Ad-hTERTp-单纯疱疹病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷系统联合奥沙利铂对人类肝癌细胞的影响

目的研究腺病毒介导的Ad—hTERTp一单纯疱疹病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷（Ad-hTERTp—HSV—TK／GCV）自杀基因系统联合奥沙利铂对人类肝癌细胞HepG2的体外杀伤作用。方法将带有hTERT启动子驱动HSV—TK基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-HSV-TK作为载体。感染复数（MOI）为100转染HepG2细胞,观察不同浓度的Ad-hTERTp—HSV-TK／GCV、奥沙利铂及二者联合对HepG2细胞生长的影响。用锥虫蓝活细胞拒染法、四甲基偶氮唑盐比色（MTF）法检测各干预组肝癌细胞生长的抑制率。结果3组HepG2细胞的生长均不同程度被抑制,且随药物浓度的增加抑制作用显著增强。Ad—hTERTp—HSV。TK／GCV联合奥沙利铂组抑制率最高（86．63％）,与Ad—hTERTp—HSV．TK／GCV组抑制率（72．12％）及奥沙利铂组抑制率（59．41％）相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论Ad—hTRTq：Tp—HSV—TK／GCV联合奥沙利铂可显著增强对HepG2细胞的杀伤作用,增加靶向性的同时可以降低药物浓度,对临床用药有指导意义。     

人FAS启动子驱动的HSV—TK重组腺病毒靶向杀伤SKBR3乳腺癌细胞的研究

目的：构建脂肪酸合成酶（FAS）启动子驱动下的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）重组腺病毒，研究其对乳腺癌细胞SKBR3的靶向杀伤作用。方法：以AdEasy^TM腺病毒系统为载体，构建FAS启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒载体Ad—FAS—TK，将线性化的Ad—FAS—TK在AD-293细胞中包装，经过大量扩增和纯化，得到重组腺病毒。M1Tr法检测重组腺病毒Ad—FAS—TK与前体药物更昔洛韦（GCV）对SKBR3细胞的靶向杀伤作用。TUNEL法检测细胞凋亡。结果：成功构建FAS启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒载体Ad—FAS—TK，经包装、扩增和纯化得到约10^10pfu／ml的重组腺病毒。MTT法和TUNEL检测结果显示，FAS启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒与GCV能够诱导SKBR3细胞凋亡，产生靶向细胞毒作用。结论：FAS启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒联合GCV对SKBR3细胞具有靶向杀伤作用，FAS启动子可以作为肿瘤靶向基因治疗的工具。     

双启动子调控的条件复制腺病毒制备及其体外抑瘤作用

目的：构建并制备survivin及hTERT双启动子调控的条件复制腺病毒,探讨其特异性溶瘤作用。方法：PCR方法分别扩增肿瘤特异性survivin及hTERT启动子,分别克隆入腺病毒载体pXCl的两个复制必需基因E1A和E1B序列上游启动子区,构建出双肿瘤特异性启动子调控的条件复制腺病毒载体pXCl-SP—TP;脂质体法与pBHGE3骨架质粒共转染293E细胞进行重组腺病毒包装,稀释法测定腺病毒滴度;应用MTT、活细胞计数等方法观察其对肝癌细胞HepG2的特异性溶瘤作用并以正常人的血管内皮细胞ECV304作为对照。结果：测序及双酶切鉴定结果证实,成功构建了双肿瘤特异性启动子调控复制腺病毒载体;在293E细胞中获得了重组腺病毒Ad—sP—TP,滴度测定显示病毒滴度达到3．9×10^10TCID50／ml;MTT结果显示,Ad—sP—TP可有效抑制肝癌细胞增殖而对正常细胞无增殖抑制作用;活细胞计数及细胞形态观察结果显示,重组腺病毒在肝癌细胞中选择性复制并发挥溶细胞作用。结论：双启动子调控的腺病毒具有显著的溶瘤作用但对正常人血管内皮细胞不发挥溶细胞作用,实验结果为肝癌靶向治疗提供了更为良好的条件复制型病毒载体及新的治疗策略。     

