重组人骨形成蛋白—2成熟肽在大肠杆菌中的高效表达

利用大肠杆菌系统高效表达人骨形成蛋白－２成熟肽。方法；将编码人骨形成蛋白２成熟肽的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体ｐＤＨ上，使其受控于ＰＲＰＬ启动子，构建成表达质粒ｐＤＨＢ２ｍ，以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌。对工程菌进行温度诱导表达，表达产物初步纯化后进行复性处理，用小鼠肌袋模型检测产物诱骨活性。     

重组人成骨生长肽对化疗小鼠白细胞减少的影响

目的 研究重组人成骨生长肽(rhOGP)对环磷酰胺(Cy)化疗损伤小鼠白细胞减少的影响;观察rhOGP对人肺腺癌Anip细胞和人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响.方法 用Cy腹腔注射每日100mg/kg,连续3d,造成小鼠的化疗损伤模型.拮抗实验中,分别给予低、高剂量的rhOGP,连续13d,采用皮下注射给药途径,于第0d、第4d(Cy造模后)、第9d、第14d检测外周血白细胞(WBC)数变化.预防实验中,分别给予rhOGP、DTT与生理盐水,连续10d,并于第8、9、10d同时给予Cy,分别于实验前、实验后记取外周血WBC数.利用MTT法和细胞生长曲线观察rhOGP对人肺腺癌Anip细胞和人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响.结果 rhOGP能促进Cy损伤小鼠WBC数的恢复,高、低剂量组间略有差异.rhOGP能明显降低Cy损伤小鼠外周血白细胞减少的幅度.rhOGP对人肺腺癌Anip细胞及人胃癌SGC-7901细胞的增殖无明显促进作用.结论 rhOGP可促进Cy损伤小鼠外周血白细胞的恢复,rhOGP对Cy化疗小鼠白细胞数减少有预防作用,且对人肺腺癌Anip细胞和人胃癌SGC-7901细胞的增殖无促进作用,提示rhOGP作为肿瘤治疗辅助用药的潜在价值.     

成骨生长肽促成骨作用的研究进展

成骨生长肽（OGP）具有促成骨作用,具有较大的潜在临床应用价值,是国内外研究的热点。动物体内实验和体外细胞实验表明,OGP能促进骨密度增加,加速骨折愈合,促进体外培养大鼠成骨细胞的成骨功能,增加核心结合因子α1、Ⅰ型胶原mRNA表达水平,促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,上调成骨标志物的表达。文章对OGP促成骨作用的研究进展进行综述。     

成骨生长肽促成骨作用的研究进展

成骨生长肽（OGP）具有促成骨作用,具有较大的潜在临床应用价值,是国内外研究的热点。动物体内实验和体外细胞实验表明,OGP能促进骨密度增加,加速骨折愈合,促进体外培养大鼠成骨细胞的成骨功能,增加核心结合因子α1、Ⅰ型胶原mRNA表达水平,促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,上调成骨标志物的表达。文章对OGP促成骨作用的研究进展进行综述。     

成骨生长肽对钛表面人牙周膜成纤维细胞增殖分化影响的研究

目的:研究成骨生长肽(Osteogenic growth peptide,OGP)对人牙周膜成纤维细胞(Periodontal ligament cells,PDLCs)在钛金属表面增殖分化的影响.方法:将纯钛试件放在12孔培养板内,取生长良好的第五代人牙周膜成纤维细胞接种在试件表面,加入不同浓度的OGP(10-11～10-7mol/L),分别在接种后1、3、5、7 d应用MTT法检测细胞增殖;接种后3、7、10 d应用酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性的表达.结果:OGP在该浓度范围内时,对钛表面的人牙周膜成纤维细胞的增殖率有明显的促进作用(P＜0.05),并且能促进细胞内ALP表达活性(P＜0.05),最佳作用浓度为10-9mol/L.结论:OGP可促进钛片表面人牙周膜成纤维细胞的增殖活性,同时可以增强细胞碱性磷酸酶表达的活性,提示OGP在口腔种植领域中具有良好的应用前景.     

重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发...     

