脱氧尿嘧啶核苷酸掺入量对尿苷酶抗污染效果的影响

目的 了解脱氧尿嘧啶核苷酸（dUTP)掺入量与尿苷酶（UDG）抗污染的关系。方法 通过聚合酶链反应将50％ dUTP和全dUTP掺入HCV cDNA，并观察UDG的抗污染效果。结果 0．05U、0．1U、0．2U的UDG37℃消化60min,PAGE检测可抗10^-1－10^-8 50％ dU-DNA模板污染。0．1U UDG 37℃ 10min能抗10^-6,20min-30min可抗10^-5,PAGE虽阴性，但DNA－EIA杂交A值0．617，仍为阳性；40min可抗10^-3，未经杂交证实。37℃消化20min电泳检测可抗10^-1-10^-8全dU-DNA污染，DNA－EIA杂交A值在0．005－0．049均为阴性。结论 本文研究结果证实，用50％ dU-DNA为模板，37℃ 10-20min时，抗污染效果较差，需增加抗污染时间。应用全dU-DNA为模板时，可获得良好的抗污染效果。     

dUTP/UDG反应体系在荧光定量PCR中抗污染能力评价

目的 探讨dUTP／UDG反应体系在荧光定量PCR中抗PCR产物污染的能力。方法 用TaqMan荧光定量PCR检测方法进行定量检测。将一系列不同浓度的含dUTP的HBV—DNA PCR扩增产物作为污染源，分别加至含dUTP／UDG的PCR反应体系和普通荧光定量PCR反应体系中，在荧光定量PCR仪上进行定量检测，从而得出含dUTP／UDG的PCR反应体系的抗污染能力。结果 1．最佳抗污染实验条件：UDG酶含量0．05U，消化时间37℃5min，灭活时间92℃1min；dUTPl00％代替dITP，四种底物浓度相等。2．含0．05U的UDG抗污染反应体系对每管浓度为10^3拷贝／ml的污染物可完全消化，并随UDG含量的增高及消化时间的延长，抗污染能力增强。结论 dUTP／UDG反应体系的应用能有效防止PCR产物污染，但抗污染能力是有一定限度的，尚需加强实验室标准化管理，才能真正达到抗污染效果。     

原代人脐静脉内皮细胞分离培养方法的探讨及其鉴定

目的通过比较两种原代人脐静脉内皮细胞的分离培养方法并对细胞特异性抗原进行鉴定,探索提高原代内皮细胞体外培养存活率及纯化率的方法。方法采用一次性无菌注射器向人脐静脉灌注消化液,消化液的浓度和消化时间分别0.25%（质量体积比）胰蛋白酶,10min和0.1%（质量体积比）胶原酶Ⅱ,15min。通过在倒置显微镜下观察细胞的形态特点和用免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定,比较两种消化方法的优劣。结果 0.1%胶原酶Ⅱ,15min的消化方法较0.25%胰蛋白酶,10min对原代人脐静脉内皮细胞有更好的分离效果,活细胞数量多且细胞纯度较高。免疫荧光染色结果表明细胞内有Ⅷ因子相关抗原表达。结论胶原酶Ⅱ可以有效分离脐静脉内皮细胞,最佳消化条件是0.1%胶原酶Ⅱ,37℃,15min。     