人MUC4启动子驱动的HSV—TK重组腺病毒靶向杀伤SGC-7901胃癌细胞的实验研究

目的：构建人粘蛋白（MUC4）启动子驱动下的单纯疱疹胸苷激酶基因（HSV-TK）重组腺病毒,研究其对SGC一7901胃癌细胞的靶向杀伤作用。方法：克隆MUC4启动子区625bp活性序列,构建重组荧光素酶报告基因载体pGL3MUC4,检测其在sGD790l胃癌细胞及NIH3T3成纤维细胞中的转录活性。以AdEasy。”腺病毒系统为载体,构建Muc4启动子驱动下的HsV—TK重组腺病毒rAdeno—MUC4一TK,感染SGC7901及NIH3T3,经更昔洛韦（GCV）处理,MTT法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡。结果：成功扩增出大小为625bp的MUC4启动子序列。pGL3一MUC4在SGC一790l细胞中具有强转录活性,转录活性高于强启动子SV406．6倍,而NIH3T3成纤维细胞系中几乎无转录活性。构建重组腺病毒rAdeno—MUC4一TK,MTT法和TUNEI。检测结果显示,其与GCV联合能够诱导SGC-7901细胞凋亡,产生靶向细胞毒作用。结论：人MUC4启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒联合GCV对SGC一7901胃癌细胞具有靶向杀伤作用,MUC4启动子可以作为胃癌靶向基因治疗的工具。     

人FAS启动子驱动的HSV-TK重组腺病毒靶向杀伤SKBR3乳腺癌细胞的研究

目的:构建脂肪酸合成酶(FAS)启动子驱动下的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)重组腺病毒,研究其对乳腺癌细胞SKBR3的靶向杀伤作用。方法:以AdEasyTM腺病毒系统为载体,构建FAS启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒载体Ad-FAS-TK,将线性化的Ad-FAS-TK在AD-293细胞中包装,经过大量扩增和纯化,得到重组腺病毒。MTT法检测重组腺病毒Ad-FAS-TK与前体药物更昔洛韦(GCV)对SKBR3细胞的靶向杀伤作用。TUNEL法检测细胞凋亡。结果:成功构建FAS启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒载体Ad-FAS-TK,经包装、扩增和纯化得到约1010pfu/ml的重组腺病毒。MTT法和TUNEL检测结果显示,FAS启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒与GCV能够诱导SKBR3细胞凋亡,产生靶向细胞毒作用。结论:FAS启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒联合GCV对SKBR3细胞具有靶向杀伤作用,FAS启动子可以作为肿瘤靶向基因治疗的工具。     

人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导胸苷激酶基因治疗人膀胱癌的动物实验研究

目的：探讨带有人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV—tk）基因的重组腺病毒Ad—hTERT—HSV—tk结合无毒的环氧鸟苷（GCV）对人膀胱癌的治疗作用．方法：建立人膀胱癌细胞株253JBALB／C裸小鼠移植痛模型．采用Ad—hTERT—HSV—tk裸鼠尾静脉注射，腹腔注射GCV治疗并观察结果通过常规病理切片观察肿瘤破坏情况及安全性；通过TUNEL染色进一步观察肿瘤的凋亡情况，免疫组化法测定增值细胞核抗原（PCNA），结果：Ad-hTERT—HSV—tk／GCV治疗组，显示出明显的肿瘤抑制作用，其肿瘤体积、重量显著低于各对照组（P〈0．05）．抑瘤率明显，Ad—hTERT—HSV—tk／GCV治疗组凋亡指数高于其它各组，而增殖指数却明显低于其它各组。结论：Ad—hTERT—HSV—tk／GCV系统对裸鼠移植瘤的生长有明显抑制作用，可以靶向性转入人膀胱癌细胞，治疗效果显著．     

