一种简单γδT细胞扩增培养方法及其抗肿瘤生物学功能研究

目的 :建立一种特异快速地诱导扩增人外周血γδT细胞的方法 ,并比较了γδT细胞 ,NK和LAK细胞的抗肿瘤的生物学特性。方法 :收集用不同单抗分别包被粘附的细胞 ,然后通过MACS细胞分选仪的分选 ,获取的细胞进行细胞增殖动力学、细胞表型、细胞杀伤活性的测定以及单抗阻断效应的分析。结果 :经MACS分离得到的γδT细胞 ,培养 2周后细胞数扩增 6 0 0～ 80 0倍 ,CD3,CD8和γδ细胞表达阳性率分别是 72 .2 9% ,5 8.0 2 %和 6 5 .98%。γδT细胞对NK敏感细胞K5 6 2以及NK不敏感细胞Raji和XG 7这 3种不同靶细胞均有较高的杀伤率 ,分别为 35 .98% ,5 2 .2 7%和 6 9.0 8% ;NK细胞对此 3种细胞的杀伤率分别是 45 2 1% ,12 .34%和 11.94% ;LAK细胞的杀伤率分别为 44 .0 1% ,2 9.2 7%和 2 5 .6 8%。γδT细胞对经MHC Ⅰ类单抗阻断前后的K5 6 2 ,Raji和XG 73种靶细胞的杀伤率无明显改变。结论 :γδT细胞、NK细胞和LAK细胞都具有一定的非特异性杀伤肿瘤细胞的作用 ;γδT细胞对MHC Ⅰ类单抗阻断后的肿瘤细胞的杀伤无明显变化。提示γδT细胞较NK细胞和LAK细胞有更广泛的抗瘤谱     

脐血CD3AK细胞治疗恶性肿瘤的临床应用研究

目的:研究用脐血单个核细胞制备CD3AK细胞的抗肿瘤作用,探讨肿瘤生物治疗近期疗效的免疫指标.方法:分离脐血单个核细胞,分别用IL-2和IL-2 CD3Ab诱导LAK和CD3AK细胞,并测其扩增数量和对K562细胞的杀伤活性;测定肿瘤患者用CD3AK细胞治疗前后外周血T淋巴细胞亚群绝对计数的变化情况和外周血单核细胞(PBMC)的NK杀伤活性.结果:脐血LAK细胞和脐血CD3AK细胞均于培养后11天时扩增倍数最高,分别是培养前的18倍、24倍,对K562的杀伤活性分别是培养前的2.6倍和3.2倍;肿瘤患者输注CD3AK细胞一疗程后,其外周血T淋巴细胞亚群绝对计数有明显升高:总T升高66.0%,Th升高68.0%,Ts升高58.0%;其PBMC的NK杀伤活性由63.0%升高到81.0%,平均升高28.0%.结论:1)脐血单个核细胞是LAK细胞和CD3AK细胞良好的前体细胞.2)LAK和CD3AK细胞的数量和杀伤能力在培养的11天时达高峰,而且CD3AK细胞数量和杀伤活性明显优于LAK细胞.3)CD3AK细胞输注能明显提高肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群绝对计数和PBMC的NK活性.4)肿瘤患者的外周血T淋巴细胞计数和PBMC的NK活性测定可望成为肿瘤生物治疗的一个近期疗效参数.     

