人白细胞介素-18在大肠杆菌中的高效表达

目的 在大肠杆菌中实现人IL－18成熟蛋白（mhIL-18）的高效表达。方法 采用RT－PCR由人肝脏Kupffer细胞中扩增mhIL-18基因，构建非融合型原核表达质粒petTT/mhIL-18，转化至大肠杆菌DH5α，用IPTG诱导热处理重组蛋白表达，超声裂解细胞提取包涵体，采用SDS－PAGE及Western blot分析重组蛋白的表达，包涵体蛋白经8mol/L尿素溶解，透析复性，ELISA检测重组蛋白诱导人外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN－γ的能力。结果 所扩增的mhIL-18基因与GenBank公布的序列一到，经IPTG诱导，mhIL-18在大肠杆菌中的表达量占菌体蛋白的40％以上，，在细胞中以包涵体形式存在，复性的重组蛋白具有诱生IFN-γ的能力。结论 mhIL-18可在大肠杆菌中高效表达。     

牛乳铁蛋白素基因及其突变基因在大肠埃希菌中的融合表达

目的构建牛乳铁蛋白素基因（LfcinB）及牛乳铁蛋白素突变基因（mLfcinB）的表达载体，建立在大肠埃希菌中融合表达的方法。方法依据大肠埃希菌偏爱密码子设计LfcinB和mLfcinB，进行克隆扩增并测序，构建LfcinB和mLfcinB的融合表达载体并转化人大肠埃希菌，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，产物经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶法纯化。结果成功构建了融合表达载体pGEX-4T-1-LfcinB和pGEX-4T-1-mLfcinB，表达载体转化大肠埃希菌BL21，经IPTG诱导3h后LfcinB和mLfcinB融合蛋白表达率约为30％，洗脱纯化后产物约为60％。聚丙烯酰氨凝胶电泳显示融合蛋白为29kDa，主要以包涵体形式存在，谷胱甘肽-琼脂糖凝胶纯化后得到3．1kDa的目的蛋白。结论LfcinB及其突变基因在大肠埃希菌中的融合表达可提高LfcinB的表达率。     

人亲环素A基因克隆及在大肠杆菌中表达

目的 :用基因重组技术表达人亲环素 A( Cy PA) ,以避免从人组织材料中提取纯化该蛋白的麻烦。　 方法 :应用反转录聚合酶链反应 ( RT- PCR)技术从人淋巴细胞系 ( MT4 )总 RNA中扩增得到 Cy PA基因片段 ,并用重组 DNA技术对该基因片段进行克隆 ,构建表达载体 ,转入大肠杆菌进行表达。　 结果 :DNA序列分析表明 ,得到的基因片段与设计编码 Cy PA的结构基因序列完全相同。所构建的表达载体 p ET11/Cy PA转入大肠杆菌获得表达 ,重组蛋白表达量占菌体可溶性蛋白的 4 1% ,经测定具有肽基脯氨酸顺 /反异构酶活性。　 结论 :利用基因重组技术使大肠杆菌高效表达出有生物活性的人 Cy PA。     

鼠疫耶尔森氏菌 YopD 抗原基因在大肠杆菌中的克隆表达

目的：利用 DNA 重组技术,在大肠杆菌中获得融合表达的鼠疫耶尔森氏菌 YopD 抗原基因。方法根据查找文献及基因比对选取了鼠疫菌重要功能蛋白-YopD 蛋白。利用分子克隆技术克隆后,在原核系统中进行表达。根据云南玉龙菌株（D106004）全基因组序列设计引物,PCR 扩增目的基因片段。采用 pET-32a（＋）作为表达载体,通过双酶切和连接反应,将目的基因片段定向插入载体中,构建重组表达质粒。IPTG 诱导,使重组质粒在其宿主菌 E ．coli BL21（DE3）中表达。结果在大肠杆菌中成功获得了融合表达蛋白,即重组 YopD 蛋白。结论以质粒 pET-32a（＋）作为表达载体,鼠疫菌重要功能蛋白 YopD 能够在大肠杆菌 E ．coli BL21（DE3）中稳定高效地表达,为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗选择的可能性奠定了基础。     