PCR产物液相杂交检测的优化

目的 为了使液相杂交检测更加灵敏、特异、快速。方法 通过改进杂交液的成分,选择最佳的探针浓度,使5＇端标记生物素的PCR扩增产物与5＇端标记地高辛的探针在PCR反应管中进行液相杂交,杂交条件为:94℃ 10 s冷却到37℃ 10 s即完成杂交。杂交后产物通过链霉亲和素被固定在微孔表面,同时在含高浓度DMSO的杂交液中将非特异结合的探针解离,然后对被固定的特异杂交产物进行ELISA检测。结果 液相杂交的条件优化:杂交液中二甲基亚砜(DMSO)浓度为300 ml·L~(-1),探针浓度为0.5μmol·L~(-1),杂交温度为37℃。对60～600 bp的PCR产物的杂交特异性无明显差异,可以检测到1×10~4copy的PCR产物,对100例乙型肝炎患者的血清进行检测,HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性率为100％(30/30);HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBe(+)的血清检出HBVDNA阳性率为78.6％(22/28);HBsAg(+)、抗HBe(+)的血清检出HBV DNA阳性率为66.7％(16/24),其余为阴性。结论 该液相杂交法操作简单、快速、灵敏、特异,适合临床实验室使用。     

用于PCR产物检测的液相杂交法的优化

目的　为了使液相交在检测更加灵敏、特异、快速。方法　通过改进杂交液的成分 ,选择最佳的探针浓度 ,使 5’端标记生物素的PCR扩增产物与 5’端标记地高辛的探针在PCR反应管中进行液相杂交 ,杂交条件为 :94℃ 10s冷却到 37℃ 10s即完成杂交。杂交后产物通过链霉素亲和素被固定在微孔表面 ,同时在含高浓度DMSO的杂交液中将非特异结合的探针解离 ,然后对被固定的特异杂交产物进行ELISA检测。结果　液相杂交的条件优化 :杂交液中DMSO浓度为 30 0ml/L ,探针浓度为 0 5 μmol/L ,杂交温度为 37℃。对 6 0bp～ 6 0 0bp的PCR产物的杂交特异性无明显差异 ,可以检测到 1× 10 4copy的PCR产物 ,对 10 0例乙型肝炎患者的血清进行检测 ,HBsAg( )、HBeAg( )、抗HBc( )的血清检出HBVDNA阳性为 10 0 % (30 / 30 ) ;HBsAg( )、抗HBe( )、抗HBc( )的血清检出HBVDNA阳性为 10 0 % (30 /30 ) ;HBsAg( )、抗HBe( )、抗HBc( )的血清检出HBVDNA阳性为 78 6 % (2 2 / 2 8) ;HBsAg( )、抗HBc( )的血清检出HBVDNA阳性为 6 6 7% (16 / 2 4 ) ,其余为阴性。结论　该液相杂交法操作简单、快速、灵敏、特异 ,适合临床实验室使用     

用于包装复制缺陷性腺病毒的低代次293细胞的培养

目的:建立体外培养低代次293细胞的方法.方法:细胞复苏,将冻存的低代次293细胞于37℃水浴中快速融解,移入75 cm2细胞培养瓶中,加入10 mL低代次293细胞培养基,6～8 h细胞贴壁后更换培养基.细胞传代,吸出培养基,用1×柠檬酸盐细胞消化液洗2遍,留取0.5 mL 37℃消化5～10 min,待细胞脱壁后加入3 mL培养基,轻轻吹匀以1:2比率传代培养.细胞冻存,以1×柠檬酸盐细胞消化液消化5～10 min,细胞脱壁后加入5 mL细胞培养基中和消化液,离心收集细胞,以1 mL的细胞冻存液(90% FBS+10% DMSO)重悬、冻存.结果:细胞传代后8h细胞完全贴壁;以腺病毒感染质粒感染293细胞14 d后可观察到腺病毒空斑形成.结论:该方法操作简便,对细胞损伤小且保持细胞生物学特性不变.     

