内源性血管生成抑制因子Arresten研究进展

早在1971年,Folkman就提出,肿瘤的生长与转移依赖于新生血管的生成。新生血管沟通循环系统,为肿瘤提供氧气及营养物质,并及时运走代谢产物,促使肿瘤快速生长;新生血管内皮细胞还可以分泌多种生长因子,以旁分泌方式刺激肿瘤细胞增殖;同时通过血液循环将原发癌细胞输送至远处靶器官,为癌细胞提供播散路径。肿瘤血管新生是涉及血管通透性增加、局部基底膜降解、内皮细胞迁移、毛细血管芽生、侵袭周围基质、新血管腔形成等一系列变化的一个多项过程。机体通过调节血管生成因子和抑制因子之间的平衡状态来影响内皮细胞的活动状态,调控血管生成过程。近年来,通过抑制血管生成而抗肿瘤的治疗方法引起人们的广泛关注。     

内源性血管生成抑制因子Arresten的序列测定及在E.coli BL21中的表达

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并对其进行序列测定和在E.coli BL21中进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,对其序列测定后构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli BL21进行原核表达。结果成功筛选出Arresten基因,并将基因序列和蛋白序列提交基因库,成功构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达。结论构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白。     

内源性血管生成抑制因子A rresten在E.coli JM109中的表达及抗新生血管生成的药理学研究

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并进行表达,抑制新生血管的药理学实验中发现,该表达产物具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的功能。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli JM109进行原核表达,大量表达提取Arresten蛋白,用鸡胚绒毛尿囊膜实验进行活性测定。结果成功构建的重组质粒pBV220-Arr在E.coliJM109菌株中2~8 h均可获得表达,其中诱导4 h表达效率最高,Arresten蛋白可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长,活性功能明显强于血管抑素。结论成功构建Arresten基因重组质粒pBV220-Arr,并可在E.coli JM109菌株中获得表达,Arresten蛋白具有明显的抑制血管生成的作用。     

Arresten蛋白通过调控上皮-间质转化抑制宫颈癌细胞的迁移

目的探讨Arresten蛋白对宫颈癌Siha细胞迁移的影响及其可能的作用机制。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验、划痕实验和Boyden小室趋化实验检测Arresten蛋白对宫颈癌Siha细胞增殖及迁移能力的影响;通过免疫细胞化学法检测细胞迁移分子标志基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达水平;利用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白质印迹法检测上皮-间质转化(EMT)标志物E-cadherin与N-cadherin的水平变化。结果经3.2μg/ml Arresten蛋白处理的Siha细胞,其增殖能力没有明显改变(P>0.05)。通过对划痕实验中细胞迁移距离和穿越Boyden小室的细胞数目进行分析,发现经3.2μg/ml Arresten蛋白处理的Siha细胞迁移功能受到抑制(P<0.01),细胞内迁移分子标志基质金属蛋白酶(MMP)-9的表达水平也显著降低(P<0.01)。Arresten蛋白可诱导Siha细胞内上皮标志物E-cadherin表达上调(P<0.01),间充质细胞标志物N-cadherin表达下调(P<0.01)。结论 Arresten蛋白对宫颈癌细胞迁移有抑制作用,可能通过抑制EMT途径发挥作用。。     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.     

以CpG为佐剂的人IL-24多克隆抗体的制备

目的：采用在原核表达系统表达的人IL-24蛋白及人IL-24真核重组质粒免疫新西兰兔，制备兔抗人IL-24多克隆抗体。方法：利用IPTG诱导hIL-24在大肠杆菌中表达，纯化hIL-24重组蛋白，纯化后的蛋白经SDS—PAGE分析，同时提取hIL-24真核重组质粒，用以免疫新西兰兔，并以CpG为佐剂制备多克隆抗体。Western-blot鉴定抗体的特异性，ELISA法测定抗体效价。结果：人IL-24经IPTG诱导后可在大肠杆菌中大量表达，表达量占细菌总蛋白的30％，纯化后的蛋白纯度高；原核表达的重组蛋白和真核重组质粒免疫新西兰兔，通过抗体效价测定，获得了抗血清效价达1：640的多克隆抗体。结论：原核表达的hIL-24蛋白和hIL-24真核重组质粒均能刺激家兔产生抗体．其多克隆抗体的效价较高。     