脐血CD_3AK细胞的制备、生物活性测定及临床应用初探

 目的　研究用脐血单个核细胞制备CD3 AK细胞的抗肿瘤作用 ,探讨肿瘤生物治疗近期疗效的免疫指标。方法　分离脐血单个核细胞 ,分别用IL 2和IL 2 +CD3 Ab诱导LAK和CD3AK细胞 ,并测其扩增数量和对K5 6 2细胞的杀伤活性 ;测定肿瘤患者用CD3 AK细胞治疗前后外周血单核细胞(PBMC)的NK杀伤活性。结果　脐血LAK细胞和脐血CD3 AK细胞均于培养后第 11天时扩增倍数最高 ,分别是培养前的 18倍、2 4倍 ,对K5 6 2的杀伤活性分别是培养前的 2 .6倍和 3.2倍 ;肿瘤患者输注CD3 AK细胞一疗程后 ,其PBMC的NK杀伤活性由 6 2 %升高到 82 % ,平均升高 32 %。结论　 (1)脐血单个核细胞是LAK细胞和CD3 AK细胞良好的前体细胞。 (2 )LAK和CD3 AK细胞的数量和杀伤能力在培养的第 11天时达高峰 ,而且CD3 AK细胞数量和杀伤活性明显优于LAK细胞。 (3)CD3 AK细胞输注能明显提高肿瘤患者PBMC的NK活性。 (4 )肿瘤病人PBMC的NK活性测定可望成为肿瘤生物治疗的一个近期疗效参数     

A-NK细胞的抗肿瘤作用

过继免疫治疗（AIT）是肿瘤生物治疗中的主要疗法。20世纪80年代起，LAK、TIL、CIL、CD3AK等效应细胞陆续被研究，国内外基础研究和临床应用报道层出不穷。1988年Vujanovic首次从LAK细胞中分离纯化了一种具有高效杀伤活性的LAK亚群，因其具有黏附在塑料表面的特征，故命名为A-LAK（adherent LAK）。20世纪90年代后以A—NK（IL-2 activated NK cell）代替了A-LAK。本实验参照文献简便快速地制备A-NK细胞，并在动物肝癌模型研究其抗肿瘤作用。     

多细胞过继性免疫治疗治疗晚期恶性肿瘤的近期疗效及安全性分析

目的:初步观察DC、CIK、γδT、CD3AK及NK细胞多细胞过继性免疫治疗对晚期恶性肿瘤患者的近期临床疗效及安全性分析。方法:对我院在2014年10月至2015年10月收治的162例次晚期恶性肿瘤患者进行多细胞过继性细胞免疫治疗,血细胞分离机单采自体外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC),体外培养扩增DC、CIK、γδT、CD3AK及NK细胞,采用FCM法检测各细胞表型,并按计划序贯回输给患者进行治疗。结果:69例（43%）患者临床症状有不同程度改善,尤其是精神、食欲及睡眠质量改善最为明显,安全性分析显示主要不良反应为发热,占15%,28例完成3疗程免疫治疗患者瘤体变化为部分缓解（partial remission,PR）2例,疾病稳定（stable disease,SD）16例,疾病控制率（disease control rate,DCR）为64%。结论:DC、CIK、γδT、CD3AK及NK细胞过继性免疫治疗对晚期恶性肿瘤安全有效,可明显改善其生活质量,具有一定的临床应用前景。     

B-NHL患者NK细胞中CD16ζ表达及利妥昔单抗与LAK细胞的联合抗瘤作用

背景与目的:自然杀伤细胞(nature killer cell,NK)是抗体依赖细胞介导的细胞毒作用的主要效应细胞,肿瘤患者普遍存在NK细胞活化功能的缺陷可能会影响单克隆抗体的治疗效果.因此如能逆转NK细胞的CD16ζ链信号转导的功能缺陷,并与单克隆抗体联合免疫治疗,可能会产生协同抗肿瘤作用.本研究的目的是了解B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin's lymphoma,B-NHL)患者是否存在NK细胞的活化障碍,体外白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)是否能完全逆转其活化障碍,并观察利妥昔单抗与LAK细胞联合对肿瘤细胞的杀伤作用.方法:使用密度梯度离心方法分别分离69例B-NHL患者和30例健康志愿者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),将两种PBMC在体外与1 000 U/ml IL-12共同培养制备LAK细胞,流式细胞仪检测PBMC和LAK细胞中CD16ζ链的阳性率和平均荧光强度.流式细胞仪检测Raji细胞表面CD20的表达;Annexin V/PI方法检测利妥昔单抗单药对Raji细胞的促凋亡作用,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放实验进行杀伤活性的检测.结果:在B-NHL组和健康对照组,CD56 细胞表达CD16ζ链的阳性率为(63.3±16.4)%、(97.8±3.1)%(P＜0.001),CD16ζ链MFI值分别为1.3±1.3和3.6±1.7(P＜0.001).在体外1 000 U/ml的IL-2共培养的LAK细胞中,两组CD16ζ链的阳性率分别为(99.3±4.1)%和(99.7 3.9)%,其MFI值分别为29.2±12.5和31.4±13.8,均无显著性差异(P=0.15和P=0.44).40 μg/ml利妥昔单抗可以完全结合细胞表面CD20抗原,在24 h时才开始出现对Raji细胞的明显的凋亡作用.利妥昔单抗与LAK细胞联合对Raji细胞的杀伤率在不同的浓度组均明显高于不加利妥昔单抗组(P＜0.05).LAK细胞与Herceptin(40 μg/ml)联合的杀伤率与不加Herceptin组相比,在各效靶比浓度梯度均无明显提高(P＞0.05).LAK细胞与利妥昔单抗联合对Jurket细胞的杀伤率在各效靶比浓度梯度均与不加利妥昔单抗组无显著性差异(P＞0.05).结论:B-NHL患者普遍存在NK细胞CD16ζ链的表达下调,高剂量的IL-2可以显著增强CD16ζ链的表达,利妥昔单抗与LAK细胞联合可增强对Raji细胞的抗肿瘤作用.     

