乌萸汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞INHB、FSHR mRNA及分泌功能的影响

[目的]运用血清药理学方法观察乌萸汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞抑制素(INHB)、促卵泡激素受体(FSHR)mRNA的表达及其分泌功能的影响。[方法]在大鼠卵巢颗粒细胞培养体系中加入乌萸汤、尿促卵泡激素(FSH)及正常大鼠含药血清,培养48h后,分别用酶联免疫吸附法(ELISA),逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及放免法测定颗粒细胞INHB、FSHR、mRNA及培养液中雌二醇(E2)含量。[结果]各用药血清组E2含量较对照组均明显升高;颗粒细胞INHB、FSHRmRNA表达量明显增多,其中乌萸汤中剂量血清组效果优于西药组。[结论]乌萸汤含药血清能明显促进卵巢颗粒细胞INHB、FSHRmRNA的表达以及E2分泌,说明乌萸汤可以通过调控卵巢局部因子、增强FSHRmRNA的表达从而提高卵巢对促性腺激素的反应性,改善下丘脑-垂体-卵巢轴,促进E2的分泌,以促进卵泡发育成熟及排出。     

补肾调冲方含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞增殖与分泌及其FSHR mRNA表达的影响

目的：运用血清药理学方法观察补肾调冲方对大鼠卵巢颗粒细胞增殖与分泌功能及其FSHR mRNA表达的影响.方法：在大鼠卵巢颗粒细胞培养体系中加入空白或含药血清,培养48小时后,用放免法测定各组颗粒细胞培养液中E2、P含量,流式细胞仪测定各组颗粒细胞的细胞周期分布及增殖指数（PI）,用Real-time RT-PCR方法实时定量测定颗粒细胞FSHR mRNA的表达量.结果：补肾调冲方血清组E2、P含量较空白血清组均明显升高,G0/G1期细胞均明显减少,而S期细胞及PI值则明显增高;颗粒细胞FSHR mRNA表达量明显增多,且随剂量增加而作用增强.结论：补肾调冲方含药血清能明显促进卵巢颗粒细胞的增殖与甾体激素分泌功能以及FSHR mRNA的表达,从而增强含药血清中所含促性腺激素对颗粒细胞的作用及颗粒细胞对促性腺激素的反应性.这也是补肾调冲方调节卵巢功能的作用机理之一.     

乌萸汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞ERK1／2 MAPK信号转导途径的影响

目的运用血清药理学方法观察乌萸汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞（Gc）细胞外调节蛋白激酶（ERKl／2MAPK）信号转导途径的影响。方法在大鼠（GC）细胞培养体系中分别加入乌萸汤大鼠含药血清、卵泡刺激素（FsH）大鼠含药血清及正常大鼠血清,培养48h后,用蛋白质印迹法（Westernblot）测定各组大鼠Gc的ERK1／2磷酸化蛋白的相对表达量。结果各用药组GCERK1／2磷酸化蛋白相对表达量均明显升高,其中乌萸汤低剂量、中剂量血清组升高多于西药组,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论乌萸汤含药血清能通过提高ERK1／2蛋白磷酸化水平促进Gc增殖,可以通过使用乌萸汤调控ERK1／2促进卯泡发育、成熟及排出。     

补肾调冲方含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞增殖、激素分泌和mRNA表达的影响

目的 运用血清药理学方法观察补肾调冲方对大鼠卵巢颗粒细胞增殖、激素分泌功能以及抑制素B (INHB)、胰岛素样生长因子-1 (1GF-1) mRNA表达的影响.方法向培养的SD大鼠卵巢颗粒细胞中分别加入10％空白血清(对照组)、人转基因重组促卵泡激素(hFSH)含药血清(阳性对照组)、补肾调冲方含药血清(补肾调冲方组),培养48 h,以闪烁计数器测定3H-TdR掺入DNA的量,流式细胞仪测定细胞周期分布,放射免疫法测定培养液中雌二醇(E2)和孕激素(P)水平,并采用RT-PCR法测定1NHB、IGF-1 mRNA的表达量.结果补肾调冲方含药血清可剂量相关地促进3H-TdR掺入颗粒细胞DNA的量.与对照组相比,补肾调冲方各含药血清组G0/G1期细胞均明显减少,而S期细胞则明显增多;E2、P的量明显升高;颗粒细胞INHB、IGF-1 mRNA表达量均明显增多,且呈剂量相关性.结论补肾调冲方含药血清能明显促进卵巢颗粒细胞的增殖、增强甾体激素的分泌功能,该作用可能通过增强INHB、IGF-1基因的表达,从内分泌和自分泌两条途径调节卵巢功能而实现的.     

