HBeAg时间分辨荧光免疫分析

以往的ＨＢｅＡｇ分析以免疫化学技术为主 ,存在方法稳定性欠佳和环境污染等缺陷。近年发展的时间分辨荧光测量技术具有测量灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、定量分析量程宽、无放射性污染和应用范围广等优点[1] 。笔者对此进行了研究 ,现报道如下。一、材料与方法1.材料与试剂。抗ＨＢｅＡｇ单克隆抗体Ｇ8和Ｃ4 由中国预防医学科学院提供。Ｅｕ3 标记盒 (12 44 30 2 )、Ｅｕ3 发光增强液 (Ｂ118 10 0 ) ,Ｗａｌｌａｃ产品。二乙烯三胺五乙酸酐 (ＤＴＰＡＡ)Ｓｉｇｍａ产品。ＰＤ 10和ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ 6Ｂ ,Ｐｈａｒｍａｃｉａ…     

HBV前S1抗原时间分辨荧光免疫分析方法的建立

HBV前S1（PreS1）抗原已成为HBV感染、复制和乙型肝炎患者诊断、治疗、预后的一个重要指标。目前PreS1的检测方法，只有ELISA，但其灵敏度低，线性范围窄，酶标记物不稳定。时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术具有零本底、灵敏度高、重复性好、特异性强、线性范围宽等特点。笔者应用抗PreS1单克隆抗体和乙型肝炎表面抗体（抗-HBs）分别作为固相抗体和Eu^3＋标记抗体，建立了PreS1抗原TRFIA方法，现报道如下。     

核酸杂交的二次酶放大镧系元素发光时间分辨荧光分析

目的建立一种超灵敏的用于核酸杂交分析的方法。方法通过二次酶放大、PCR扩增、Tb螯合物和时间分辨测量技术,测定前列腺特异抗原（PSA）DNA。结果靶PSADNA测定的标准曲线线性范围大于两个数量级;灵敏度为10pmol/L（0.5fmol/孔）;当靶PSADNA为10、30和60pmol/L时,准确度和精密度分别为77%～95%和12.9%～15.3%。结论本法是一种超灵敏的、简捷和快速的全新分析方法,有很好的应用前景。     

时间分辨荧光免疫分析定量检测乙型肝炎病毒五项指标的临床评价

目的对时间分辫荧光免疫分析技术（TRFIA）定量检测乙型肝炎病毒标志物五项血清学指标（HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb,HBcAb）进行临床评价。方法采用TRFIA法和酶免法（ELLSA）对830份临床标本同时测定,进行结果比较分析。结果TRFIA与ELLsA检测HBV五项血清学指标的结果符合率较高,经配对资料,检验,两测定方法所得结果无显著性差异（P〉0．05）。结论TRFIA作为一种高灵敏度的定量方法,对乙肝的临床诊断、疗效观察、接种乙肝疫苗提供可靠的实验依据,是一种理想的定量检测方法。     

时间分辨荧光分析技术的研究进展及应用

时间分辨荧光分析(TRFA)技术是一种以镧系元素螫合物为标记物,测量其发射荧光的超灵敏的无放射性污染的标记分析技术,在生物分析中得到了广泛的应用。在近些年,研究发展了酶放大时间分辨荧光分析、时间分辨猝灭分析和分子信标等分析系统,其灵敏度更高,满足了不同的需求,使TRFA技术在临床诊断和科学研究中得到了更广泛的应用。     

CA242高灵敏时间分辨荧光免疫分析及其初步应用

目的采用时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）建立高灵敏的恶性肿瘤相关糖类抗原（CA）242的快速全自动检测方法并进行初步应用。方法以抗CA242单克隆抗体601#包被96孔微孔板,以Eu^3＋-N^2-[p-异氰酸苄基]-二乙烯三胺四乙酸标记抗CA242单克隆抗体242#,发光增强系统为以β-二酮体为主的增强液。采用平衡饱和法建立CA242 TRFIA,采用Auto DELFIA1235系统考核CA242 TRFIA,并进行健康人和胃癌患者血清样本的检测。结果该方法的批内和批间CV分别为2．92％和5．36％,平均回收率为98．75％,灵敏度为0．2kU／L,可测范围为0．2～200kU／L,最高浓度点计数的20％、50％、80％对应的效应点值（ED20、ED50、ED80）分别为25．2kU／L、53．3kU／L和112．5kU／L。CA50、CA19-9对CA242分别有15％和32％的交叉反应,癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、CA125对CA242 TRFIA均无交叉反应。Eu^3＋标记242#抗体于-20℃下保存6个月免疫反应性基本无损,同批试剂连续6个月应用分析结果稳定,检测健康体格检查人员的血清,样品的平均值为（6．52±5．15）kU／L,建议阳性阈值为17kU／L,临床结果与酶联免疫吸附测定（ELISA）的结果相符,r为0．916。116例胃癌患者血清CA242的阳性率为26．7％。结论CA242 TRFIA的灵敏度高、稳定性好,可用于血清CA242含量的免疫测定。     