一种高效的LAK细胞——A—LAK细胞

LAK 细胞用于晚期癌症病人的过继免疫治疗已取得可喜成果。本文介绍了一种高效 LAK细胞——A-LAK 细胞的分离培养方法、体内外抗瘤活性,并分析了其用于肿瘤过继免疫治疗的优点。     

γδT细胞对血液肿瘤细胞的体外杀伤活性

目的:建立γδT细胞培养体系,探讨γδT细胞对不同血液肿瘤细胞的杀伤活性.方法:选取2016年1月至2016年4月在解放军第307医院造血于细胞移植科收治的4例B细胞淋巴瘤患者和该院5例体检健康志愿者,分别分离其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用唑来磷酸(zoledronate,Zol)和IL-2体外扩增γδT细胞,采用流式细胞术检测γδT细胞对血液肿瘤细胞Jurkat、THP-1、HL-60、K562、Raji、U-937和RPMI-8226的杀伤活性,比较CIK、NK和γδT三种细胞对K562细胞的杀伤作用,检测γδT细胞IFN-γ、TNF-α的分泌水平及CD107a分子的表达水平.结果:成功在体外扩增外周血γδT细胞;γδT细胞对Jurkat、THP-1、HL-60、K562、U-937和RPMI-8226细胞均有明显的杀伤活性(P＜0.05);γδT细胞对K562细胞的杀伤活性与NK细胞无统计学差异,但明显强于CIK细胞(P＜0.01);随着与K562细胞共孵育时间的延长,γδT细胞分泌IFN-γ的水平呈现出时间依赖性增加,TNF-α在8h后逐渐增加;与K562细胞或HL-60细胞共孵育后,γδT细胞CD107a分子的表达水平均显著增加(P＜0.01).结论:体外扩增的γδT细胞对血液肿瘤细胞具有较高的杀伤活性,为血液肿瘤的细胞免疫治疗提供实验依据.     