养精种玉汤对高雄激素培养的卵巢颗粒细胞PCNA、StAR、FSHR mRNA与蛋白表达的影响

目的观察养精种玉汤对高雄激素培养的卵巢颗粒细胞（GC）增殖细胞核抗原（PCNA）、类固醇激素合成急性调节蛋白（STAR）与促卵泡生成素受体（FSHR）mRNA及其蛋白表达的影响。方法以原代培养猪卵巢GC为实验对象。分别将促卵泡生成素（FSH）、养精种玉汤加入受过量丙酸睾酮处理的GC培养体系中。48h后,利用RT-PCR和Western blot分别检测PCNA、StAR、FSHRmRNA及其蛋白表达量。结果过量雄激素抑制GC的PCNA、StAR、FSHRmRNA及蛋白的表达,养精种玉汤和FSH能逆转雄激素的抑制作用,促进GCPCNA、StAR、FSHRmRNA与蛋白的表达。结论养精种玉汤有拮抗过量雄激素对PCNA、StAR、FSHRmRNA及其蛋白表达的抑制作用,推测养精种玉汤通过促进PCNA、StAR、FSHRmRNA与蛋白的表达以及拮抗过多雄激素的负作用,改善卵泡发育异常。     

补肾调经方含药血清对体外培养的人卵巢颗粒细胞FSH/cAMP-PKA通路的影响

目的通过补肾调经方含药血清对体外培养的人卵巢颗粒细胞卵泡刺激素／环磷酸腺苷-蛋白激酶A（follicle stimulating hormone／cyclic adenosine monophosphate-protein kinaseA,FSH／cAMP-PKA）通路的影响,探讨补肾调经方改善卵巢内分泌功能可能的分子机制。方法收集行体外受精一胚胎移植（In vitro fertilization-embryo transfer,IVF．ET）患者卵泡液,提取颗粒细胞进行原代细胞培养24h,以低、中、高剂量补肾调经方人、大鼠含药血清以及正常人、大鼠血清分别与体外培养的人卵巢颗粒细胞共同孵育48h,分为补肾调经方低、中、高剂量组以及对照组。采用放射免疫方法测定培养液中雌二醇（estrogen,E2）、孕酮（progesterone,P）、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）的水平,采用蛋白印迹法和Real-timePCR分别检测卵泡刺激素受体（follicle stimulating hormone receptor,FSHR）蛋白和FSHR、P450芳香化酶（P450 aromatase,P450arom）mRNA在颗粒细胞的表达。结果人含药血清组：与对照组比较,补肾调经方中、高剂量组培养液中E2、cAMP水平均明显升高（P〈0．05）,补肾强经方中剂量纽P明显降低（P〈0．01）;补肾调经方中、高剂量组卵巢颗粒细胞FSHR蛋白及其mRNA表达均明显增高（P〈0．01）,P450芳香化酶mRNA表达显著升高（P〈0．05,P〈0．01）。大鼠含药血清组：与对照组比较,补肾调经方中、高剂量组E2均升高（P〈0．01）,cAMP明显升高（P〈0．05,P〈0．01）,补肾调经方中剂量组P明显降低（P〈0．01）;补肾调经方中、高剂量组人卵巢颗粒细胞FSHR蛋白及其mRNA表达均增高（P〈0．01）,P450芳香化酶mRNA表达明显升高（P〈0．05,P〈0．01）。结论补肾调经方可能通过调节卵巢颗粒细胞FSH／cAMP-PKA通路的主要效应分子FSHR、cAMP、P450arom、E2,促进卵巢颗粒细胞的内分泌功能。     

补肾调冲方含药血清对高雄激素培养大鼠卵巢颗粒细胞增殖与分泌的影响

目的 运用血清药理学方法观察补肾调冲方对高雄激素培养的大鼠卵巢颗粒细胞增殖与分泌功能的影响。方法 根据血清药理学方法,用6周龄的未成年SD大鼠制备促卵泡生成素（FSH）及大、中、小剂量补肾调冲方含药血清,分别加入过量丙酸睾丸酮处理的颗粒细胞培养体系中。培养48h后,测定^3H-TdR掺入DNA的量,并用流式细胞仪检测细胞周期分布及增殖指数（PI）,放免法测定颗粒细胞培养液中雌二醇（E2）、孕酮（P）水平及细胞内环磷酸腺苷（cAMP）含量。结果 高雄激素明显抑制颗粒细胞的增殖与分泌功能,并明显降低了细胞内cAMP的含量;而补肾调7中方含药血清可改善高雄激素对颗粒细胞功能的抑制状态,促进细胞增殖及E2、P的分泌,其作用呈剂量依赖性。结论 补肾调冲方含药血清可有效拮抗高雄激素对颗粒细胞功能的抑制作用,推测补肾调冲方通过促卵泡发育、提高雌、孕激素水平,改善雌／雄激素比值来调节卵巢功能。     

