们均能显著促进疫苗诱导抗体的产生（Ｐ＜００１）,抗体水平的增加与ＩＳＳ的数量呈剂量反应关系。     

复制缺陷型人IL-2重组腺病毒的制备与鉴定

目的将人ＩＬ－２的重组腺病毒载体与Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ末端肽复合物同源重组，高效制备人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒，并进行体外表达和活性检测。方法将含全部编码序列的人ＩＬ－２ｃＤＮＡ置于真核表达载体ｐＣＩｃｃ的ＣＭＶ启动子下游，切出含ＣＭＶ启动子、人ＩＬ－２ｃＤＮＡ和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号肽序列的ＣｌａＩ片段，插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘｌｏｗ，选择左向转录的人ＩＬ－２重组腺病毒载体ｐＡｘｌｃｗ．ＣＩｈＩＬ－２与经ＥｃｏＴ２２Ⅰ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞；通过同源重组获得人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒；体外转染人宫颈癌ＨｅＬａ细胞、人Ｔ细胞淋巴瘤Ｈｕｔ７８细胞和原代人皮肤成纤维细胞。结果扩增到的病毒滴度达２．１×１０９ＰＦＵ／ｍｌ；体外转染的人肿瘤细胞均检测到ＩＬ－２的表达（４００～２６００Ｕ／１０６细胞／２４小时）。结论所制备的复制缺陷型重组腺病毒能有效介导人ＩＬ－２的基因转移，可望用于肿瘤基因治疗的临床研究。     

人PBMC中IL—18基因的克隆及在E.coli中的高效表达与纯化

从一名丙型肝炎病人的外周血单个核细胞分别克隆了前体和成熟人白细胞介素－１８的基因,并应用大肠杆菌表达系统,成功地表达了重组ｈＩＬ－１８的前体和成熟蛋白,从人ＰＢＭＣ中提取总ＲＮＡ,用ｐｌｙ（Ｔ）８－１２反转录成ｃＤＮＡ,再以ＰＣＲ扩增出特异ＤＮＡ片段。利用Ｅ．ｃｏｌｉ表达载体ｐＱＥ－３０,构建分别表达ｈＩＬ－１８前体和成熟蛋白的重组质粒ｐＱＥＩＬ１８ｐ和ｐＱＥＩＬ１８ｍ,转化Ｅ．ｃｏｌｉＭ１５后,     

人可溶性IL-6R基因在CHO细胞中的表达及活性分析

人白细胞介素６受体（ＩＬ６Ｒ）由胞外区、跨膜区和胞浆区三部分组成,其介导信号传导的功能主要由胞外区执行,通常将这一区域称为可溶性ＩＬ６Ｒ（ｓＩＬ６Ｒ）,其全长３５８个氨基酸,相对分子质量约为５×１０４。将天然人ｓＩＬ６Ｒ基因克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点之间,得到重组质粒ｐＣＤ６Ｒ,经酶切鉴定插入基因的大小为１ｋｂ。将重组质粒与空载体分别转染ＣＨＯ细胞,收集４８小时之后的瞬时表达上清,作作者单位：１００８５０北京,军事医学科学院基础医学研究所ＥＬＩＳＡ检测…     

登革2型病毒NGC株E基因在NIH3T3细胞中的表达？…

目的 构建登革２型病毒Ｅ基因的真核表达载体,实现登革病毒Ｅ蛋白的真核表达。方法 采用逆录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增登革２型病毒（ＮＧＣ株）包膜糖蛋白Ｅ基因全长片段,克隆人真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的Ｐｃｍｖ启动子下游,构建重组真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｅ,用脂质体转染法转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,表达产物以免疫荧光、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹进行分析检测。结果 成功构建了重组真核表达质粒ｐｃＤＮ     

小鼠白细胞介素18的基因克隆及其融合蛋白的表达

白细胞介素１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １８，ＩＬ－１８）是一种能诱导ＩＦＮ－γ产生的新型细胞因子，在调节Ｔｈ１型细胞免疫应答中起重要作用。采用逆转录ＰＣＲ从活化的小鼠腹腔巨噬细胞中获得了小鼠ＩＬ－１８（ｍＩＬ－１８）ｃＤＮＡ，测序鉴定正确的片段经ＥｃｏＲＩ酶切后克隆入ＧＳＴ融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，再转化至大肠杆菌ＤＨ５ａ高效表达，经纯化获得了有活性的ｍＩＬ－１８融合蛋白。     

HIV—1 env与hIL—2基因在重组痘苗病毒中的共表达研究

以痘苗病毒复制非必需区血凝素基因为侧翼,将编码人白细胞介素２的基因片段克隆到真核表达质粒ｐＪ３８ｅｎｖ的下游,构建成吸ＨＩＶ－１ ｅｎｖ和ｈＩＬ－２两种外源基因的重组表达质粒ｐＪ３８Ｅ－ＩＬ－２,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选,获得了重组痘苗病毒ｖＪ３８Ｅ－ＩＬ２。     

含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

人核糖体磷酸蛋白P2基因的克隆及鉴定

利用聚合酶链式反应技术（ＰＣＲ），从人肺巨细胞癌ＰＬＡ－８０１母系细胞系统克隆化高转移细胞株Ｄ中特异性扩增Ｐ２ ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ２ ｇｅｎｅ ｃＤＮＡ），并将扩增产物克隆入ｐＧＥＭ－３Ｚ载体，获得了重组质粒ｐＭＰ２，对其中两个克隆ｐＭＰ２－１、ｐＭＰ２－２的Ｐ２ ｃＤＮＡ进行了序列分析。结果表明：ｐＭＰ２－１的Ｐ２ｃＤＮＡ序列与文献报道基本     

携带hIL-2cDNA的逆转录病毒载体的构建及其在人肝癌细胞中的特异表达研究

将人白细胞介素２（ｈＩＬ-２）ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ＭＮＳＭ的ＰＬ位点　，分别构建了转录受ＳＶ４０早期启动子和人甲胎蛋白增强子调控的重组逆转录病毒载体ＭＮＳＩ和ＭＮＳＩＡ。用脂质体转染法将ＭＮＳＩ和ＭＮＳＩＡ分别转导ＰＡ３１７包装细胞，测质粒转染率为（５～２０）×１０~(－３)克隆／μｇＤＮＡ·１０~６细胞，病毒感染率为（５．４～４５０）×１０~４ＣＦＵ／ｍｌ。重组病毒在４μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下感染人肝癌细胞、肾癌细胞和黑色素瘤细胞，Ｎｅｏ~Ｒ克隆经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证明ｈＩＬ－２ｃＤＮＡ转入人肿瘤细胞并整合，　Ｒ　ＮＡ斑点杂交及ＩＬ－２活性表达分析证明，人甲胎蛋白增强子可促进异源启动子启动ｈＩＬ－２ｃＤ－ＮＡ在合成甲胎蛋白的人肝癌细胞中高效特异转录和表达。该研究对肝癌特异性免疫增强基因治疗有重要意义。