肝癌相关基因HTA的重组表达及多克隆抗体的制备

目的将肝癌相关基因HTA进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其作为肝癌导向治疗靶点的可行性及临床意义奠定基础。方法应用RT-PCR技术,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增得到HTA3＋cDNA,再将其克隆到原核表达载体pET21a（＋）-MBP内,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白MBP-HTA,通过Westernblot和ELISA方法检测重组蛋白的抗原性。将纯化的重组蛋白免疫BALB／c小鼠制备多克隆抗体,并采用ELISA、Westernblot和免疫组化的方法检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功地构建了表达MBP-HTA融合蛋白的原核表达质粒pET21a（＋）-MBP-HTA。重组MBP-HTA融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）内得以高效表达,且以包涵体的形式存在。His-tag磁珠纯化试剂盒纯化和Westernblot分析,得到了分子量约为52kDa的目的蛋白。获得了高效价的特异性多克隆抗体,经ELISA检测抗体的效价为1：3200。用Westernblot检测的效价为1：400。免疫组织化学检测表明：肝癌组织中HTA蛋白的阳性表达率明显高于正常肝组织俨〈0．01）。结论成功地制备出抗MBP-HTA多克隆抗体,该抗体有较高的效价和特异性;能用于免疫组织化学的检测,且HTA在肝癌组织中的阳性表达率明显高于正常肝组织。HTA蛋白有望成为肝癌导向治疗的潜在靶点。     

SOD基因的组织结构、表达与分子克隆

超氧化物歧化酶（SOD）是一种天然的含金属抗氧化酶，它具有抗衰老、抗辐射和消炎等多种疗效。SOD包括Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三类，其中以Cu/Zn-SOD为最重要。SOD均由核内染色体上的基因编码，这类基因既有单拷贝序列，也有多基因家庭。线粒体和叶绿体内的SOD在核内合成后，再分泌到细胞器中。多数SOD基因的表达都具有组织特异性，并受许多环境因素的诱导，有关的分子机理正在研究中，并且正在尝试SOD基因的分子克隆以及重组SOD基因在培养细胞和转基因植物中的表达。     

sTRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

克隆TRAIL基因的95-281位(sTRAIL)，构建表达载体，建立原核表达体系，优化诱导表达的条件。分离人外周血淋巴细胞，提取总RNA，RT-PCR，克隆sTRAIL的cDNA，构建原核表达载体，优化IPIG诱导的条件。结果：(1)克隆了TRAIL基因95-281位的cDNA，DNA测序结果与报道的一致。(2)构建了sTRAIL基因的原核表达载体，酶切结果与预期的一致。(3)转化宿主菌，优化IPIG诱导条件，发现3mmol/L，诱导3～4h表达最好。sTRAIL基因的克隆及表达为下游中试发酵及纯化奠定了上游的基础，也为研究TRAIL抗肿瘤的机制提供了可能。     

链霉菌A因子合成酶编码基因的克隆与原核表达载体构建

链霉菌是重要的抗生素产生菌。在链霉菌中,抗生素合成受到复杂的调控,由细胞内外小分子信号、全局性调节基因（如光秃基因bld）、抗生素合成的多效性调节基因（abaA,absAB,afsR—afsK,cutRS等）和途径专一性调控基因（act Ⅱ-4,redD等）。     