人神经生长因子基因在大肠杆菌中的表达

OBJECTIVE: To investigate the structure and function of human nerve growth factor (beta-NGF) and the gene encoding beta-NGF. METHODS: A pair of specific primers (29 mer) for the sequence encoding human beta-NGF was designed and synthesized. A 380 bp fragment was amplified from human blood genomic DNA by polymerase chain reaction, and cloned into pGEM-T Easy vector. The identified insert fragment from the recombinant pGEM-T-NGF was directionally ligated with linearized pGEX-5T with the compatible termini. E. coli JM 109 was transformed with the expression recombinant p5TNGF and induced by IPTG. RESULTS: The cloned DNA fragment was identified as the full-length sequence encoding human beta-NGF by restriction analysis and DNA sequencing. SDS-PAGE and Western blot revealed the cloned NGF gene expressed as a fusion protein (40.5 x 10(3) u) in the cells transformed by p5TNGF. The soluble fusion protein was determined to be 503.2 mg/L, accounting for 6.8% of the total soluble protein (7.4 g/L) of bacterial cells. This fusion protein was found to have antigenic activities of NGF. CONCLUSION: The clone containing the full-length sequence encoding human beta-NGF is obtained and successfully expressed in E. coli to be of use for studying the biological functions of human beta-NGF gene.     

成骨生长肽促进大鼠骨量增加的作用

目的 探讨成骨生长肽（ＯＧＰ）对骨量增加的作用。方法 采用低钙饲料饲养成为骨质疏松模型的５０只ＳＤ大鼠,随机分为５组,每组１０只,分别皮下隔日注射,Ａ组（低剂量ＯＧＰ）、Ｂ组（高剂量ＯＧＰ）、Ｃ组（人降钙素）、Ｄ组（鲑鱼降钙素）和Ｅ组（生理盐水）对照,共１２周。测定血清碱性磷酸酶（ＡＬＰ）、骨钙素（ＢＧＰ）、骨密度（ＢＭＤ）、扫描电和透射电镜观察。结果 ＯＧＰ治疗组碱性磷酸酶、骨钙素和骨密度明显增     

成骨生长肽促进大鼠骨量增加的作用

探讨成骨生长肽（ＯＧＰ）对骨量增加的作用。方法采用低钙饲料饲养成为骨质疏松模型的５０只ＳＤ大鼠,随机分为５组,每组１０只,分别皮下隔日注射,Ａ组（低剂量ＯＧＰ）、Ｂ组（高剂量ＯＧＰ）、Ｃ组（人降钙素）、Ｄ组（鲑鱼降钙素）和Ｅ组（生理盐水）对照,共１２周。测定血清碱性磷酸酶（ＡＬＰ）、骨钙素（ＢＧＰ）、骨密度（ＢＭＤ）,扫描电镜和透射电镜观察。结果ＯＧＰ治疗组碱性磷酸酶、骨钙素和骨密度明显增高（Ｐ＜０．０１）,扫描电镜观察到Ａ、Ｂ组骨小梁粗大、完整、间隙小,表面光滑,对照组骨小梁变细、断裂,空隙大。透射电镜观察到Ａ、Ｂ组成骨相骨细胞较多,Ｅ组退变相骨细胞较多。结论ＯＧＰ能刺激成骨细胞的活性,能提高骨量,有可能成为治疗骨质疏松症的有效药物     

合成成骨生长肽对大鼠骨髓基质干细胞的促成骨作用

目的研究合成成骨生长肽（sOGP）对体外培养的大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的作用,并与经典的成骨诱导剂地塞米松相对比。方法取大鼠股骨骨髓,贴壁法分离骨髓基质干细胞进行体外培养,加入不同浓度的sOGP,观察细胞形态变化,细胞增殖率,细胞内碱性磷酸酶（ALP）的表达,RT—PCR法检测3种主要成骨标志物（ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素）的表达,组织化学染色检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的表达及钙质的沉积并进行图像分析。结果sOGP对BMSCs增殖的影响随浓度不同呈现双向作用。sOGP和地塞米松在mRNA和蛋白水平均能促进各成骨标志物的表达,定量分析结果显示,sOGP在10^-9mol／L浓度组促成骨的作用最强,明显高于对照组和地塞米松组。结论sOGP能明显促进大鼠BMSCs向成骨方向转化。这种促成骨能力与其浓度密切相关,以10^-9mol／L浓度下促成骨能力最强。     

人内皮活化相关新基因eola1的原核表达及鉴定

目的获得内皮高表达脂多糖相关因子1(eola1)表达蛋白并对其进行分析鉴定.方法采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法从人ECV-304细胞中扩增出eola1基因开放阅读框,构建重组质粒,测序鉴定后转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,裂解细菌抽提蛋白,目的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western免疫印迹鉴定.结果测序鉴定eola1开放阅读框成功插入PET-46-EK/LIC质粒;重组质粒在大肠杆菌中成功表达人eola1蛋白,主要以包涵体形式存在,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子质量约20×103,Western blot验证出目的蛋白特异表达.结论应用原核表达系统能够成功获得目的蛋白,为下一步制备eola1单克隆抗体及基因功能研究打下基础.     