hTERT启动子驱动的HSV-TK基因对人胰腺癌细胞patu8988的杀伤作用

[目的]探讨hTERT启动子驱动的HSV-TK基因对人胰腺癌细胞patu8988的杀伤作用。[方法]应用分子生物学方法构建hTERT启动子调控下的TK基因真核表达载体。经同源重组产生重组腺病毒PSG-TP-TK。同法制备PSU-CMV-TK。利用重组腺病毒PSG-TP-TK和PSU-CMV-TK感染人胰腺癌细胞株patu8988和正常人原代成纤维细胞．加入GCV。用MTT和流式细胞仪检测PSG-TP-TK对各种细胞的杀伤作用;应用RT—PCR检测转染腺病毒后肿瘤细胞和正常细胞中TK基国的表达情况。[结果]PSG-TP-TK对端粒酶阳性的人胰腺癌细胞有明显的杀伤作用．而对端粒酶阴性的正常细胞则无杀伤作用（P〈0．05）。hTERT启动子诱导人胰腺癌细胞株patu8988凋亡的效能与CMV启动子相似。两者差异无显著性（P〉0．05）。PSU-CMV-TK转染后．在patu8988细胞和正常人原代成纤维细胞中均可检测到TK基因;而PSG-TP-TK转染后只有patu8988细胞中有TK基因表达．正常人原代成纤维中则无。[结论]hTERT启动子驱动HSV-TK基因治疗是一种新的胰腺癌靶向治疗方法．具有更高的靶向性和高效性。     

双启动子调控的条件复制腺病毒制备及其体外抑瘤作用

目的:构建并制备survivin及hTERT双启动子调控的条件复制腺病毒,探讨其特异性溶瘤作用.方法:PCR方法分别扩增肿瘤特异性survivin及hTERT启动子,分别克隆入腺病毒载体pXC1的两个复制必需基因E1A和E1B序列上游启动子区,构建出双肿瘤特异性启动子调控的条件复制腺病毒载体pXC1-SP-TP;脂质体法与pBHGE3骨架质粒共转染293E细胞进行重组腺病毒包装,稀释法测定腺病毒滴度;应用MTT、活细胞计数等方法观察其对肝癌细胞HepG2的特异性溶瘤作用并以正常人的血管内皮细胞ECV304作为对照.结果:测序及双酶切鉴定结果证实,成功构建了双肿瘤特异性启动子调控复制腺病毒载体;在293E细胞中获得了重组腺病毒Ad-SP-TP,滴度测定显示病毒滴度达到3.9×1010TCID50/ml;MTT结果显示,Ad-SP-TP可有效抑制肝癌细胞增殖而对正常细胞无增殖抑制作用;活细胞计数及细胞形态观察结果显示,重组腺病毒在肝癌细胞中选择性复制并发挥溶细胞作用.结论:双启动子调控的腺病毒具有显著的溶瘤作用但对正常人血管内皮细胞不发挥溶细胞作用,实验结果为肝癌靶向治疗提供了更为良好的条件复制型病毒载体及新的治疗策略.     

一种新的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP的构建

 目的 构建表达小鼠甲胎蛋白（murine alpha fetoprotein，mAFP）基因的重组腺病毒载体pAd—BM5-GFP-mAFP，并测定其滴度。方法 从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增mAFP基因，测序确认后，插入到pAdBM5-GFP穿梭载体中，双酶切鉴定重组腺病毒载体。线性化重组腺病毒载体与病毒骨架DNA质粒用磷酸钙共沉淀法共转染HEK293A细胞，通过同源重组使腺病毒表达mAFP基因，并在HEK293A细胞中大量扩增含目的基因的重组腺病毒，用TCBn法测定重组腺病毒滴度。结果 成功克隆了小鼠mAFP基因，构建出表达mAFP基因的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP，获得了表达mAFP基因的重组腺病毒，病毒滴度达3．2×10^8PFU／ml。结论 本研究成功构建了pAdBM5-GFP-mAFP载体，获得了高滴度表达mAFP基因的重组腺病毒，为进一步开展肝癌的免疫基因治疗奠定了基础。     