补肾促排方对大鼠卵巢颗粒细胞黄体生成素受体和卵泡刺激素受体的影响

目的通过体外实验阐述补肾促排方治疗多囊卵巢综合征的药理学作用机制。方法提取与鉴定大鼠卵巢颗粒细胞,提取补肾促排方水溶液。实验分为补肾促排方低、中、高剂量组和空白对照组,分别相应处理分离与鉴定的大鼠卵巢颗粒细胞24 h后提取mRNA,48 h后提取蛋白。通过RT-PCR和Wester-blot法分别检测各组黄体生成素受体(LHR)和卵泡刺激素受体(FSHR)mRNA和蛋白表达水平。结果补肾促排方水溶液能够显著上调大鼠卵巢颗粒细胞LHR和FSHR mRNA和蛋白表达水平(P均<0.05),且呈现显著的浓度梯度依赖效应。结论补肾促排方通过上调卵巢颗粒细胞LHR和FSHR的表达,促进卵泡的发育与排出,从而起到治疗多囊卵巢综合征的作用。     

左归饮对围绝经期大鼠卵巢促卵泡激素受体表达的影响及机制

目的探讨左归饮对围绝经期大鼠卵巢促卵泡激素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)表达的影响及机制。方法采用围绝经期大鼠动物模型,分别给予低、中、高剂量左归饮灌胃处理8周,用RT-PCR和免疫组化法检测卵巢FSHR mRNA及蛋白的表达。未成年大鼠注射孕马血清后收集培养卵巢颗粒细胞,用RT-PCR方法检测给予不同处理因素后FSHR mRNA的表达水平。结果(1)围绝经期大鼠卵巢FSHR的表达明显低于青年组(P0.01),给予不同剂量左归饮处理后,FSHR表达均显著升高(P0.01)。(2)培养颗粒细胞给予不同处理因素,结果显示,与对照组相比,左归饮提取物可促进FSHR mRNA表达(P0.01);与单纯加入左归饮提取物相比,同时加入左归饮提取物和福司考林(Forskolin)可进一步促进FSHR mRNA的表达(P0.01),同时加入左归饮提取物和酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein则能明显削弱左归饮的促进作用。结论左归饮可通过上调围绝经期大鼠卵巢FSHR的表达,提高卵巢对卵泡刺激素的反应性,改善围绝经期卵巢功能。左归饮对FSHR mRNA表达的促进作用可能是通过激活腺苷酸环化酶-蛋白激酶A(cAMP-PKA)及酪氨酸蛋白激酶途径实现的。     

大豆异黄酮对围绝经期大鼠卵巢FSHR表达的影响

目的：观察大豆异黄酮（SI）对围绝经期大鼠卵巢促卵泡激素受体（FSHR）表达的影响,初步探讨大豆异黄酮作用于卵巢的分子机制。方法：采用自然老化法建立围绝经期大鼠动物模型,分别给予低剂量（50mg/kg）、中剂量（158mg/kg）、高剂量（500mg/kg）的SI灌胃处理8周。采用放射免疫分析法（RIA）检测血清FSH水平,RT-PCR检测卵巢组织中FSHRmRNA的表达。结果：与青年对照组相比,围绝经期模型组大鼠血清FSH水平有所升高（P〈0.05）,卵巢FSHRmRNA表达显著降低（P〈0.01）。与模型组相比,各SI组血清FSH水平的降低无统计学意义（P〉0.05）,卵巢FSHRmRNA的表达量则显著升高（P〈0.05或P〈0.01）。结论：一定剂量的大豆异黄酮虽不能降低围绝经期大鼠血清FSH水平,但可明显上调衰老卵巢FSHRmRNA的表达。     