人单酰基甘油脂肪酶基因的克隆表达、纯化及活性研究

目的人单酰基甘油脂肪酶(human monoacylglycerol lipase,MAGL)是一类促进脂肪分解成甘油和脂肪酸的丝氨酸水解酶,是抗肿瘤药物研发的新靶点。为了建立高通量的MAGL抑制剂筛选模型,本研究对人MAGL进行了基因克隆、体外重组表达、纯化以及活性研究。方法通过RT-PCR方法从人脑总RNA中扩增人MAGL基因,并将该基因克隆入pET28a(+)表达载体。将重组蛋白在E.coli BL21(DE3)宿主菌中通过1mmol/L IPTG诱导表达。表达产物用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行分离纯化,通过SDS-PAGE进行分析。以7-hydroxycoumarinyl arachidonate(7-HAC)为荧光底物进行酶的活性测定。结果成功扩增出人MAGL基因,并构建了pET28a-MAGL表达载体。SDS-PAGE检测结果表明重组人MAGL蛋白在宿主菌中的表达量可达菌体总蛋白量的25%,经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱分离纯化后的重组蛋白纯度大于90%,其比活力达到7900IU/mg,,较纯化前提高了23倍。酶活性分析结果证明重组表达并纯化的蛋白具有单酰基甘油脂肪酶活性,另外,利用已知的MAGL抑制剂N-arachidonylmaleimide(NAM)对该酶表现出强的抑制活性,IC50值为0.53μmol/L。结论本研究成功利用大肠埃希菌原核表达体系重组表达并纯化了人单酰基甘油脂肪酶,为建立以MAGL为靶点的抗肿瘤药物筛选模型奠定了基础。     

Novel endogenous angiogenesis inhibitors and their therapeutic potential

Angiogenesis, the formation of new blood vessels from the pre-existing vasculature is essential for embryonic development and tissue homeostasis. It also plays critical roles in diseases such as cancer and retinopathy. A delicate balance between pro- and anti-angiogenic factors ensures normal physiological homeostasis. Endogenous angiogenesis inhibitors are proteins or protein fragments that are formed in the body and have the ability to limit angiogenesis. Many endogenous angiogenesis inhibitors have been discovered, and the list continues to grow. Endogenous protein/peptide inhibitors are relatively less toxic, better tolerated and have a lower risk of drug resistance, which makes them attractive as drug candidates. In this review, we highlight ten novel endogenous protein angiogenesis inhibitors discovered within the last five years, including ISM1, FKBPL, CHIP, ARHGAP18, MMRN2, SOCS3, TAp73, ZNF24, GPR56 and JWA. Although some of these proteins have been well characterized for other biological functions, we focus on their new and specific roles in angiogenesis inhibition and discuss their potential for therapeutic application.     

人过氧化氢酶基因的克隆与表达

目的利用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达人过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从人cDNA文库中获得CAT编码基因,并利用pMAL-c2x、pBV221质粒分别构建了融合和非融合表达载体并进行了表达和活性检测。结果融合表达与非融合表达均可获得可溶性蛋白质,非融合的表达产物具有CAT活性,而融合表达产物在切除融合蛋白质(MBP)部分后表现出明显的CAT活性。结论从大肠杆菌表达体系能表达具有生物活性的CAT,此项研究为后续重组酶性质的研究和开发利用奠定了基础。     

Cloning and expression of human liver UDP-glucuronosyltransferase cDNA, UDPGTh2

The human liver cDNA clone UDPGTh2, encoding a liver UDP-glucuronosyltransferase (UDPGT) was isolated from a λ gt 11 cDNA library by hybridization to mouse transferase cDNA clone, UDPGTm1. UDPGTh2 encoded a 529 amino acid protein with an amino terminus membrane-insertion signal peptide and a carboxyl terminus membrane-spanning region. There were three potential asparagine-linked glycosylation sites at residues 67, 68, and 315. In order to obtain UDPGTh2 protein encoded from cloned human liver UDP-glucuronosyltransferase cDNA, the clone was inserted into the pSVL vector (pUDPGTh2) and expressed in COS 1 cells. The presence of a transferase with Mr≈52,000 in transfected cells cultured in the presence of [³⁵S]methionine was shown by immunocomplexed products with goat antimouse transferase IgG and protein A-Sepharose and analysis by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and autoradiography. The expressed UDPGT was a glycoprotein as indicated by electrophoretic mobility shift in Mr≈3,000–4,000 when expressed in the presence of tunicamycin. The extent of glycosylation was difficult to assess, although one could assume that glycosyl structures incorporated at the level of endoplasmic reticulum were always the core oligosaccharides. Thus, it is likely that at least two moieties inserted can account for the shift of Mr≈3,000–4,000. This study demonstrates the cDNA and deduced amino acid sequence of human liver UDP-glucuronosyltransferase cDNA, UDPGTh2.     