大鼠RGS4基因的克隆及在原核中的表达

目的构建pGEX4T-1-RGS4载体,并检测融合蛋白GST-RSG4在原核中的表达水平。方法采用RT-PCR方法,将克隆SD大鼠G蛋白信号转导调节因子(regulator of G protein signaling4,RGS4)基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pGEX4T-1中,IPTG诱导原核表达,通过Western blot检测融合蛋白GST-RSG4的表达水平。结果成功构建了pGEX4T-1-RGS4载体;经IPTG的诱导,RGS4可与GST以融合蛋白的形式高效表达。pGEX4T-1-RGS4在原核内表达产物相对分子质量约为50×103,与预期融合蛋白大小一致。结论构建的重组质粒能够在大肠杆菌中高效表达。     

艾滋病痴呆综合症患者体内HIV-1 tat基因的克隆及原核表达

目的     探讨艾滋病痴呆综合症（AIDS dementia complex,ADC）患者体内外周和中枢不同组织部位的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）反式激活因子（tat）第一外显子基因序列的变异并对其进行表达,用于研究HIV-1 Tat变异对其神经毒性的影响。方法     从ADC病例尸检标本的脾脏（spleen,SPL）、脑膜（meninges, MG）和基底核（basal ganglia,BG）3个部位的组织中提取基因组DNA,用PCR方法扩增出tat第一外显子基因,并将其插入到pGEM-T克隆载体中,测序证实为HIV-1 tat基因,BioEdit软件对测序结果进行比对。将克隆载体双酶切,回收目的基因,并将其连接到pGEX-KG表达载体中,将重组表达质粒pGEX-KG-tat转化BL21大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,表达产物用SDS PAGE和Western blot进行检验和鉴定。结果    成功克隆了HIV-1 tat第一外显子基因,序列比对发现外周和中枢部位的Tat氨基酸序列不同;构建了pGEX KG-tat重组表达载体,并在原核细胞中高效表达了谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合Tat蛋白,SDS PAGE和Western blot分析表明,所表达的蛋白为Tat蛋白。结论     ADC患者外周和中枢不同组织部位的HIV-1 tat第一外显子基因所编码的Tat蛋白氨基酸序列存在变异,在原核细胞中对其进行了高效表达,为Tat蛋白的神经毒性研究奠定了基础。     

流行性乙型脑炎病毒NS4A蛋白基因的克隆及其在大肠埃希菌的表达

目的:克隆及表达流行性乙型脑炎病毒(JEV)NS4A蛋白基因.方法:JEV JaGAr-01株感染C6/36细胞,RT-PCR法获取JEV NS4A蛋白基因并采用ABI PRSMTM310 Genetic Analyzer进行DNA测序分析,PCR克隆方法将RT-PCR产物构建于原核表达载体PET-3a的BamHI与EcoRI酶切位点并命名为pNS4A,电泳进行限制性内切酶分析.结果:JEV NS4A蛋白基因大小为446 bp,DNA测序与发表的JEV JaGAr-01株相对应的DNA序列相符合,酶切后从重组质粒释出的插入子与JEV NS4A蛋白基因大小相一致.pNS4A在原核细胞内表达的特异蛋白分子量约16 kDa,与JEV NS4A蛋白理论计算相一致.结论:获取的JEV NS4A蛋白基因来自于JaGAr-01野生株,pNS4A在大肠埃希菌中表达的蛋白产物为JEV NS4A蛋白.     

大肠埃希菌qnrA基因的检测

[目的]了解大连地区耐环丙沙星的大肠埃希菌中qnrA基因的流行情况并研究其耐药机制。[方法]收集临床分离的耐环丙沙星的大肠埃希菌213株,通过PCR法扩增qnrA基因,对qnrA基因阳性株,KB纸片法检测抗菌药的体外抗菌活性,琼脂稀释法测MIC,并进行质粒结合试验。[结果]213株菌中查到2株qnrA阳性菌株,测序结果与Genbank中qnrA基因比对吻合率达100%。其中一株对多种抗菌药耐药,另一株则比较敏感。[结论]大连地区检测到了qnrA基因阳性的菌株,耐药机制复杂,应引起临床重视。     