二至天癸颗粒含药血清对初老小鼠卵巢颗粒细胞分泌功能的影响

目的观察二至天癸颗粒含药血清对初老小鼠卵巢颗粒细胞体外分泌功能的影响。方法采用血清药理学方法，以不同含药量的初老小鼠血清，与体外培养的颗粒细胞共同培养48h，观察二至天癸颗粒含药血清对初老小鼠卵巢颗粒细胞雌激素（E2）、孕酮（P）分泌量（化学发光免疫测定法）以及抑制素B（INHB）分泌量（ELISA法）的影响。结果二至天癸颗粒含药血清可明显增加颗粒细胞E2、P、INHB的分泌量。结论二至天癸颗粒可通过调节颗粒细胞的分泌功能进而改善初老小鼠卵巢功能。     

更年汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞PI3K/Akt/m TOR通路的影响

目的研究更年汤对围绝经期模型大鼠颗粒细胞磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素蛋白(m TOR)信号通路的影响。方法 10～14月龄雌性SD大鼠150只,筛选出围绝经期模型大鼠,随机分为模型组、替勃龙组(0.22 mg/kg)和更年汤低、中、高剂量(1.0、2.0、4.0 g/kg)组,连续ig给药15 d,1次/d,第15天后采血,制备大鼠含药血清;3～4月龄雌性SD大鼠120只,筛选出动情前期老鼠,剔出卵巢行体外颗粒细胞原代培养,分别用各组含药血清培养液培养颗粒细胞,72～120h后用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测颗粒细胞中PI3K、Akt、m TOR、生长分化因子9(GDF9)、翼状螺旋转录因子2(FOXL2)mRNA表达水平;Western blotting法检测PI3K、Akt、mTOR、GDF9、FOXL2蛋白表达。结果与模型组比较,替勃龙组和更年汤各剂量组卵巢颗粒细胞中PI3K、m TORm RNA和蛋白表达水平均显著升高(P0.05、0.01),Akt mRNA和蛋白表达水平显著降低(P0.05、0.01),GDF9、FOXL2 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P0.01)。结论更年汤含药血清在临床剂量上可提高卵巢颗粒细胞PI3K、mTOR的表达,抑制Akt及其下游的GDF9、FOXL2表达,从而推测更年汤可调节卵泡的生长发育,抑制卵泡闭锁、改善卵巢功能。     

中药胃康宁对胃癌细胞周期因子Cyclin E、CDK2和p27表达的影响

目的:观察中药胃康宁含药血清对胃癌细胞Cyc lin E、CDK2(Cyc lin dependant k inase 2,CDK2)和p27mRNA及其蛋白表达的作用。方法:分别以高、中、低不同剂量的胃康宁制剂对W istar雄性大鼠进行灌胃,制备含药血清,然后分别用不同剂量组含药血清培养胃癌细胞,采用免疫组织化学SABC法检测各组胃癌细胞中Cyc linE、CDK2和p27蛋白的表达,RT-PCR法检测各组胃癌细胞中Cyc lin E、CDK2和p27 mRNA的表达。结果:免疫组化法结果显示,胃康宁高、中、低剂量组Cyc lin E和CDK2灰度值均有明显升高,与空白对照组比较,P<0.05~0.01,而p27灰度值则显著降低(P<0.05~0.01);RT-PCR结果显示,与空白对照组比较,胃康宁低、中、高剂量组均能明显降低Cyc lin E和CDK2 OPTD I值(P<0.05~0.01)。同时,还能升高p27 OPTD I值(P<0.05~0.01)。结论:中药胃康宁可抑制胃癌细胞周期因子Cyc lin E、CDK2及其mRNA的表达,促进细胞周期抑制因子p27及其mRNA的表达,这可能是胃康宁抑制胃癌细胞生长的机制之一。     

益骨胶囊含药血清对SD大鼠成骨细胞分泌NO、NOS的影响

目的:观察益骨胶囊含药血清对体外培养的大鼠成骨细胞(OB)表达NO、NOS的影响.方法:(1)将40只12月龄SD大鼠分为益骨胶囊组(高、中、低剂量组)和生理盐水对照组,制备含药血清和对照血清;确定最佳灌胃剂量组和最佳血清添加浓度.(2)分离、培养新生SD大鼠的颅骨成骨细胞,传至第3代后分为2组(含药血清组和空白血清对照组),分别在培养24 h、48 h和72 h后用RT-PCR和试剂盒检测OB表达NOSmRNA的量及其活性变化和OB分泌NO的量.结果:益骨胶囊含药血清组在24h、48 h和72 h时OB表达NOSmRNA的量及其活性和分泌NO的量均明显高于空白血清对照组(P＜0.01或P＜0.05).结论:益骨胶囊含药血清能促进OB NO的分泌和NOS的表达,提示这可能是该方防治骨质疏松的机理之一.     