高度同源性人脂肪间充质干细胞体外分离培养条件的优化

背景:目前关于人脂肪间充质干细胞有效分离培养及扩增的方法尚未统一.目的:拟在体外建立人脂肪间充质干细胞的有效分离方法.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-06/12在吉林大学病理生物学教育部重点实验室完成.材料:手术切除的人腹部脂肪由吉林大学附属医院提供,提供者对实验均知情同意.方法:取腹部脂肪,去除结缔组织和血管,用0.1%Ⅰ型胶原酶37℃振荡消化60 min,过滤后离心,将位于最下层的片状沉淀用含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM条件培养基重悬,调整细胞密度至1×10~9L~(-1)接种于6孔板中,于37℃、体积分数为5%的CO_2孵箱内培养,待细胞接近80%～90%融合时消化传代.取P3代细胞,分别进行成骨及成脂肪诱导.主要观察指标:应用激光扫描共聚焦显微镜观察人脂肪间充质干细胞形态学特点;采用流式细胞仪和免疫荧光法检测其免疫学表型、细胞周期、生长曲线;观察其多向分化潜能.结果:分离培养的人脂肪间充质干细胞为成纤维细胞样,呈漩涡状排列.P3代人脂肪间充质干细胞呈CD73,CD105,CD166,CD44及CD29阳性,而CD31,CD34,CD45及HLA-DR阴性;具有典型的干细胞增殖特点,83.81%细胞处于G_0/G_1期,仅16.19%细胞处于S+G2/M期;细胞在接种后前2 d处于生长潜伏期.第3～6天处于对数生长期,第6天达峰值,以后细胞生长速度减慢,进入生长平台期,平均五六天传代1次.成骨诱导2周后,细胞碱性磷酸酶染色呈阳性;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,油红O染色呈阳性.结论:分离脂肪组织的过程中去除大体可见的血管与结缔组织可减少细胞污染;胶原酶浓度为0.1%和振荡消化时间为60 min时,可使基质细胞和脂肪基质纤维成分有效分离,以及使胶原酶与组织得到充分接触,从而获得高度同源性的人脂肪间充质干细胞.     

酶消化法获得成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞的体外原代培养及其特征鉴定

目的:建立成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞的原代培养方法,为进一步观察其电生理特性提供目标细胞。方法:实验于2005-04/08在第三军医大学第一附属医院中心实验室完成。①细胞提取:取1～2个月龄成年豚鼠2只,雌雄不限。麻醉状态下处死,下腹部10g/L碘伏消毒后,即刻由腹部正中切口、于膀胱颈处取出膀胱,于解剖显微镜下仔细剔除膀胱外膜,纵行剖开膀胱、去除膀胱黏膜,将膀胱肌层置入含双抗的磷酸盐缓冲溶液中浸泡10min。将上述处理的肌层组织剪成1mm小块,在含双抗的磷酸盐缓冲溶液中漂洗2次;换3入10g/L胶原酶P溶液,盖紧瓶盖,置入37℃培养箱中消化30min,完全消化溶解后,移入离心管中离心。②细胞培养:细胞沉淀中加入新鲜配制的达尔伯克()氏改良培养基溶液(含体积分数为0.1的胎牛血清),吹打后按每瓶(容积25mL)含(25～30)×10活细胞接种在培养瓶4内,37℃,积分数为0.05的CO2孵箱内静置培养;细胞接种第2天,可体见胞体为梭形并有两个细胞突起的细胞贴壁,平滑肌细胞尚未贴壁。将未贴壁的平滑肌细胞转移至另一培养瓶,孵箱内静置3d后,可见平滑肌细胞贴壁。③培养细胞的观察与鉴定:采用相差显微镜观察和免疫细胞化学方法鉴定。结果:①体外培养第2天可见胞体为梭形且胞体两极有两个细长突起的细胞贴壁,该类细胞酪氨酸蛋白激酶受体免疫细胞化学染色阳性,平滑肌肌动蛋白染色阴性,确认为豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞。②逼尿肌细胞3d后贴壁,呈成纤维形生长,平滑肌肌动蛋白免疫细胞化学染色阳性,酪氨酸蛋白激酶受体染色阴性。结论:用酶消化法可获得成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞,并在体外条件下生长,可用于卡哈尔间质细胞样细胞的电生理特性观察。     