时间分辨荧光免疫分析中β-NTA及其增强液的制备

目的 以自制的时间分辨荧光免疫分析中所需增强液取代昂贵的进口试剂。方法 合成增强液中主要化合物β-萘甲酰三氟丙酮,并用其配制增强液。结果 自制增强液的性能达到进口试剂水平。结论 合成路线目标产物纯度达到要求,可用于配制国产增强液。     

时间分辨荧光免疫分析及其应用前景

介绍了时间分辨荧光免疫分析的基本原理、国内外研究现状和应用前景。着重叙述了本法的固有特点及有关理论,以加深对它的理解。     

铽在生物活性分析中的应用

介绍了铽（Ｔｂ３＋）的理化性质、发光机理及其配体。综述了近年来Ｔｂ３＋在酶放大镧系发光法（ＥＡＬＬ）、多标记的时间分辨荧光免疫分析（ＴＲＦＩＡ）、直接固相ＴＲＦＩＡ、核酸分子杂交分析、生物大分子结构检测等方面的应用。     

标记免疫分析技术及其进展

主要介绍了放射免疫分析、酶免疫分析、发光免疫分析及荧光免疫分析的现状及近来发展的新技术，并对标记免疫分析技术的发展趋势及发展前景作了评价。     

CA50时间分辨荧光免疫分析法的建立及临床应用

目的建立糖类抗原（CA）50时间分辨荧光免疫分析法（CA50-TRFIA）并用于临床。方法以抗CA50单克隆抗体包被微孔板，双功能螯合剂异氰酸苄基二乙烯三胺四乙酸（DTFA）络合Eu^3＋及标记CA50单克隆抗体，采用夹心法建立CA50-TRFIA，发光增强系统为以8-二酮体为主的增强液。比较20例消化道恶性肿瘤患者、47例消化道良性病变患者和213名健康对照者的血清CA50值。数据采用Logit—Log函数和四参数Logistic函数程序处理。结果方法的批内和批间CV分别为2．6％和3．5％，平均回收率为108．61％，灵敏度为1．08×10^3U／L，可测范围为（1．08～140）×10^3U／L。其测定结果与进口的IRMA药盒测定值比较，两者高度相关（r=0．904）。对照组213例CA50测定结果为（2．10±4．96）×10^3U／L；20例消化道恶性肿瘤CA50测定结果为（26．58±52．82）×10^3U／L，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）；47例消化道良性病变患者CA50测定结果为（7．25±28．67）×10^3U／L，与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论该法简便、快速、实用，精密度、重复性、线性相关性较好。     

新型肝癌标志物Glypican-3时间分辨荧光免疫法的建立

目的建立磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）TRFIA,探讨血清GPC3检测在肝癌诊断中的价值。方法以抗GPC3单克隆抗体7C8包板,铕（Eu^3＋）标记GP9单克隆抗体进行检测,建立了双抗夹心TRHA,并对41例原发性肝细胞肝癌及44例慢性乙型肝炎患者血清GPC3进行定量分析。采用放射免疫法检测AFP。采用SPSS12．0软件进行非参数秩和检验。结果GPC3双抗夹心TRFIA线性可测范围为3．125～600ug／L,检测灵敏度为2．06ug／L,批内和批间CV分别为12．25％和12．91％。41例肝癌患者血清中GPC3平均质量浓度为（86．68±110．39）ug／L（中位数56．98ug/L）;而44例肝炎患者血清GPC3浓度为（14．77±29．48）ug／L（中位数2．20ug／L）,低于肝细胞肝癌组（Wilcoxon W：1335．00,Z=-4．99,P〈0．001）。根据ROC曲线分析结果,以42．94ug／L为诊断界值时,GPC3诊断肝癌的灵敏度和特异性分别为58．5％（24／41）和95．5％（42／44）。联合GPC3检测,能将AFP诊断肝癌的灵敏度从46．3％（19／41）提高至78．0％（32／41）。结论建立了检测GPC3的TRFIA新方法;该法与AFP联合检测,可提高诊断HCC的阳性率。     