大肠杆菌LTB与霍乱弧菌CTB基因的克隆和表达及鉴定

目的：克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）及霍乱弧菌肠毒素B亚单位（CTB）基因，构建其表达载体。方法：采用高保真PCR分别从E.coli44815株与V.cholerae东74株基因组DNA中扩增LTB与CTB基因，T-A克隆后测定核苷酸序列。分别构建pET32a的LTB及CTB表达载体，在E.coliBL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE及GM1-ELISA鉴定表达产物。结果：所克隆的LTB和CTB基因与报道的相应核苷酸序列同源性分别为99.12％-99.71％和98.54％-99.42％，氨基酸序列同源性分别高达97.58％-99.19％和96.77％-99.19％。pET32a-LTB-BL21DE3和pET32a-CTB-BL21DE3系统表达的融合蛋白产量分别占细菌总蛋白的30％和10％左右。GM1-ELISA结果证实LTB及CTB融合蛋白均能与牛GM1结合。结论：本研究成功地构建了LTB与CTB表达系统，所表达的LTB与CTB融合蛋白具有粘膜免疫佐剂活性。     

NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中克隆和表达NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因。方法：通过PCR方法克隆来源于Alcali-genes eutrophus菌的NADPH依赖性的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB，将其克隆在大肠杆菌表达质粒pET28a中，进行PCR和DNA序列测定验证，并通过IPTG诱导表达。结果：通过PCR和DNA核酸序列分析，证实获得的基因片段为phbB全编码序列，phbB被克隆在大肠杆菌表达质粒pET28a中，重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导获得表达。结论：获得了Al-caligenes eutrophus菌的NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因，将其克隆在pET28a中，经诱导获得PhbB的表达，为进一步研究PhbB的理化性质和酶动力学性质奠定了坚实的基础。     

幽门螺杆菌flaA基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：观察幽门螺杆菌(H．pylori)flaA基因在大肠杆菌中的表达。方法：用PCR方法扩增flaA基因,然后插入原核表达载体pMAL-c2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果：特异PCR和酶切鉴定证实flaA基因克隆入表达载体,并以融合蛋门形式MBP-FLA高效表达,约占细胞总蛋白的28％。该融合蛋白可与H.pylori阳性病人血清和小鼠H.pylori全菌抗体发生特异反应。结论：成功构建了能高效表达H．pylori FlaA蛋白的重组质粒,为H．pylori多价基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

非融合型重组人白细胞介素-18的纯化及鉴定

目的　获得高纯度的重组人白细胞介素 18(rhIL 18)。方法　采用溶菌酶加超声破菌的方法抽提包涵体 ,以8mol/L尿素溶解包涵体 ,变性条件下以阴离子柱层析进行首步纯化 ,复性后再进行凝胶过滤层析。对纯化的样品进行了SDS PAGE、HPLC、N端氨基酸序列、免疫印迹及生物学活性分析。结果　rhIL 18在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在 ,所提取的包涵体中重组蛋白纯度可达到 80 %以上 ,包涵体经二步柱层析纯化后 ,HPLC分析纯度达 98%以上 ,SDS PAGE测定其分子质量约 19× 10 3 ,N端 15个氨基酸序列与预期一致 ,生物学活性分析证实纯化的rhIL 18具有诱导人外周血单个核细胞 (PBMC)产生IFN γ的能力。结论　所建立的纯化rhIL 18的方法简便有效 ,为开展rhIL 18的结构活性关系研究及其大规模纯化打下了良好的基础。     

幽门螺杆菌尿素膜通道基因的克隆和表达

目的 克隆幽门螺杆菌(Hp)尿素膜通道基因(ureI)和构建能表达UreI蛋白的原核表达工程菌,并初步研究产物的表达特性和免疫特性.方法 用PCR方法从Hp基因组中克隆ureI基因,构建原核表达重组质粒pET32a/ureI,双酶切和测序鉴定正确后,重组质粒转染大肠杆菌BL21 (DE3),构建高效表达UreI的工程菌BL21 /UreI.不同温度条件下用1.0 mmol/LIPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Gel-Pro Analyzer 4分析重组蛋白的表达,并用Western blotting对其免疫原性进行分析.结果 克隆到约650 bp的基因片段,测序结果与GENBANK中对应菌株的ureI序列100%同源,与其他Hp的序列同源性不低于98.5%.工程菌BL21 /UreI含完整的ureI基因.在37℃、1.0 mmo1/LIPTG诱导14 h后,重组蛋白表达量可达菌体总蛋白的20.2%.分析表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,经免疫印迹证实该重组蛋白有一定的免疫反应性和特异性.结论 成功构建了Hp ureI基因的原核表达载体,该载体可高表达有免疫特性的重组蛋白,为进一步研究Hp在胃的定植机制和抗Hp新药奠定了基础.     