Soluble expression of active human β-defensin-3 in Escherichia coli and its effects on the growth of host cells

Background Human β-defensin-3 （HBD3） is an epithelial peptide that has been demonstrated to have a salt-insensitive broad spectrum of potent antimicrobial activity. Expressing antimicrobial peptides in Escherichia coil （E. colt） is very difficult for it can result in death of the bacterial host cells. Our aim was to establish a prokaryotic system expressing soluble HBD3 protein and demonstrate the antimicrobial activity of the expressed protein. We then studied whether the host cells would activate the suicide pathways. Methods We first cloned the complementary DNA coding for the mature chain of HBD3, inserted it into the vector PGEX-KG then transformed E. coil BL21 （DE3） with the appropriate recombinant plasmid. After induction with 0.5 mmol/L isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside （IPTG） the transformed E. cofiproduced a recombinant glutathione S-transferase and HBD3 （GST-HBD3） fusion protein. The fusion protein was treated with thrombin to produce pure HBD3 protein then the antimicrobial activity of HBD3 was evaluated in a liquid microdilution assay. Results The fusion protein GST-HBD3 was efficiently cleaved by thrombin and yielded HBD3 that had anti-staphylococcus aureus activity with a minimal inhibitory concentration level of 12.5 μg/ml. The E. coil strain expressing the recombinant protein did not grow slower than the empty vector strain. Conclusion Active HBD3 in E. coil by expressing the recombinant protein GST-HBD3 could be produced, and suicide did not occur in the E. coli strain expressing the recombinant protein.     

人肿瘤蛋白D52重组融合蛋白的原核表达及特性鉴定

目的:表达人肿瘤蛋白D52(human tumor protein D52,hTPD52)的重组融合蛋白,并对该蛋白的生物学特性进行鉴定?方法:RT-PCR扩增乳腺癌MCF-7细胞中的hTPD52基因并克隆于pMD18-T载体中,测序鉴定序列正确后,分别插入pET-32a?pGEX-4T-2和pET-28a 3种表达载体中?重组质粒经酶切鉴定?序列分析正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),选择最佳表达载体和表达条件进行大量表达,表达产物经His柱亲和纯化和超滤浓缩后,应用Dot blot?Western blot鉴定纯化蛋白的特性?结果:正确扩增出了hTPD52基因,鉴定其为isoform 3型?用pET-32a-hTPD52重组表达载体能够大量表达可溶性的hTPD52-Trx融合蛋白,Dot blot显示表达的融合蛋白能和抗hTPD52的抗体结合,SDS-PAGE和Western blot显示表达的融合蛋白分子质量约为44 ku,去除Trx后仍能够与特异性抗体结合?结论:成功制备hTPD52重组融合蛋白,并证明原核表达的hTPD52保留了原有的抗原结合活性?     

人颗粒溶解素cDNA克隆及在大肠埃希菌中的表达

目的：构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA原核表达载体并进行表达。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术获得颗粒溶解素cDNA，克隆到pGEM-T载体，测序正确后，再亚克隆到质粒pGEX-4T1中，构建重组表达载体pGEX-4T1-granulysin，并转化大肠埃希菌DH5α，诱导GST-granulysin融合蛋白表达。结果：诱导含重组表达载体pGEX-4T1-granulysin的大肠埃希菌DH5α后，免疫印迹显示出一条相对分子量(Mr)为44000的蛋白条带。结论：获得了颗粒溶解素与GST的融合蛋白,为进一步的工作打下了基础。     