乙型肝炎病毒大蛋白时间分辨荧光免疫分析法的建立及应用

目的 建立定量检测患者血清HBV-大蛋白（LP）的TRFIA.方法 以抗人HBV-LP单克隆抗体和抗HBs多克隆抗体分别作为固相抗体和铕标记抗体,应用TRFIA和ELISA对标准品、66份慢性乙型肝炎患者血清、30份健康体格检查者血清中HBV-LP进行检测.分析TRFIA和ELISA的有效检测范围等,统计学比较采用χ^2检验和直线相关分析.结果 标准品TRFIA检测结果示该法剂量-反应曲线呈良好线性相关（r=0.999）.ELISA法测得的正常（30份健康者血清）95％参考范围为0～1.36 mg/L.TRFIA灵敏度（最小测定值）为0.10 mg/L,30份健康血清HBV-LP的检测结果均正常,特异性100％.66份患者血清TRFIA与ELISA检测结果的r为0.800 9（P＜0.001）,两者检测的阳性率差异有统计学意义[89.4％ （59/66）与77.3％（51/66）,χ^2=6.13,P＜0.01].TRFIA有效可测范围（CV＜ 10％）为1.35～2 764.00 mg/L,ELISA为10.80～691.00 mg/L.TRFIA回收率范围为95.93％ ～ 107.62％.结论 TRFIA法检测患者血清中的HBV-LP灵敏度和特异性高,检测范围宽,对早期筛选HBV患者及监测抗病毒治疗的疗效具有潜在的价值.     

可溶性细胞间黏附分子-1时间分辨荧光免疫分析法的建立

目的 建立一种新的高灵敏度、宽范围的可溶性细胞间黏附分子-1(Sicam-1)生物素-链亲和素(BSA)系统时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)方法并用于临床.方法 使用2株匹配的单克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体,利用制备的铕标记链亲和素(SA-Eu3+)作为示踪物并与生物素化的检测抗体特异结合,建立双位点多层夹心法BSA-TRFIA并进行质量控制,考核其灵敏度、特异性、测量范围及方法稳定性等.检测32例血清样品中Sicam-1含量,并与ELISA所测结果进行相关分析.测定31名健康对照者和22例肺部疾病患者血样中的Sicam-1含量.结果 该法测定slCAM-1的灵敏度为1.32μL,批内和批间CV分别为4.24%和6.83%,平均回收率为99.87%,线性范围为(2.5～1933)μg/L.该方法测定值与ELISA所测结果高度相关(R2=0.939).与肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-8、IL-1、IL-2和IL-6等无交叉反应.溶血、脂血和高胆红素等血清标本对该方法基本无干扰.31名健康对照者测定结果为(365.74±45.03)μg/L.22例肺部疾病患者血样结果示,在炎症和肺损伤的情况下,可见Sicam-1有升高的趋势.结论 该Sicam-1 BSA-TRFIA法灵敏度高,可测范围广,可以方便地应用于临床.     

双标记时间分辨荧光免疫分析检测AFP和AFP-IgM在HCC中的应用

目的建立可同时测定血清甲胎蛋白（AFP）和AFP免疫复合物（AFP-IgM）的快速、灵敏检测方法,探讨其在原发性肝细胞癌（HCC）诊断中的临床价值。方法利用时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）技术,分别用Sm^3＋标记鼠抗人IgM单克隆抗体（M94181）,Eu^3＋标记鼠抗人AFP单克隆抗体（M19301）,建立双标记TRFIA（dual-TRFIA）。选择HCC患者118例和肝良性病变（BLD）患者123例（肝硬化60例,慢性肝炎63例）,健康体格检查者286例。分别用该法检测血清AFP和AFP-IgM水平,并用受试者工作特征（ROC）曲线进行临床诊断特性分析。采用SASS 6．12软件进行统计学处理。结果dual-TRFIA法检测AFP和AFP-IgM的灵敏度分别为0．41μg／L,10．00U／L,与试剂盒[电化学发光免疫（ECLIA）AFP test和Hepa AFP-IC kit]相关性好（r=0．9987和0．9854,P均〈0．05）。AFP和AFP-IgM在HCC中的诊断灵敏度分别为46．61％（55／118）,63．56％（75／118）,诊断准确性分别为77．10％和77．40％。AFP和AFP-IgM联合检测可将灵敏度提高至72．88％（86／118,χ^2=9．45,P=0．02）,诊断准确性提高至84．10％（χ^2=6．24,P=0．04）。结论AFP-IgM是HCC新型血清标志物,同时检测AFP和AFP-IgM能明显提高对HCC的诊断灵敏度和准确性,有利于肝癌的早期诊断。dual-TR-IMFA法同时检测AFP和AFP-IgM稳定可靠,可以满足临床使用需要。     