大肠埃希菌耐药基因近年国内研究进展

本文就大肠埃希菌耐药基因近年国内研究进展进行扼要的阐述,包括β-内酰胺类药物耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、喹诺酮类药物耐药基因、广谱抗菌药物耐药基因、消毒剂耐药基因耐药基因载体等。     

HIV-1 Tat基因在pEGx-KG中的融合构建及原核表达

目的:在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达融合的Tat蛋白。方法:用PCR方法从HIV cDNA文库中扩增出Tat基因,并将其插入到表达载体pEGx-KG中,转化到E.coli中进行融合表达,表达产物用蛋白电泳和Western-blot进行鉴定。结果:成功地构建了重组质粒pEGx-KG-Tat,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达。蛋白电泳和Western-blot分析表明,在相对分子质量(Mr)为38.9kDa处有1条特异性的带。结论:GST基因与HIV-1 Tat基因的融合构建,使Tat蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为艾滋病的防治研究奠定了基础。     

尿酸氧化酶与肌酐水解酶融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 构建含尿酸氧化酶与肌酐水解酶融合基因的质粒并转化大肠杆菌,使其能同时分泌该两种酶分解尿酸及肌酐.方法 根据GenBank数据库已知的尿酸氧化酶基因设计引物,扩增到去掉终止密码子的尿酸氧化酶基因中,并使其连接到质粒pGM36e上构建成pGM36e-U,然后根据已知肌酐水解酶基因设计引物扩增肌酐水解酶基因,把其连接到质粒pGM36e-U中尿酸氧化酶基因后构建成重组质粒pGM36e-U/C,转化大肠杆菌,筛选鉴定重组大肠杆菌,并进行SDS-PAGE分析.将工程菌于特定浓度肌酐和尿酸的培养基中培养24h,取培养液测定肌酐和尿酸浓度.结果 重组质粒得到大小约1.68 kb基因片段.为尿酸氧化酶及肌酐水解酶之合.转化大肠杆菌后尿酸氧化酶及肌酐水解酶活性得到表达.肌酐分解率提高43.50％,尿酸分解率提高42.32％.结论 构建的含复合基因的重组质粒转化大肠杆菌后能表达尿酸氧化酶及肌酐水解酶活性.分解尿酸和肌酐.     

密码子优化的HPV16 L2E7基因在大肠杆菌中高效表达

目的提高HPV16L2E7融合基因在大肠杆菌中的表达水平,为中试研究提供高表达量的疫苗候选株。方法根据大肠杆菌偏爱密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对L2E7全基因进行密码子优化,将分段合成的基因分部插入到pET9a中,经酶切和测序鉴定无误后转化BL21(DE3 )中,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。表达的融合蛋白进行SDS-PAGE胶和Western blot鉴定。同时还进行梯度实验分别对诱导的温度、时间和IPTG诱导时菌体浓度进行优化,并对蛋白的纯化方案进行摸索。结果优化后的pET9aSL2E7AB在大肠杆菌中得到高效表达,诱导条件优化后的目的蛋白占全菌60%左右。结论成功得到了具有较高表达水平的疫苗候选株。     

人内皮抑素基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人内皮抑素基因并在大肠杆菌中表达。方法 采用PCR技术进行内皮抑素基因的克隆，并使基因定向插入表达载体PGEME－1中经IPTG诱导获取表达。结果 经DNA序列分析，人内皮抑素基因序列完全正确，经SDS－PAGE分析，出现一条特异性蛋白质条带，大小与基因10和人内皮抑素蛋白的大小的总和相符合。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得融合表达。     

人全长TALL-1在大肠杆菌中的表达

目的在克隆人TALL-1(TNF- and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand 1)全长 cDNA的基础上,用大肠杆菌进行表达并鉴定其生物学活性.方法采用RT-PCR技术,从HL-60细胞中扩增编码人TALL-1的cDNA,克隆于高效原核表达载体pQE-80L中,以IPTG诱导表达,Ni-NTA层析纯化后,进行生物学活性检测.结果 RT-PCR扩增得到了858 bp的DNA片段,测序结果与GenBank中报道的编码TALL-1的cDNA序列一致,并在大肠杆菌中获得了高效表达,活性检测发现它能抑制U937细胞的生长.结论成功克隆了人TALL-1全长cDNA,并获得了高效表达及纯化,纯化产物具有生物学活性,这为进一步的功能研究及临床应用奠定了基础.