甲状腺功能减退症致双眼视乳头水肿1例

患者男,59岁,因"乏力半年余,加重伴头痛、吐词不清、视力下降20+d"入我院.既往有慢性阻塞性肺疾病史10+年.查体:T 36.3℃,P 60次/min,R 20次/min,BP 150/80 mmHg,眼睑浮肿,口唇轻度紫绀,甲状腺未扪及,桶状胸,叩呈过清音,双肺呼吸音低,无干湿罗音.心脏、腹部(-).四肢无异常,未引出病理征.肝功:天门冬氨酸转移酶190 U/L(0～ 40 U/L),乳酸脱氢酶509U/L(109 ～ 245 U/L),α-羟丁酸脱氢酶513 U/L(72 ～ 182 U/L),余正常.心肌酶谱:肌酸激酶2524 IU/L(24 ～ 195 U/L),肌酸激酶同工酶136 IU/L(＜ 24 U/L),肌钙蛋白(-).血脂:胆固醇7.94mmol/L,甘油三酯1.53 mmol/L,高密度脂蛋白1.55 mmol/L,低密度脂蛋白4.96 mmol/L.甲肝、丙肝、戊肝抗体均为阴性,乙肝标志物:HBsAb(+),HBeAb (+),HBcAb (+).     

抗HCV阴性血浆和血液制品中的HCV RNA

为证实抗HCV试验筛选HCV阳性献血者之效果，作者用PCR检测6家生产商的抗HCV阴性血浆原料和血液制品。材料与方法血浆原料与Ⅷ因子为冰冻和冻干保存．白蛋白室温贮存．而静脉注射用免疫球蛋白（IVIG）和肌肉注射用免疫球蛋白（IMIG）为4℃贮存。实验样品在60℃保温1h，用等体积酚-氯仿抽提一次．而后氯仿抽提一次。以1：10加3M乙酸钠和2体积乙醇冰浴1h。室温高心1200g×15min沉淀核酸．弃去上清液，每管加750ul的70％乙醇。室温离心1200g×10min。淤34℃干燥10min并溶于5－20ul蒸馏水中。取5ul用于合成cDNA并进行扩增。PCR引物用…     

生物素标记探针-液相杂交-非变性PAGE检测非编码小RNA方法的建立和优化

目的 建立生物素标记探针-液相杂交-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测非编码小RNA(sRNA)的方法.方法 将生物素标记的sRNA U6寡核苷酸探针经非变性PAGE电泳后转印至尼龙膜上,然后用辣根过氧化物酶(HRP)耦联链霉亲和素进行检测.从细胞中提取总RNA,用已标记U6探针优化液相杂交退火条件及杂交缓冲液;用建立的方法 检测并计算BEAS-2B、A549细胞中sRNA U6与miRNA145的含量.结果 将Biotin-11-dUTP成功标记至寡核苷酸上,随着寡核苷酸浓度增加,检测信号强度越强,10 μmol/L时达到最强.采用水浴反应条件与采用聚合酶链反应(PCR)仪梯次降温反应条件下得到的杂化链无明显差异;以磷酸盐缓冲液作为杂交缓冲液优于Tris-HCl、DEPC水;BEAS-2B、A549细胞5 μg RNA中U6含量接近;BEAS-2B细胞中miRNA145绝对含量高于A549细胞.结论 成功建立并优化了sRNA检测新方法,为简单、易行、可靠地检测sRNA提供了可能.     

幽门螺杆菌耐药基因酶显色法芯片检测的探针和杂交条件优化

目的 探讨幽门螺杆菌耐药基因酶显色法芯片检测的寡核苷酸探针固定、探针浓度及杂交最佳条件.方法 设计spacer 为poly(dT)10的探针,与285 bp的digoxigenin标记的靶序列杂交,探针浓度选择5～50 μmol/L,杂交温度选择30～42℃,杂交时间选择0.5～1.5 h.结果 当spacer为poly(dT)10,探针浓度为15 μmol/L,杂交温度为37℃,杂交时间为0.5 h左右即可获得理想的杂交结果.结论 通过优化杂交条件可以有效地提高杂交效率.     