NK细胞在肿瘤过继性免疫治疗中的临床应用与研究进展

目的 自然杀伤(natural killer,NK)细胞是固有免疫细胞,是机体抗肿瘤的第一道防线.NK细胞无需预先致敏即可杀伤肿瘤细胞,具有良好的安全性和抗肿瘤作用.NK细胞作为抗肿瘤过继免疫细胞治疗制剂在世界范围内广泛应用.本文总结NK细胞在肿瘤过继性免疫治疗中的临床应用与研究进展.方法 应用PubMed、Elsevier、Springer、Wiley Online Library和CNKI文献检索系统,以“NK细胞,NK细胞与肿瘤生物治疗,NK细胞与肿瘤过继性免疫治疗”为关键词,检索1964-06-2015-12的有关文献.纳入标准:1)与NK细胞生物学相关的文献;2)与NK细胞体外扩增相关的文献;3)与NK细胞过继治疗血液性肿瘤及实体瘤的Ⅰ期及Ⅱ期临床研究相关的文献;4)与未来NK细胞临床应用研究方向相关的文献.根据纳入标准分析文献81篇.结果 NK细胞对肿瘤的杀伤活性主要取决于细胞表面活化性受体和抑制性受体间的动态平衡.目前,广泛认为基于NK细胞的过继性免疫治疗是具有良好潜力的肿瘤治疗方案.能否在GMP水平体外激活、扩增获得大量的NK细胞对肿瘤的过继治疗至关重要.用于体外扩增的NK细胞的来源包括外周血、脐带血以及干细胞.用于刺激NK细胞扩增的方法也不尽相同,包括可溶性细胞因子、抗体以及其他分子等.目前,自体或同种异体NK细过继疗法在血液或实体肿瘤治疗中广泛应用,但国外更倾向于应用同种异体NK细胞过继治疗.结论 NK细胞在肿瘤的过继性免疫治疗中具有重要临床意义和应用潜力,同时也面临诸多技术难题有待突破.     

DC／CIK细胞在非小细胞肺癌治疗中的研究进展

树突状细胞／细胞因子诱导的杀伤细胞（dendritic cells／cytokine－induced killer cells,DC／CIK）是新型的异质性免疫效应细胞群,其主要的效应细胞同时表达CD3＋和CD56＋两种膜蛋白分子,兼有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和自然杀伤（natural killer,NK）细胞的非主要组织相容性复合体（non－major histocom-patibility complex,MHC）限制性杀瘤特点。其与手术、放疗、化疗等方法相结合治疗非小细胞肺癌（non－small cell lung cancer,NSCLC）,可以使患者获得更高的生存率,显著提高患者的生活质量。DC／CIK由于其强大的体外扩增能力和抗肿瘤活性而迅速成为目前过继免疫治疗的有效方法之一。     

人外周血γδT细胞CD107a的表达变化与细胞毒活性的关系

目的:探讨人外周血γδT细胞体外诱导过程中CD107a的表达变化及其与γδT细胞细胞毒活性的关系。方法:分离健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),加入含有IL-2和异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyro-phosphate,IPP)的培养基,体外诱导γδT细胞。分别在第7、10、14天以流式细胞仪对培养的γδT细胞进行鉴定,并同时检测其CD107a、穿孔素和颗粒酶B的表达。CCK-8试剂盒检测γδT细胞对胰腺癌细胞SW-1990的杀伤效应。采用SPSS13.0软件进行spearman相关分析。结果:在培养的第7、10、14天,γδTCR阳性细胞分别为(60.31±3.84)%、(66.45±4.25)%、(70.99±4.66)%。CD107a、穿孔素和颗粒酶B的表达在γδT细胞培养第7~10天达到峰值后呈下降趋势,第7天与第0天相比差异有统计学意义[(80.66±4.42)%、(70.11±3.34)%、(94.26±4.25)%vs(69.02±5.04)%、(62.31±4.66)%、(53.62±3.69)%,P<0.05]。培养第7天、第10天的γδT细胞对SW-1990细胞杀伤率显著高于第14天的γδT细胞[(58.86±5.12)%、(61.53±4.69)%vs(40.31±4.83)%,P<0.05]。γδT细胞CD107a表达与穿孔素、颗粒酶B、其对SW-1990细胞杀伤效应显著相关(r=0.853,r=0.785,r=0.839,均P<0.01)。结论:人外周血γδT细胞CD107a的表达与其抗肿瘤能力正相关,可能是γδT细胞细胞毒活性的一个标志。     

人参皂甙Rg1协同诱生LAK细胞的抗瘤活性

淋巴因子激活性杀伤细胞(LAK细胞)过继输入疗法已经被证明是一种有效的抗肿瘤免疫治疗措施,但此疗法的临床应用却受到LSK细胞抗瘤活性尚低问题的困扰.我们曾经证明人参总皂甙能够增强LAK细胞杀伤新鲜急性白血病细胞的活性,本文进一步检测了人参总皂甙的单体之一人参皂甙Rg_1(Ginsenoside Rg_1)对LAK细胞抗瘤活性的影响,报告如下.     

