神经生长因子促进骨髓间充质干细胞血管新生能力

目的 探讨神经生长因子(NGF)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)血管新生能力的影响,及其可能的作用机制.方法 24孔板中matrigel铺板后种植MSCs,用不同浓度的NGF(0、25、50、100、200 ng/mL)处理细胞24 h,观察MSCs体外形成管腔样结构的能力,同时用特异性NGF酪氨酸受体(TrkA)阻滞剂K-252a阻断受体.观察K-252a对NGF促MSCs血管新生的抑制作用.应用Western印迹法比较NGF处理组MSCs与对照组MSCs的血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况.结果 不同浓度的NGF均有促血管新生的作用,其中NGF 50 ng/mL促进MSCs血管新生的能力最强,该组MSCs形成的管腔长度为对照组的2.24倍(P=0.01).NGF处理组MSCs的VEGF表达情况与对照组的差异无统计学意义(P>0.05).K-252a阻断TrkA受体后,NGF促进MSCs管腔样结构形成的能力明显减弱.结论 NGF可以促进MSCs在体外matrigel中的血管新生能力,其作用机制可能与激活TrkA受体有关.     

转化生长因子β1/Smad3促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的：探讨转化生长因子β1（TGF-β1）/Smad3信号促进大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）成骨分化的机制.方法：常规细胞培养、免疫细胞化学染色观察TGF-β1作用下MSC中Smad3的表达情况;脂质体介导稳定转染Smad3中部分C端功能域突变体（Smad3△C）,间接免疫荧光试验鉴定;采用RT-PCR检测转染细胞中碱性磷酸酶（ALP）和核心结合因子（cbfa1）mRNA的表达,用Gomori钙钴法定性检测ALP,用对硝基苯磷酸盐（PNP）法检测细胞ALP活性,观察Smad3△C对MSC成骨分化的影响.结果：MSC细胞表达Smad3,受TGF-β1刺激后,呈现出即刻由细胞质向细胞核转位的趋势.稳定转染细胞中c-Myc抗原阳性表达;受TGF-β1刺激后,MSC和空载体对照MSC（V-MSC）中ALP染色呈强阳性反应,而Smad3△C-MSC中阳性率仅为34.9%（P＜0.01）;MSC和V-MSC中ALP、cbfa1 mRNA的表达水平以及ALP活性明显高于Smad3△C-MSC（P＜0.05或P＜0.01）,而MSC和V-MSC之间无显著性差异（P＞0.05）.结论：MSC中的Smad3是作为TGF-β1信号转导通路下游转导介质而存在的;通过Smad3选择性调节,具有多重生物学效应的TGF-β1才得以实现其促进MSC成骨分化的功能.     

大鼠骨髓间充质干细胞植入大鼠脑内后的迁移

目的：研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）植入脑内后的存活和迁移性。方法：分离大鼠MSCs体外培养、纯化。Hoechst33342标记后立体定向植入大鼠海马CA4区,1、2、4周后处死大鼠取脑,制作冷冻切片;用荧光显微镜观察Hoechst33342阳性细胞。结果：原代、传代细胞贴壁生长,有较强的增殖能力;植入大鼠海马后沿针道及注射区可见多数存活细胞,散在分布,自植入区及针道向周围逐渐减少。结论：大鼠MSCs植入大鼠脑内后能够存活并具有向周围组织迁移的能力。     