抗人类免疫缺陷病毒抗体酶联免疫吸附法检测条件的优化

目的 探讨抗人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体酶联免疫吸附法检测条件的优化途径.方法 比较不同离心和水浴条件下血清标本检测假阳性率.结果 3 000 r/min离心3 min和4 000 r/min离心5 min获得的血清标本假阳性率分别为7.64‰和1.80‰,二者比较差异有统计学意义(P<0.05).3 000 r/min离心3 min获得的血清标本,经未水浴、37 ℃水浴30 min、37 ℃水浴60 min处理后,假阳性率依次降低(P＜0.05).结论 适当提高离心速度、延长离心时间或增加水浴时间可降低因标本凝固不全导致的假阳性结果.     

无心电图及心肌酶改变的冠状动脉前降支完全闭塞一例报告

1 病例资料 男,38岁.因劳累性胸痛10 d就诊.既往无高血压病、糖尿病、高脂血症病史及家族史,有吸烟史10年,平均每日10支.查体：体温36.7℃,脉搏82/min,呼吸18/min,血压115/80 mmHg.发育正常,双肺呼吸音清,未闻及干湿性啰音;心界不大,心率82/min,律齐,各瓣膜听诊区无病理性杂音;腹平软,腹部未触及包块,肝、脾肋下未触及,Muohy征阴性,肠鸣音5/min,双下肢无水肿.查血常规、肝功能、肾功能、血糖、血脂、甲状腺功能、凝血功能等均正常,查乳酸脱氢酶120 U/L,丙氨酸转氨酶14 U/L,天冬氨酸转氨酶21 U/L,磷酸肌酸激酶94 U/L,磷酸肌酸激酶同工酶15 U/L,肌钙蛋白阴性.     

液相杂交技术在聚合酶链反应酶联免疫检测的应用

目的采用液相杂交技术,简化核酸杂交过程,建立乙肝病毒（HBV）的液相杂交的聚合酶链反应-酶联免疫检测（PCR-ELISA）方法。方法将5′端标记生物素的PCR扩增产物与5′端标记地高辛的探针呈液相混合,90℃2min,55℃1min杂交。杂交后产物被链霉亲和素酶标板固定,经酶标记抗地高辛标记抗体结合、显色。结果液相杂交酶联免疫检测条件优化探针浓度3pmol/次,酶标记抗体稀释度1∶1000。液相杂交时间3min,固相杂交时间120min,但其检测结果无明显差别。检测灵敏度1×10     

静脉滴注还原型谷胱甘肽致过敏反应1例

1 病例简介 患者男,37岁,因HBsAg阳性10年,肋痛、乏力20d于2007年2月17日收入我科.入院查体：T 36.5℃,P 80次/min,R 20次/min,BP 13.3/8 kPa.神志清楚,肝掌阳性,无蜘蛛痣,肝区叩击痛.实验室检查：HBsAg（＋）、HBsAb（-）、HBeAg（＋）、HBeAb（-）、HBcAb（＋）,ALT 44.6 U/L、AST 42.1U/L.B超示：轻-中度脂肪肝.     

