莱姆病螺旋体83kd抗原蛋白基因特异性区段真核及原核表达型载体的 …

从莱姆病螺旋体染色体编码８３ｋｄ抗原蛋白基因序列中选择编码近Ｃ端１５９个氨基酸的基因序列作为扩增的靶序列,自行设计并合成一对寡核苷酸引物,以莱姆病螺旋体Ｂ３１株基因组ＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ扩增得到约４７７ｂｐ的扩增片段,再把该片段与质粒载体;ＢＫ－ＣＭＶ进行重组,经鉴定得到重组质粒ＰＢＸ１。     

乙肝病毒抗原基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)相关抗原基因真核表达载体,检测各抗原基因在体外真核细胞中的表达情况.方法:以含有1.3倍的HBV全基因组序列的质粒PcDNA3.1-HBV为模板,PCR扩增HBV的各抗原基因片段,通过连接至中间克隆载体Peasy-T1-Simple,酶切及测序鉴定正确后,...     

人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的：构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体，大肠杆菌表达其融合蛋白．方法：采用反转录．聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2cDNA中，分别扩增出Heparanase编码基因，用限制性内切酶BamHI消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1中，经酶切鉴定与测序证实后，连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体，以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点，转化大肠杆菌BL21菌株，异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白．结果：构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实，与GenBank登录结果完全一致；双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3．1及pRSET；SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功．结论：成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体，成功正确表达了6His／Heparanase融合蛋白     

VEGF-C真核表达载体的构建及蛋白表达

目的构建人血管内皮生长因子(VEGF-C)编码序列基因真核表达载体,为探讨VEGF-C的生物学功能奠定基础.方法根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从肿瘤细胞株cDNA中扩增出人VEGF-C编码序列基因片段,测序正确后用限制性内切酶将目的片段插入PcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中.采用酶切和PCR鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行瞬时表达.结论经RT-PCR扩增转染细胞cDNA和Western blotting检测证实重组质粒pcDNA3.1-VEGF-C能在宿主细胞中高效表达.     

人核糖体蛋白S13编码基因的克隆及其正反义真核表达载体的构建

目的：克隆人核糖体蛋白S13(RPS13)cDNA片编码区全长序列，构建其正、反义真核表达载体，以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法：采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列，DNA重组技术构建其正、反义真核表达载体。结果：RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列，经DNA序列分析，证实与文献报道的人RPS13编码区序列一致。目的基因分别按正、反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（ ），并经酶切鉴定证实。结论：成功克隆了人RPS13编码区全长基因序列，并构建了正、反义真核表达载体。     

人瘦素基因的原核表达载体构建及其蛋白结构分析

目的 克隆人源Leptin的成熟肽编码序列后基因并构建其原核重组表达菌株,对其产物进行纯化鉴定;生物信息学分析其蛋白质结构并预测功能.方法 提取人脂肪干细胞中的总RNA,经RT-PCR反转录获得cDNA序列,PCR扩增Leptin基因并将其克隆入表达载体pET-28a(+)原核质粒,构建该基因的重组原核表达载体pET-28a-Leptin.随后进行双酶切和测序鉴定.在E.coli BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,通过WB检测Leptin蛋白的表达;利用在线网络生物信息学相关数据库和分析软件对测序结果进行分析,并对重组蛋白结构及功能等进行验证和预测.结果 PCR扩增得到Leptin目标DNA片段;成功构建重组表达质粒pET-28a-Leptin,经IPTG诱导表达后,目的蛋白在宿主E.coli BL21 (DE3)中高效表达Leptin融合蛋白,相对分子质量18000.生物信息学检索该基因编码蛋白的氨基酸序列与理化参数显示,蛋白无跨膜区,有6个Ser、1个Thr可能为蛋白激酶磷酸化位点,第1～21位可能为信号肽区域.在Leptin氨基酸序列中:α-螺旋93处,无规则卷曲43处,延伸链17处,β-转角14处,分别占总二级结构的55.69％、25.75％、10.18％和8.38％.结论 成功克隆了人的Leptin基因.利用原核载体表达系统成功表达并进一步纯化的Leptin蛋白具有免疫原性.其生物信息学分析及结合蛋白质结构与功能预测结果可为深入研究Leptin蛋白的活性作用提供有益借鉴.     