养精种玉汤对多囊卵巢综合征大鼠模型卵巢颗粒细胞分泌功能的影响

目的观察养精种玉汤对母体高雄激素环境建立的子代实验性多囊卵巢综合征(PCOS)模型大鼠血清雌二醇(E2)、睾酮(T)、17-羟孕酮(17-OHP)水平及卵巢内促卵泡激素受体(FSHR)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、类固醇激素急性调节蛋白(StAR)mRNA表达的影响。方法 PCOS大鼠50只,分为对照组(正常大鼠)、模型组、中药低剂量、中剂量、高剂量组,每组10只,运用放射免疫法测定血清激素水平的变化;HE染色法观察卵巢形态学的改变;RT-PCR法检测卵巢FSHR、IGF-1、StAR mRNA的表达。结果与对照组比较,模型组血清T、17-OHP显著升高(P<0.01),E2显著降低(P<0.01),卵巢组织FSHR、IGF-1、StAR mRNA的表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,中药高剂量组T显著降低(P<0.01)、17-OHP降低(P<0.05)、E2显著升高(P<0.01),中药低剂量、中剂量、高剂量组FSHR、IGF-1、StAR mRNA的表达均有所上升,尤其是高剂量组的升高最为明显(P<0.01)。结论养精种玉汤可改善PCOS大鼠的高雄激素血症,并能促进卵巢FSHR、IGF-1、StAR mRNA的表达,改善卵巢的功能,促进卵泡发育。     

中药何首乌饮对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关蛋白bcl-2,bax表达的影响

目的通过测定不同剂量的中药何首乌饮含药血清作用后的大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡相关基因bcl-2、bax的蛋白表达及caspase-3活性,探讨何首乌饮对卵巢自身功能的影响。方法制备排卵前卵巢模型,收集颗粒细胞分别与雌性SD幼鼠空白血清及含不同剂量何首乌饮的药物血清在体外共同培养,Western blotting检测GC内凋亡相关基因bcl-2、bax的蛋白表达情况;分光光度法检测颗粒细胞内caspase-3活性。结果何首乌饮含药血清可上调颗粒细胞bcl-2蛋白表达,下调bax蛋白表达,中、高剂量组何首乌饮含药血清与对照组比较,可明显上调bcl-2蛋白表达(P均<0.01),中、高剂量组何首乌饮含药血清与对照组比较,明显下调bax蛋白表达(P均<0.01)。何首乌饮含药血清可下调颗粒细胞caspase-3活性,中、高剂量何首乌饮含药血清组与对照组比较有显著性差异(P均<0.01)。结论何首乌饮增加GC内凋亡抑制蛋白bcl-2表达及减少凋亡促进蛋白bax表达的作用,可能是其抑制GC凋亡,防止卵泡闭锁的作用途径之一;同时何首乌饮可能是在凋亡的较早阶段,通过阻断caspase-3的级联裂解即可开始起效,而发挥凋亡抑制作用。     

何首乌饮含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞端粒酶活性的影响

目的观察不同剂量的中药何首乌饮对大鼠卵巢颗粒细胞端粒酶活性的影响,探讨其在调节卵泡微环境过程中所起的作用。方法制备大鼠排卵前卵巢模型,收集颗粒细胞(GC)分别与雌性SD幼鼠空白血清及含不同剂量何首乌饮的药物血清在体外共同培养。用TRAP-ELISA方法分析GC的端粒酶活性;运用流式细胞术分析GC凋亡、坏死情况。结果各剂量组何首乌饮含药血清可明显上调GC端粒酶活性,与对照组比较,中、高剂量何首乌饮含药血清能够显著提高GC端粒酶活性(P均<0.05)。随着中药血清药物剂量的增加,颗粒细胞凋亡率逐渐下降,与对照组比较,中、高剂量组何首乌饮含药血清均能够显著降低离体GC的凋亡率(P均<0.01),各含药血清组细胞坏死率虽较对照组高,但与各组比较差别无统计学意义。结论何首乌饮通过上调离体培养的大鼠卵巢GC端粒酶活性、抑制凋亡从而对卵泡局部微环境的调节,可能是其调节下丘脑-垂体-卵巢轴的重要靶点之一。