腺病毒介导的HSV-TK/GCV自杀基因治疗前列腺癌的体外实验

目的 以恶性肿瘤无限增殖特性为靶点,应用人端粒酶逆转录酶启动子（hTERT）和小鼠巨细胞病毒启动子（CMV）调控携带HSV-TK基因的减毒非增殖型腺病毒,通过体外实验观察HSV-TK/GCV自杀基因疗法对前列腺癌细胞LNCaP,PC-3和人正常成纤维细胞MRC 5的治疗效果,对其抗肿瘤机制进行初步探讨。方法 将腺病毒转染细胞后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,通过细胞病理效应（CPE）、细胞活力实验（MTT）和电泳法检测Ad-hTERT-HSV/TK选择性杀伤肿瘤细胞。结果 Ad-hTERT-EGFP仅能转染肿瘤细胞,而Ad-CMV-EGFP对正常和肿瘤细胞都能转染。细胞病理效应（CPE）发现Ad-hTERT-HSV/TK对肿瘤细胞具有很强的杀伤能力,而对正常细胞无明显杀伤作用。细胞活力实验（MTT）量化地反映出Ad-hTERT-HSV/TK选择性杀伤肿瘤细胞。电泳法检测到,在表达HSV/TK的肿瘤细胞出现细胞凋亡。结论 本实验利用由hTERT启动子调控EGFP报告基因的腺病毒,证明了腺病毒的转染效果及重组病毒Ad-hTERT-HSV/TK具有选择性肿瘤细胞杀伤能力。     

重组腺病毒Ad—hTERTp-HSV—TK／GCV系统的构建及其对人肝癌细胞HepG2的杀伤作用及旁观者效应研究

背景与目的:肝癌的基因治疗已成为肝癌治疗的重要发展方向,本文探讨Ad-hTERTP-HSV-TK/GCV系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用;并观察其过程中旁观者效应的作用。方法:用重组腺病毒Ad-hTERTP-HSV-TK系统分别感染肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞L-02,加入前体药物更昔洛韦(GCV),四甲基偶氮唑盐比色法检测其对感染后细胞的杀伤作用;将感染后的TK阳性HepG2细胞和未感染的TK阴性HepG2细胞按不同比例浓度(0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0)混合,观察其旁观者效应。结果:肝癌细胞HepG2的存活率随病毒感染复数(MOI)和GCV浓度增加而逐渐降低,L-02细胞无明显变化。旁观者效应表明,在TK阳性HepG2细胞为10%时,细胞抑制率达28.06%,70%时达90.44%。结论:重组腺病Ad-hTERTP-HSV-tk/GCV系统对肝癌细胞HepG2有选择性杀伤作用及明显的旁观者效应。     

缺氧对血管内皮生长因子启动子-胸苷激酶系统杀伤肝癌细胞系的增强作用

目的：探讨缺氧对腺病毒介导的血管内皮生长因子启动子－胸苷激酶系统（AdVEGF-tk)对肝癌细胞系HepG2选择性杀伤活性的增强作用。方法：采用AdEasy system构建重组腺病毒载体AdVEGF-tk和AdVEGF-GFP,在293细胞中包装,扩增后,分别感染L02（正常肝细胞系）和HepG2,A VEGF-GFP感染细胞经正常培养24h后,在荧光显微镜下观察其荧光蛋白表达情况;AdVEGF-tk感染细胞在缺氧或不缺氧条件下培养,并给予不同浓度的丙氧鸟苷（GCV）处理,用MTT法检测感染细胞的增殖情况,结果：AdVEGF-GFP感染的L02细胞仅见稀散的荧光,而AdVEGF-GFP感染的HepG2细胞则出现大量荧光,感染AdVEGF-tk后,当感染指数（MOI）为100目GCV浓度为10ug/ml时,L02细胞在不缺氧条件下对GCV几乎不敏感,但在缺氧条件下,70％以上的细胞被杀死,而HepG2细胞即便在不缺氧培养条件下也有60％以上的细胞被杀死,缺氧则使80％以上细胞被杀死,结论：缺氧可加强腺病毒介导的AdVEGF-tk系统对体外培养肝癌细胞的选择性杀伤作用。     