钩端螺旋体外膜抗原基因OMPL1在卡介苗中的克隆和初步表达

采用ＰＣＲ技术直接从致病性钩端螺旋体整形０１７菌株基因组中扩增钩体外膜蛋白基因ＯｍｐＬ１，并克隆到大肠杆菌－卡介苗穿梭质粒载体ＰＨ６００２中，重组质粒经电转化导入卡介苗。玉点杂交筛选重组卡介苗，再通过免疫印迹对其表达进行初步研究。     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的：构建人CIDE-3基因的原核表达载体，并在E．coli BL21（DE3）中表达．方法：提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA，经RT—PCR扩增人CIDE-3基因片段，并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中，构建重组质粒pET28a（＋）-CIDE-3.经限制性内切酶Bam H I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后，转化E．coli BL21（DE3），经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白．     

NS特异性siRNA真核表达载体的构建

目的：构建nucleostemin(核干细胞因子，NS)特异性siRNA真核表达载体。方法：以小鼠组织基因组DNA为模板，PCR方法克隆小鼠编码U6 snRNA基因的启动于，将NS—siRNA表达序列、PolⅢ识别的终止信号与U6启动于连接起来，并将其插入pcDNA4／C载体中。结果：(1)从小鼠基因组DNA中克隆到编码U6 snRNA基因的启动子，(2)构建了含有U6启动子、NS—siRNA表达序列和PolⅢ识别终止信号的NS—siRNA表达的片段，(3)将NS—siRNA表达片段插入了pcDNA4／C真核表达载体。结论：构建了针对NS特异性的siRNA真核表达载体pcDNA4／C—NS—Silencer。     

霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR的PCR扩增及克隆

为了构建霍乱弧菌和杜氏利什曼原虫双价口服活疫苗候选株,作者采用PCR对霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR进行扩增及克隆,并对霍乱弧菌toxR基因进行限制性酶切分析.结果显示:7株霍乱弧菌均扩增出1.3kb的toxR基因片段,toxR基因中部含有EcoRⅠ酶切位点,再将toxR基因克隆在质粒pAT153上,对所获的重组质粒ptR4进行限制性酶切分析,证实质粒ptR4插入的1.3kb的DNA片段为toxR基因片段.     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增和克隆

目的　克隆日本血吸虫卵壳蛋白基因 ,以研究其在诊断和作为候选疫苗分子的作用。方法　设计合成引物 ,以日本血吸虫雌性成虫cDNA第一链为模板 ,用PCR法扩增日本血吸虫卵壳蛋白 (SchistosomajaponicumeggshellproteinSjEP)基因编码序列 ,并克隆入pGEM T质粒载体。结果　PCR法扩增出大小为 62 4bp的单一条带 ,将其克隆入载体获重组质粒 pGEM T SjEP ,经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增 ,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段。结论　日本血吸虫卵壳蛋白的编码基因重组质粒的成功构建 ,为进一步研究提供了条件。     

用PCR法从大肠杆菌K12菌株中克隆tyrB基因

用PCR法从大肠杆菌K12菌株中调出一个长约1.2 kb的DNA片段,该片段插入pKK233-2表达载体后转化tyrB~-菌JP4282,得到3株tyrB~ 菌,从3株tyrB~ 菌中提取的质粒可用限制性内切酶切出一个1.2 kb长的插入片段,证明该片段具有tyrB基因活性。     

我国天津地区莱姆病螺旋体宿主动物的初步调查

目的了解天津地区莱姆病螺旋体的宿主动物的感染情况。方法采用间接免疫荧光抗体法(IFA)对野鼠、野兔、牛、羊、狗进行了莱姆病螺旋体感染的血清学检测;用病原分离培养方法和PCR方法对野鼠进行了病原学检测。并通过基因测序方法确定基因型。结果野鼠的血清莱姆病感染阳性率最高为32.00%(32/100);并从大林姬鼠、社鼠、小林姬鼠的脾脏和/或肾脏中检查到莱姆病螺旋体的特异片断。通过序列同源性分析确定为Borreliagarinii基因型。结论首次从病原学证实天津林区鼠类为莱姆病螺旋体的重要储存宿主。     