在大肠杆菌中以融合蛋白高效表达基因工程产品人心钠素

目的 构建以融合蛋白形式在大肠杆菌中高效表达心钠素的重组质粒,稳定高效地获得基因工程产品心钠素。方法 采用PCR和亚克隆技术构建带有心钠素的融合基因并在大肠杆菌中高效表达融合蛋白。利用操纵子重复克隆提高表达量,以凝血酶切割融合蛋白释放心钠素小肽并通过柱层析纯化蛋白质。检定产品的各项理化指标和大鼠的体内降压,体内利尿和体外舒张血管等药理活性。结果 构建了4个高效表达和心钠素融合蛋白的质粒,分别含1-4个目的基因串联操纵子;通过温度诱导表达后,该系列表达的目的分别为菌体总蛋白的46%、54.8%、56.1%和60.1%;提取纯化包涵体形式的融合蛋白后,以凝血酶切割释放心钠素,再经纯化分离出心钠素,实验室摇瓶发酵每升培养液可获3mg以上的纯度大于96%的产品,产品具有利尿,降压和舒张血管的药理活性。结论 利用融合基因的克隆与表达成功地研制了人心钠素基因工程产品。     

小鼠IL-35基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-35（IL-35）基因并在大肠杆菌中表达和纯化。方法用RT-PCR方法从小鼠脾脏扩增出IL-35的两个亚基Ebi3和p35的成熟肽基因片段,采用重叠PCR法将Ebi3基因和p35基因通过（Gly4Ser）3接头连接,得到的融合基因片段先克隆于pMD19-T载体,再亚克隆到表达载体pET-30b（＋）,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测目的蛋白,用Ni螯合层析方法纯化表达产物。结果从小鼠脾细胞总RNA中扩增出Ebi3和p35的基因片段,重叠PCR法得到的融合基因经鉴定含预期序列;构建的重组表达载体pET-30b（＋）-IL-35在BL21（DE3）中经IPTG诱导后表达出约50kd的融合蛋白;West-ern blot检测结果显示,该融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应;经Ni螯合层析方法纯化获得单一蛋白条带。结论小鼠IL-35在大肠杆菌中表达并纯化,为进一步研究其功能及应用价值奠定了良好的基础。     

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的: 构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。 方法: 以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。 结果: 经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。 结论: 成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。     

结缔组织生长因子特异性结合肽的表达及分离纯化

目的:利用基因工程技术获得与结缔组织生长因子(CTGF)特异性结合的小肽。方法:设计并合成带有肠激酶切割位点的基因片段,插入pET-32(a) 质粒载体中硫氧化还原蛋白基因下游,构建重组质粒,转入E.coliBL21表达菌中,用终浓度1mmol.L-1的IPTG诱导表达融合蛋白;用热变性和硫酸铵分级沉淀对融合蛋白进行初步纯化,然后用亲和层析进一步纯化,经肠激酶切割,最后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽;用反相色谱对所获小肽进行纯度鉴定。结果:所构建的重组质粒测序结果与预期一致;诱导表达后用SDS-PAGE鉴定,发现在相对分子质量20 000处有浓密的表达条带出现,与预期一致;融合蛋白用热变性和硫酸铵分级沉淀进行初步纯化,得率分别为78.6%和52.3%;用亲和层析纯化得率为50.5%;经肠激酶切割后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽,用反相色谱鉴定其纯度大于95%;最终每升发酵液获得3.4 mg目的肽。结论:成功制备CT-GF特异性结合肽,为进一步研究该小肽的生物学活性打下基础。     

人源与鼠源神经生长因子信号肽引导β-内啡肽分泌表达的差异

目的:考察人源神经生长因子信号肽序列是否具有介导β-内啡肽分泌性表达的作用,以及人源与鼠源神经生长因子信号肽的作用效率是否存在差异。方法:构建2个分别利用人或鼠的信号序列介导β-内啡肽分泌表达的真核表达载体pcDNA3.1-hEP和 pcDNA3.1-mEP;脂质体法转染NIH3T3细胞,转染48 h后分别收集细胞培养上清液、细胞,以及细胞呈单层生长的盖玻片。收集的上清液用RIA法测定β-内啡肽的浓度;收集的细胞提取总RNA,一步法RT-PCR检测融合基因的mRNA的转录;长有细胞的盖玻片处理后进行细胞免疫荧光染色。结果:RT-PCR的结果显示,所构建的融合基因在NIH3T3细胞内发生了表达,β-内啡肽主要分布在NIH3T3细胞的胞质内。pcDNA3.1-hEP和 pcDNA3.1-mEP分别转染NIH3T3细胞48 h后,细胞培养上清β-内啡肽的浓度分别是（280.33±24.16） pg/ml和（191.04±7.96） pg/ml,有显著的统计学差异（P<0.05）,且与空白对照之间均有显著的统计学差异（P<0.01）。结论:人源神经生长因子信号肽序列能够介导β-内啡肽蛋白的分泌性表达,且作用效率要优于鼠源信号肽。