人类端粒酶反转录酶-肿瘤抑素联合人类端粒酶反转录酶-胸苷激酶/丙氧鸟苷系统对肝癌HepG2细胞的作用

目的 观察人类端粒酶反转录酶-胸苷激酶/丙氧鸟苷（phTERT-TK/GCV）联合人类端粒酶反转录酶-肿瘤抑素（phTERT-tumstatin）对肝癌细胞HepG2凋亡以及肝癌相关基因甲胎蛋白（AFP）、RhoC的mRNA及蛋白表达情况的影响.方法 细胞分为未转染组、转染空质粒hTERT-EGFP组（空质粒组）、转染phTERT-tumstatin组（TM组）、转染phTERT-TK后加50 μg/ml GCV组（TK/GCV组）、共转染phTERT-tumstatin和phTERT-TK后加50μg/ml GCV组（MK组）.荧光显微镜观察转染肝癌细胞HepG2和肝细胞L-02中EGFP与MCHERRY的表达;采用实时荧光定量PCR与Western blot检测各组AFP与RhoC在mRNA及蛋白水平表达的变化,流式细胞术检测各组转染后HepG2凋亡状况.结果 phTERT-tumstatin、phTERT-TK/GCV转染后两基因在肝癌细胞HepG2特异性表达;TK/GCV组、TM组及MK组AFPmRNA相对表达量分别为0.76±0.09、0.62±0.09、0.49±0.07,RhoC mRNA相对表达量分别为0.80±0.04、0.40±0.02、0.54±0.03,与空质粒组（0.94±0.04、0.94±0.02）比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,且MK组较TK/GCV组、TM组AFP、RhoC mRNA相对表达差别显著.TK/GCV组、TM组、MK组、空质粒组和未转染组的AFP蛋白相对表达水平分别为0.97±0.02、0.83±0.02、0.69±0.01、1.19±0.03、1.15±0.05,RhoC蛋白相对表达水平分别为1.17±0.01、0.99±0.02、0.77±0.02、1.32±0.05、1.29±0.30（均P＜ 0.01）.phTERT-tumstatin、phTERT-TK/GCV共同转染HepG2细胞的凋亡率较二者单独转染组显著升高,二者单独及共转染组凋亡率较转染空质粒组及未转染组差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 phTERT-TK/GCV及phTERT-tumstatin对肝癌细胞HepG2有显著促凋亡的作用,二者联合作用更强.     

CRT180基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达CRT180基因重组的腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗奠定实验基础。方法采用腺病毒表达系统（Vira Power^TM Adenoviral Expression System）构建重组腺病毒表达载体。首先利用RT-PCR的方法在人肺腺癌细胞系A549细胞中扩增CRT180基因,以连接、转化等方法克隆入载体pENTR／D—TOPO以获得重组的入门克隆,经测序及PCR鉴定正确后,用重组酶（LRClonase^TMⅡ Enzyme Mix）进行入门克隆与腺病毒表达载体（pAd—CMV／V5-DEST）间的重组反应,以获得表达克隆（rAd．CRT180）质粒。重组表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ是使之线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。用极限稀释法检测病毒滴度用Western Blot法检测rAd．CRT180载体是否能正确表达CRT180蛋白。结果用RT-PCR的方法扩增到CRT180基因;重组入门和表达克隆经酶切和PCR鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液并扩增后测定病毒滴度为1．8×10^11pfu／mL,且这个病毒能正确表达CRT180蛋白。结论成功构建了CRT180基因的重组腺病毒载体,可为此重组载体用于肿瘤基因治疗提供实验依据。     

非增殖型腺病毒和肿瘤特异性增殖型腺病毒携带IL-12基因治疗肝癌的体外实验研究

目的 比较携带小鼠IL-12基因的增殖型腺病毒(CNHK200-mIL12)和非增殖型腺病毒(Adv-mIL12)对IL-12基因的表达以及对肝癌细胞的杀伤能力。方法 通过MTT以及病毒增殖实验．评估E1B-55000缺陷的增殖型腺病毒CNHK200-mIL12和ONYX-015(dl1520),以及非增殖型腺病毒Adv-mIL12对人正常肝细胞株LO2、人肝癌细胞株HepG2和Hep3B的杀伤能力。采用蛋白质印迹分析和ELISA法,检测CNHK200-mIL12和Adv-mill2感染HepG2和Hep3B细胞后,小鼠IL-12基因的表达情况。结果 CNHK200-mIL12感染HepG2和Hep3B细胞后大量增殖,在感染后96h时检测,分别增殖3160倍和630倍,在极低的MOI(空斑形成单位／细胞)值和极短的时间内(HepG2细胞：MOI=0．2,第4天;Hep3B细胞：MOI=0．005,第2天),可大量杀伤肿瘤细胞,而对LO2细胞无明显杀伤。CNHK200-miLl2和Adv-mIL12感染HepG2细胞后,其IL-12基因表达量,前者是后者的101倍;感染Hep3B细胞后,前者是后者的20倍。结论 增殖型腺病毒载体对肿瘤细胞的杀伤能力和目的基因的表达,明显优于传统的非增殖型腺病毒载体,应用前景广阔。     