人肿瘤抑素(tumstatin)的基因克隆及其原核表达

目的克隆人肿瘤抑素(tumstatin)基因,并进行其在大肠杆菌表达的研究。方法用RT-PCR技术从人肾癌旁组织中扩增出肿瘤抑素的cDNA,构建原核表达载体pQE-tum,IPTG诱导重组蛋白质的表达,并利用Ni-NTAHis-Bind树脂纯化该重组蛋白质。结果经PCR扩增成功获得742 bp的人肿瘤抑素基因,测序正确。在大肠杆菌中目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的10%,SDS-PAGE及Western blot分析显示,其相对分子质量为28 000,纯化后的6×His-tumstatin纯度可达92%。结论tumstatin基因克隆、表达及纯化的成功,为其今后的肿瘤抗血管生成治疗研究奠定了基础。     

人α1微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的构建人α1微球蛋白（α1-MG）基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、纯化,为制备仅。一MG诊断试剂中原料抗体、标准品及质控品奠定基础。方法从人胚胎肝脏中提取总RNA,利用反转录聚合酶链反应技术扩增α1-MG基因。然后克隆至PQE30表达载体,转化大肠杆菌M15中进行表达,并经镍固定金属亲和层析进行纯化,蛋白质印迹进行免疫学鉴定。结果获得了与Genebank报道一致的仪。一MG基因片段,成功构建了成熟人α1-MG的原核表达载体PQE30-α1-MG,质粒转化大肠杆菌并经1mmol／L异丙基硫代半乳糖诱导5h后,可表达相对分子质量约25000的外源蛋白,表达的α1-MG大部分在包涵体中,并可经镍固定金属亲和层析纯化,纯化有效率95％以上,BCA法测定纯化的α1-MG蛋白含量为25mg／L。蛋白质印迹表明,该蛋白可与抗人仅．一MG天然抗体反应。结论通过基因工程方法可获得高效表达的重组α1-MG蛋白,该蛋白具备同天然仅。一MG相同的生物学特性,为下一步进行α1-MG相关研究及应用奠定基础。     

Nonclassic endogenous novel [corrected] regulators of angiogenesis

Angiogenesis, the process through which new blood vessels arise from preexisting ones, is regulated by several "classic" factors, among which the most studied are vascular endothelial growth factor (VEGF) and fibroblast growth factor-2 (FGF-2). In recent years, investigations showed that, in addition to the classic factors, numerous endogenous peptides play a relevant regulatory role in angiogenesis. Such regulatory peptides, each of which exerts well-known specific biological activities, are present, along with their receptors, in the blood vessels and may take part in the control of the "angiogenic switch." An in vivo and in vitro proangiogenic effect has been demonstrated for erythropoietin, angiotensin II (ANG-II), endothelins (ETs), adrenomedullin (AM), proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), urotensin-II, leptin, adiponectin, resistin, neuropeptide-Y, vasoactive intestinal peptide (VIP), pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP), and substance P. There is evidence that the angiogenic action of some of these peptides is at least partly mediated by their stimulating effect on VEGF (ANG-II, ETs, PAMP, resistin, VIP and PACAP) and/or FGF-2 systems (PAMP and leptin). AM raises the expression of VEGF in endothelial cells, but VEGF blockade does not affect the proangiogenic action of AM. Other endogenous peptides have been reported to exert an in vivo and in vitro antiangiogenic action. These include somatostatin and natriuretic peptides, which suppress the VEGF system, and ghrelin, that antagonizes FGF-2 effects. Investigations on "nonclassic" regulators of angiogenesis could open new perspectives in the therapy of diseases coupled to dysregulation of angiogenesis.