肝癌患者自体CD3AK细胞与LAK细胞的杀伤活性比较

目的 比较肝癌患者自体CD3AK细胞和LAK细胞的杀伤活性,为临床是供依据。方法 以流式细胞仪检测细胞的杀伤活性。结果 原发性肝癌患者自体的CD3AK细胞的NK活性和LAK活性均高于LAK细胞。结论 CD3AK细胞效果稳定,抗瘤效应明显高于LAK细胞,CD3AK细胞可望作为一种新的生物治疗手段用于肿瘤治疗。     

非小细胞肺癌过继细胞免疫治疗的研究进展

目前非小细胞肺癌发病率高,预后差,需要研究新的治疗方法。肿瘤的发生、发展和转移与人体免疫系统密切相关,过继输注免疫细胞是免疫治疗的一种方法,能够显著提高机体免疫系统的抗肿瘤效应。过继输注的免疫细胞多样,如 LAK、TIL、NK、γδ T、CIK、CTL 等,通过输注不同的免疫细胞或联合其他治疗介导靶细胞凋亡,可增强抗肿瘤效应。本文介绍各种免疫细胞的抗肿瘤的机制并回顾近几年治疗非小细胞肺癌的相关试验研究。     

脐血CIK细胞的体外增生及其抗肿瘤效应

 【摘要】　目的　研究脐血CIK细胞体外增生活性及对肿瘤细胞的杀伤活性，为CIK细胞在肿瘤过继免疫治疗中的应用提供实验依据。方法　脐血经密度梯度离心获得单个核细胞，以CD3单抗、重组人白细胞介素-2（rhIL-2）、重组人白细胞介素-1（rhIL-1）和重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）为诱导剂制备多种细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）。并设只加IL-2诱导成的LAK细胞和未加细胞因子的脐血单个核细胞（CBMNC）作为对照。培养前后分别用显微镜观察细胞形态，流式细胞术测定细胞表型的改变，锥虫蓝拒染法测定细胞增生水平，四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定对肺癌细胞的杀伤活性。结果　实验发现，通过细胞因子的联合，可大量诱导出高活性的CIK细胞，CIK细胞在培养的第5天开始增生，第14天达到高峰，增生的细胞表型以CD+3 CD+56细胞为主。而LAK细胞的增生高峰出现在第7天，随后增生不明显；CBMNC表型无明显变化，增生不明显。CIK细胞针对肿瘤细胞的体外杀伤活性高于LAK细胞和CBMNC。结论　在体外细胞因子的联合作用下脐血能成功地诱导出大量的CIK细胞。脐血CIK细胞体外扩增快，杀伤活性强，对肿瘤细胞的作用优于传统的LAK细胞，为肿瘤的过继性免疫治疗提供了一个新的方向。     

细胞因子诱导的杀伤细胞在肿瘤治疗中的作用

 细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）治疗是在手术、化疗和放疗之后的第4大肿瘤治疗手段,是目前肿瘤治疗的发展方向。它是一种新型的免疫活性细胞,该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子,因此又将其称之为自然细胞杀伤样T淋巴细胞。CIK在临床应用比较广泛,在血液系统肿瘤、实体瘤的治疗中都取得了较好的临床疗效,是抗肿瘤过继免疫治疗的新希望。     