孕母血清游离β绒毛膜促性腺激素时间分辨荧光免疫试剂盒的研制与评价

目的研制一种用于产前筛查孕母血清游离β绒毛膜促性腺激素（freehCGβ）的时间分辨荧光免疫（TRFIA）试剂盒。方法采用2株freehCG13单克隆抗体（McAb）,一株用于固相包被（3μg／ml）,另一株用于标记铕（Eu3＋）制备Eu3＋-freehCG13MeAb,以β-萘甲酰三氟丙酮为主要成分的增强液,应用双抗体夹心法建立freehCGBTRFIA法,并对其进行性能评价。采用线性回归分析及配对t检验进行统计学分析。结果该试剂盒的剂量一反应曲线线性相关系数（r）达0．9990;分析内、分析间变异系数（CV）均小于10．00％;标准品各点实测值与标示值的偏差（DIFF）均小于5．00％;灵敏度不高于0．20ng／ml;以国家标准品为对照,标准品效价比在0．9130～1．100间;与人促甲状腺激素（hTSH）、人黄体生成素（hLH）、人卵泡刺激素（hFSH）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）交叉反应低;线性范围为2．00—200ng／ml;与同类国外试剂比对,线性回归方程为y=x＋0．0565,r=0．9771,检测结果间差异无统计学意义（t=0．1839,P〉0．05）;国内外同类仪器比对检测,线性回归方程为y=0．9894x＋0．0957,r=0．9995,检测结果间差异无统计学意义（t=-0．9669,P〉0．05）;室间质量评价实测值与靶值偏倚（-11．93％～7．01％）符合标准;干扰实验表明乙二胺四乙酸钾（EDTA．K2）≥0．54mmol／L、柠檬酸钠≥1．06mmol／L、草酸钾（K2C204H20）≥2．12mmol／L、氟化钠（NaF）≥29．76mmo]／L时,自制试剂盒检测结果明显偏低（干扰程度均〉10％）,肝素≤150U／L、血红蛋白≤12g／L、三酰甘油≤21．54mmol／L和胆红素≤818txmol／L对该试剂盒检测结果无明显干扰（干扰程度均〈10％）;温度升高会使样本检测结果偏高。结论该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确度好、线性范围宽等优点,与国外的同类产品性能相仿,能满足临床需要。     

标记免疫分析技术及其进展

主要介绍了放射免疫分析、酶免疫分析、发光免疫分析及荧光免疫分析的现状及近来发展的新技术,并对标记免疫分析技术的发展趋势及发展前景作了评价。     

一种新的GFP/DNA双标记流式细胞技术

目的：为了检测细胞转染了带绿色荧光蛋白(GFP)标记的融合基因后细胞周期的改变，以研究目的基因与细胞周期的关系，建立GFP／DNA双标记流式细胞技术。方法：①以小鼠脾细胞为模型，以不同浓度的多聚甲醛(PFA)预固定细胞不同时间，再换用70％乙醇固定细胞24h以上，观察不同固定方法对细胞周期检测的影响；②以Ad-EGFP感染的Hep-2细胞为模型，观察不同固定方法对细胞周期、GFP阳性细胞检出率和GFP的荧光强度的影响；③用最佳固定方法观察转染p21／WAF1／CIP1-EGFP融合基因的293细胞的细胞周期，以验证方法的可靠性。结果：0．5％PFA预固定60min，再换用70％乙醇固定细胞，不影响细胞周期检测，而且GFP荧光强度和转染效率的检测最佳。以此方法固定细胞，GFP／DNA双标记流式细胞技术检测了转染p21／WAF1／CIP1-EGFP融合基因的293细胞的细胞周期，可观察到p21表达阳性的细胞发生了G0／G1期阻滞。结论：优化的细胞固定方法可以有效地阻止GFP从细胞内流出，建立的GFP／NDA双标记流式细胞技术可以用于研究带GFP标签的基因表达蛋白与细胞周期的关系。