HSV-tk基因治疗靶向载体的构建及特异性表达分析

背景与目的:阻断肿瘤组织内血管生成和血管化是一个很有发展前景的灭瘤途径之一。胸苷激酶自杀基因系统(herpessimplexvirus-thymidinekinase,HSV-tk/GCV)能有效杀伤血管内皮细胞,目前多采用巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)作为启动子,但其杀伤缺乏特异性。KDR(kinasedomaininsertcontainingreceptor)是血管内皮生长因子的两种受体之一,它在肿瘤血管内皮细胞中高表达,而在正常组织中呈低表达。本研究是构建KDR启动子介导的HSV-tk重组腺病毒、并对其内皮细胞特异性表达作用进行分析。方法:采用pAdeasy系统,按定向克隆方法将KDR-tk片段正向插入表达载体的多克隆位点间,构建受KDR启动子调控并可表达HSV-tk基因的AdKDR-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外感染人脐静脉血管内皮细胞系(humanumbilicalvenousendothelialcells,HUVEC)和不表达KDR的肝癌细胞系HepG2。用更昔洛韦(ganciclovir,GCV)处理受染细胞,并以MTT法检测其细胞增殖情况。结果:经限制性酶切分析,RT-PCR及PCR方法鉴定,插入基因大小、位置、方向正确。病毒滴度为1×1010pfu/ml。在感染复数(multiplicityofinfection,MOI)为100的条件下,GCV浓度由0增至50μg/ml时,感染含AdKDR-tk的HUVEC细胞和HepG2细胞存活率由100%分别下降至(28.94±5.67)%和(75.45±2.91)%(P<0.01)。结论:构建的含KDR-tk重组腺病毒可在血管内皮细胞中特异性地表达HSV-tk。     

重组腺病毒Ad-DT-A靶向治疗胰岛素样生长因子2基因组印迹丢失的肿瘤细胞株

目的 构建携带胰岛素样生长因子2(IGF2)印迹系统的重组腺病毒,探讨其用于肿瘤靶向治疗的可行性.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增H19 enhancer、DMD以及H19启动子序列,并克隆至pDC-312中;扩增出增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和白喉毒素A(DT-A)片段,分别插入到构建好的重组质粒中,构建成重组腺病毒穿梭质粒.重组腺病毒穿梭质粒与Ad5共转染,产生重组腺病毒Ad-EGFP和Ad-DT-A.以Ad-EGFP分别感染正常IGF2印迹(MOI)细胞GES-1和MCF-7以及IGF2印迹丢失(LOI)细胞HCT-8,荧光显微镜下观察各组细胞中EGFP的表达.通过检测腺病毒衣壳蛋白hexon基因的表达证实腺病毒的感染,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测Ad-DT-A感染后各组细胞中DT-A基因的表达;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞术检测Ad-DT-A体外抗肿瘤效应.构建皮下移植瘤裸鼠模型,研究Ad-DT-A在体内的抑瘤作用.结果 所构建重组腺病毒Ad-EGFP感染各组细胞后,EGFP蛋白仅在IGF2 LOI细胞HCT-8中表达.各组细胞经Ad-DT-A感染后,DT-A基因仅在HCT-8细胞中表达;且HCT-8细胞以每个细胞10 PFU的Ad-DT-A感染72 h后,其增殖活力降低至(75.4±6.4)％,凋亡率升高至(20.8±5.9)％.Ad-DT-A多点注射入HCT-8移植瘤内,Ad-DT-A能够有效抑制移植瘤的生长,抑瘤率达36.4％.结论 成功构建了携带IGF2印迹系统和DT-A基因的重组腺病毒.重组腺病毒Ad-DT-A能够有效杀伤IGF2 LOI肿瘤细胞,为依赖IGF2 LOI的肿瘤靶向治疗开拓了新的途径.     