人外周血细胞毒性CD3-CD56+ NK细胞高效扩增的研究

 目的　探索从人PBMC中高效扩增细胞毒性CD3-CD5 6 + NK细胞的方法。方法　使用干细胞生长培养基 (SCGM )和RPMI 16 4 0培养基 ,在抗CD3单抗、IL 2和植物血凝素 (PHA)的作用下从 5例健康成人PBMC中诱导扩增CD3-CD5 6 + NK细胞 ,并用MTT法检测其细胞毒活性。结果　只有在使用SCGM为基础培养基时 ,PBMC经抗CD3单抗、IL 2作用获得大量增殖 ,在PHA存在时获得最大增殖(P <0 .0 5 ) ,在 14天时扩增 5 1.3± 7.2倍 ,含有 (5 2 .4± 7.9) %CD3-CD5 6 + NK细胞和 (14 .2± 4 .0 ) %CD3+ CD5 6 + T细胞 ;在效 /靶比 10∶1时 ,对K5 6 2和Raji的杀伤率分别达83.7%和 5 5 .8%。结论　可使用SCGM ,在抗CD3单抗、IL 2和PHA协同作用下大量扩增细胞毒性CD3-CD5 6 + NK细胞 ,为应用NK细胞进行肿瘤过继免疫治疗提供了一种简单有效的扩增NK细胞的方法。     

NK细胞在急性髓细胞性白血病过继性免疫治疗中的应用及其进展

[摘要] 自然杀伤（NK）细胞为体内固有免疫细胞,无需抗原致敏即可直接识别并杀伤肿瘤细胞等。随着对NK细胞抗肿瘤机制深入认识、NK细胞扩增方法优化等方面的进展,以NK细胞为基础的血液肿瘤过继免疗法越来受到关注,尤其异体NK细胞过继性免疫治疗急性髓细胞性白血病（AML）疗效显著。随着精准医学发展、NK 细胞抗肿瘤机制的深入研究以及大样本多中心临床研究逐步开展,相信不久的将来更为有效的异体NK 细胞过继性免疫治疗方案会使更多的AML患者获益。本文就NK 细胞生物学特点、细胞的制备方法、在非移植背景下AML中的临床应用及在AML造血干细胞移植（HSCT）中的应用进行阐述,以期为后续的深入研究和临床治疗提供参考。     

树突状细胞对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞影响的研究

目的：研究人外周血树突细胞（dendriticcell,DC）对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞的影响,以期获得具有抗原特异性杀伤功能的细胞毒活性细胞,并分别对CIK、LAK和CD3AK的杀伤效果进行比较.方法：采用某一肺腺癌肿瘤患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMNC）,经体外诱导分别扩增出CIK、LAK、CD3AK和DC细胞,再将靶细胞抗原孵育过的DC同三种细胞共同培养,通过镜下动态观察CIK联合DC对癌性胸腔积液中肿瘤细胞的杀伤活性,并利用MTT法检测CIK联合DC体外杀伤人肺腺癌细胞系（SPC-A1）的活性,同时比较CIK、LAK和CD3AK三种细胞的体外杀瘤活性.结果：CIK-ADC的杀伤活性最强为92.3%,明显高于单纯CIK的59.7%和DC-CIK的79.8%,（P值分别为0.025和0.042）,提示CIK A-DC细胞对肿瘤杀伤的特异性.而DC-CIK的杀伤活性为79.8%,也高于单纯CIK对照组59.7%,P=0.034,说明DC具有明显增强CIK细胞杀瘤活性的功能.同时,不论从单纯CIK、LAK、CD3AK细胞毒活性,或是从三种细胞联合DC的细胞毒活性比较,CIK细胞较后两种细胞都具有更强的杀伤活性,P值分别为0.038和0.022.联合DC的自体CIK细胞体外杀瘤活性显著增强,CIK细胞的杀伤活性显著高于LAK、CD3AK两种细胞.结论：DC可明显提高自体CIK细胞的体外杀瘤活性.     

同种LAK细胞治疗癌性胸腹水的疗效观察

采用同种淋巴因子激活的杀伤细胞(简称同种 LAK 细胞)进行过继性免疫治疗是恶性肿瘤免疫治疗的新领域。同种 LAK 细胞临床应用的关键问题近年来已逐步得到解决。现已证明同种 LAK 细咆具有与同系 LAK 细胞相同的抗肿瘤作用。临床应用结果表明同种 LAK细胞对某些肿瘤具有一定的抗肿瘤效果,可使肿瘤不同程度的缩小或完全消失。近年来我们研究室对同种 LAK 细胞进行了较为系统的基础与临床应用研究。在此基础上,我们用同种 LAK 细胞对84例癌性胸水及20例癌性腹水进行了治疗,现将结果报告如下。