人早孕绒毛滋养层细胞原代培养:差异贴壁法与消化排除法联合应用的可行性

背景:国内外有关人绒毛膜滋养层细胞的体外培养方法,大多步骤繁琐,细胞纯度低而且成本很高,不适于普通实验室推广应用.目的:拟求建立一种人妊娠5～10周绒毛滋养层细胞简便有效的分离培养及鉴定方法.方法:采用改进的胰酶消化法分离培养妊娠5～10周人绒毛滋养层细胞,加0.0625%胰酶,37℃消化25～40 min;以差速贴壁法和消化排除法纯化细胞,倒置显微镜观察细胞形态,细胞免疫化学方法鉴定细胞来源和纯度.结果与结论:倒置显微镜下原代培养滋养层细胞接种后见大量圆形细胞悬浮存在,1h后可见部分细胞贴壁,24h后70%～80%细胞贴壁,五六天细胞数量明显增多,细胞呈三角形、多边形平铺片状生长,核大卵圆形居中,部分细胞连接成片,部分细胞呈长梭形.七八天长满瓶壁的80%～90%可传代.9～10d铺满培养瓶底部.细胞碎屑不贴壁.传代接种后1.5 h贴壁,迅速增长,三四天爬满瓶底,各代细胞形态基本一致.可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长.细胞角蛋白染色阳性,波形蛋白染色阴性细胞达70%～80%.采用低浓度胰酶进行长时间消化分离培养人早孕绒毛滋养层细胞,利用差异贴壁法和消化排除法以及反复换液法进行纯化,可简单、快捷地获得较高纯度的人早孕绒毛滋养层细胞.     

茅根二草汤加味治疗儿童急性黄疸型肝炎83例

笔者拟茅根二草汤加味治疗83例儿童急性黄疸型肝炎,疗效满意,现报道如下: 临床资料本组病人均符合急性黄疸型肝炎的诊断标准。多有黄疸、胁痛、腹胀、纳少、恶心厌油等症状,均有肝脏肿大,触痛及肝功能异常。其中SGPT40~(U+)～100~U17例,100~(U+)～200~U29例,200~U以上37例。黄疸指数6~(U+)～10~U11例,10~(U+)～20~U49例,20~(U+)23例。HBsAg均阴性。全     

心肌酶异常增高误诊分析

1病例介绍患者,62岁,女性,主因胸闷、胸痛半个月,加重2h于2006-08-26入院。患者近半个月来无诱因出现胸闷、胸痛,伴腰背部及四肢关节疼痛,呈持续性,阵发性加重,严重时出汗,入院前2h前胸闷、胸痛加重,伴气短、出汗急诊来院。近一个月以来患者有低热病史,T36·5～37·8℃。查体:T37℃,P80次/min,R20次/min,BP120/70mm Hg,意识清,轻度贫血貌,双肺无啰音,心率80次/min,律齐,四肢关节无肿胀、压痛,腰背有压痛。余正常。入院后心电图示:窦性心律,V3～6导联ST段压低0·1～0·2mV,T波低平。急查心肌酶明显增高,AST64U/L(0～40U/L),CK220U/…     

体外分离培养人源性脂肪间充质干细胞及其鉴定

目的 体外分离培养人皮下脂肪来源的细胞群,依据国际标准规定通过形态观察、免疫表型检测及多种分化潜能的鉴定证实体外获得的细胞群为脂肪来源的间充质干细胞.方法 采用0.1％胶原酶Ⅰ及0.25％胰酶双消化法进行细胞的体外分离,LG-DMEM培养基加入体积分数为10％胎牛血清,于37℃、5％ CO2的饱和湿度条件下培养,待细胞生长至70％ ～ 80％融合时消化传代扩增.通过倒置显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞免疫表型表达;取第3代细胞,于培养基中分别加入成骨及成脂诱导剂进行定向诱导分化,并对诱导后的细胞染色鉴定.结果 分离培养的细胞群呈长梭状,漩涡样贴壁生长;流式细胞仪检测P2代细胞,其中CD73,CD105,C90,CD44,CD29及CD49d呈阳性表达,而CD14,CD34,CD45,HLA-DR及CD106呈阴性表达;成骨诱导3周后,茜素红染色、VON-KOSSA染色及细胞碱性磷酸酶染色都呈阳性;成脂诱导2周后,细胞内有小脂滴出现,油红O染色呈阳性.结论 胶原酶胰酶双消化法从脂肪组织中分离获得的细胞可贴壁生长;流式细胞仪检测证实细胞表达与间充质干细胞相符的免疫表型;定向诱导后具有成骨及成脂分化能力;符合间充质干细胞的特性.