hMAM-EP调控HSV-TK腺病毒载体的构建及其对乳腺癌细胞的靶向杀伤

目的:分别构建人乳腺珠蛋白(human mammaglobin,hMAM)基因增强子和启动子(enhancer and promoter of hMAM,hMAM-EP)调控的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因和单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simple virus thymidine kinase,HSV-TK)自杀基因两种重组腺病毒载体,探讨hMAM-EP调控的HSV-TK在乳腺癌细胞特异性表达及其对乳腺癌的靶向治疗作用.方法:构建hMAM-EP-EGFP和hMAM-EP-TK重组质粒载体,将重组质粒目的基因转移到腺病毒骨架黏粒载体pAxcwit2,并转染HEK 293细胞获得重组腺病毒载体Ad-EP-EGFP和Ad-EP-TK.将Ad-EP-EGFP感染乳腺癌细胞T-47D、ZR-75-30和鼻咽癌细胞5-8F,荧光显微镜观察EGFP的表达.将Ad-EP-TK感染T47D细胞,给予1、10、20、50 μg/ml前药更昔洛韦(ganciclovir,GCV),观察TK基因对乳腺癌细胞的特异杀伤作用.结果:成功构建hMAM-EP调控的重组腺病毒载体Ad-EP-EGFP和Ad-EP-TK.Ad-EP-EGFP感染后,乳腺癌T-47D细胞可见EGFP表达,但ZR-75-30细胞和5-SF细胞无表达.与未感染组或感染Ad-EP-EGFP组相比,Ad-EP-TK重组腺病毒联合GCV(50 μg/ml)组T-47D细胞存活率显著降低[(35.69±0.07)％vs (91.74±0.02)％,(87.69 ±0.11)％;P ＜0.05],且随GCV质量浓度的增加,T-47D细胞存活率逐渐下降,在MOI=100、GCV质量浓度分别为1、10、20、50 μg/ml条件下,细胞存活率分别为(94.34 ±0.04)％、(86.26 ±0.02)％、(66.51±0.09)％、(35.69±0.07)％.结论:hMAM-EP调控的HSV-TK自杀基因在乳腺癌T-47D细胞中特异性表达,Ad-EP-TK联合GCV可靶向杀伤乳腺癌T-47D细胞.     

壳聚糖纳米粒介导的人类端粒酶反转录酶启动子连接的自杀基因耦联更昔洛韦靶向抗肝癌研究

目的比较壳聚糖（Ch）与半乳糖化壳聚糖（GC）纳米载体对肝癌细胞的转染效果;观察转染后的人类端粒酶反转录酶启动子连接的自杀基因（pGL3-hTERTp—TK）对肝癌细胞株HepG2生长及凋亡的影响。方法制备ch及Gc;构建pGL3,hTERTp—TK质粒及ch／DNA和GC／DNA复合物;转染HepG2细胞和正常肝细胞L-02;通过单光子液闪计数仪观察转染效率;流式细胞术（FCM）、Caspase-3万法观察自杀基因对肝癌细胞生长和凋亡的影响。结果质粒经酶切及电泳后在琼脂糖凝胶上出现300bp与1100bp两个清晰条带;在HepG2中,由Gc介导的pGL3-hTERTp．Luc^＋荧光素相对活性表达明显高于ch介导的pGL3-hTERTp—Luc^＋,但比去唾液酸糖蛋白（AF）介导的pGL3．hTERTp—Luc^＋低,而在正常肝细胞荧光素相对活性表达极低;治疗质粒Gc介导的pGL3-hTERTp—TK转染的HepG2细胞抑制率和L-02细胞抑制率,在前体药物更昔洛韦（GCV）的浓度为10μg／ml时差异有统计学意义（t=51．40,P=0．000）。HepG2细胞组GC—pGL3-hTERTp—TK凋亡率为65．28％,明显高于其他组（LSD法,均P〈0．05）。L-02细胞组GC—pGL3-hTERTp—TK凋亡率仅为10．R0％,明显低于对照组Ch—pGL3-control（LSD法,P=0,000）;FCM检测显示Ch—pGL3-hTERTp—TK转染HepG2细胞后其平均荧光强度为168．02±3．68,Gc—pGL3-hTERTp—TK转染后其平均荧光强度为204．45±3．45,两组差异有统计学意义（t=-12．504,P〈0．05）。结论Gc较ch能提高pGL3-hTERTp—TK质粒对肝癌细胞的转染率,GC—pGL3-hTERTp—TK可以靶向攻击肝癌细胞,对正常肝细胞几乎无影响。