乙型肝炎病毒核心基因克隆及其重组体的构建

【目的】构建含乙型肝炎病毒 (HBV)编码核心蛋白 (HBcAg)的核心 (C)基因的真核表达重组体 ,以进行核酸免疫及相关研究。【方法】以含HBV(ayw亚型 )全基因序列的质粒pHBV1为模板 ,用PCR的方法获得编码HBcAg的C基因片段(nt1889～ 2 45 7) ,该基因片段两端设计了BamHⅠ和EcoRⅠ的限制性内切酶位点 ,以便通过定向克隆将其插入真核表达质粒载体pcDNA3相应的多克隆位点。【结果】经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,以及重组体插入片段的DNA序列测定 ,证实成功地构建了含C基因的真核表达重组体pcDNA3 HBc。【结论】pcDNA3 HBc的构建成功为研究其表达及进行动物免疫研究提供了物质基础。     

Touchdown PCR检测野生中缅树鼩伯氏疏螺旋体感染

目的用Touchdown PCR检测野生中缅树鼩的伯氏疏螺旋体感染。方法从昆明及其周边地区捕获30只野生中缅树鼩,乙醚深度麻醉后处死,取内脏-30℃保存备用。用总DNA提取试剂盒提取组织总DNA,用紫外可见光分光光度计测定样品的DNA含量,用热启动Touchdown PCR技术检测野生中缅树鼩的伯氏疏螺旋体flaB基因。对PCR产物做凝胶电泳,凝胶成像仪观察并照相。结果Touchdown PCR有良好的特异性和敏感性。实验重复3次,结果一致,野生树鼩的伯氏疏螺旋体DNA阳性率为63．33％（19／30）。结论野生树鼩存在伯氏疏螺旋体感染,并且感染率较高。     

大肠杆菌asd基因PCR引物设计及其长模板PCR扩增

目的 获得大肠杆菌全长ａｓｄ基因，方法 采用计算机引物设计软件，长模板ＰＣＲ扩增法及限制性内切酶切分析。结果 设计一对Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因ＰＣＲ引物，经长模板ＰＣＲ扩增获得１５１０ｂｐＰＣＲ扩增片段，经限制性内切酶酶切分析，证明该片段与电脑查询的Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因酶切谱相同。结论 本文设计的引物用长模板ＰＣＲ扩增法得到的片段初步确认为Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因。     

Magainin-Aurein杂合肽基因的合成与克隆

目的:构建抗菌肽Magainin-Aurein杂合肽基因,并将M-A杂合肽基因克隆到载体pUC18上.方法:根据已报道的抗菌肽Magainin-2和Aurein1.2基因的氨基酸序列,推导出其cDNA序列,采用基因片段合成结合PCR扩增的策略,分别获得大量完整的Magainin-2和Aurein1.2基因片段.将两者连接为杂合基因并克隆到载体pUC18上.结果:构建了M-A杂合肽基因重组质粒,经PCR扩增、酶切和DNA测序分析表明,杂合肽基因的DNA序列及阅读框完全正确.结论:pUC18-M-A重组质粒构建成功,为进一步亚克隆到表达载体并进行高效表达打下基础,并为其他抗菌肽杂合肽的制备提供了参考.     

日本血吸虫亲免素基因的扩增及序列分析

[目的]研究日本血吸虫亲免素基因编码序列的结构及进行初步的功能预测.[方法]用5'端和3'端锚定PCR从尾蚴文库中扩增,以获取日本血吸虫中国大陆株亲免素基因完整的开放阅读框(open readingframe,ORF);用生物信息学技术确认其是否为亲免素编码基因并进行结构功能的初步分析和预测.[结果]用5'端和3'端锚定PCR从尾蚴文库中获得了亲免素基因5'端和3'端所缺序列,得到的亲免素基因cDNA的总序列长为1 438 bp,其ORF长1 296 bp,编码431个氨基酸.利用生物信息学技术鉴定其为日本血吸虫亲免素基因的完整cDNA序列.并用RT-PCR从日本血吸虫尾蚴mRNA扩增出亲免素基因的ORF.[结论]成功获得了日本血吸虫亲免素编码基因的全长cDNA,为进一步的功能研究打下了基础.