DMOG促进骨髓间充质干细胞血管新生作用的研究

目的探讨在缺氧缺血清环境下,脯氨酸羟化酶抑制剂———二甲基乙二酰甘氨酸（DMOG）促进骨髓间充质干细胞（MSCs）血管新生的作用及其机制。方法MSCs从大鼠骨髓中分离得到,分为：常氧条件下溶剂对照组（N-DMSO）、缺氧条件下溶剂对照组（H-DMSO）、20μMDMOG加药组（D-20滋M）、100滋MDMOG加药组（D-100滋M）及500μMDMOG加药组（D-500滋M）,观察以下指标：（1）通过缺氧条件下CCK-8检测DMOG在20μM、100μM及500滋M剂量下对MSCs的保护作用,确定DMOG的最佳剂量;（2）通过Matrigel实验观察DMOG促进MSCs血管新生的作用;（3）通过Westernblot法检测血管新生通路相关蛋白表达。结果（1）不同浓度组DMOG对缺氧损伤MSCs的影响：N-DMSO组OD值3.25±0.05,H-DMSO组2.23±0.14,D-20滋M组2.68±0.43,D-100滋M组3.11±0.25,D-500滋M组3.23±0.04。与N-DMSO组比较,H-DMSO组OD值降低（P＜0.01）,与H-DMSO组比较,D-20滋M组、D-100滋M组、D-500滋MOD值均升高（P＜0.05或0.01）。（2）不同浓度组DMOG对正常MSCs的影响：D-20滋M组3.19±0.02,D-100滋M组3.15±0.06,D-500滋M组2.51±0.08。与N-DMSO组比较,D-500滋M组OD值降低（P＜0.01）,D-20滋M组、D-100滋M组与N-DMSO组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）,提示DMOG在20滋M及100滋M对细胞无毒性。（3）血管新生相关蛋白的表达：与H-DMSO组相比,D-100μM组缺氧3、6及24hHIF-1α均增加（1.44±0.32vs7.79±0.23,2.4±0.28vs3.51±0.79,0.93±0.37vs2.46±0.07,P＜0.05或0.01）,pAKT则在缺氧6h增加（0.47±0.15vs0.71±0.03,P＜0.05）,VEGF在缺氧6、24h均增加（0.63±0.10vs0.87±0.14,0.42±0.06vs0.70±0.06,P＜0.05或0.01）,以缺氧24h最为显著。pmTOR/mTOR及pERK/ERK蛋白两组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论DMOG通过抑制HIF-1α降解及促进AKT磷酸化提高缺氧环境下MSCs的血管新生能力。     

肝细胞生长因子修饰兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究重组腺病毒肝细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞的转染率及转染后细胞的分化特点。方法获取骨髓间充质干细胞并传代培养、鉴定,以MOI=150的重组腺病毒肝细胞生长因子（Ad—HGF）对其进行修饰,以Ad—GFP检测病毒72h转染率,观察转染后细胞的成骨及成脂分化特点。结果Ad—HGF对MSCs感染效率为99．78％,成骨及成脂诱导14d后可见典型分化。结论以Ad—HGF对MSCs进行感染效果良好,可成为缺血性骨坏死较为有效的治疗手段。     

野生型Smad3基因促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的　探讨野生型Smad3基因对大鼠骨髓间充质干细胞 (MSC)增殖和成骨分化的影响以及作用机理。方法　脂质体介导稳定转染Smad3和Smad3△C ,间接免疫荧光试验鉴定 ;采用噻唑蓝 (MTT)检测Smad3转染对MSC增殖的影响 ;采用逆转录聚合酶链反应检测转染细胞中ALP和核心结合因子 (cbfa1)mRNA的表达 ,用对硝基苯磷酸盐 (PNP)法检测细胞ALP活性 ,用茜素红染色法检测细胞矿化能力 ,观察Smad3对MSC成骨分化的影响 ;用PD980 5 9选择性阻断非细胞外信号调节激酶(ERK)通路 ,观察ERK通路在Smad3调节MSC成骨分化中的作用。结果　稳定转染Smad3和Smad3△C的细胞中c Myc抗原阳性表达 ;Smad3 MSC增殖缓慢 ,细胞群体倍增时间延长 ,没有明显的对数生长期 ;Smad3 MSC中ALP和cbfa1mRNA的表达水平、ALP活性以及矿化能力明显高于Smad3△C MSC与V MSC ;加入PD980 5 9后 ,Smad3 MSC中ALP活性以及矿化能力有所减低 ,但与未加入PD980 5 9组相比 ,差异无显著意义 (P >0 0 5 )。结论　野生型Smad3基因抑制MSC的增殖 ,并通过非ERK通路促进MSC向成骨分化和成熟 ,是促进骨形成的重要成分。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。     

阳离子脂法介导质粒转染大鼠骨髓基质干细胞用于基因修饰的细胞移植治疗

目的探讨阳离子脂转染方法在骨髓基质干细胞(BMSC)基因转染中的应用.方法通过梯度试验确定相对最佳的转染条件并测定LipofectamineTM2000(LP2000)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率;分析细胞周期对导入基因表达的影响;以流式细胞仪测定转基因BMSC的EGFP表达强度和阳性比例随时间的变化;将EGFP基因转染的大鼠BMSC注射法移植入同源大鼠心肌内,以逆转录PCR法检测心肌组织内EGFP基因的转录,荧光显微镜法检测EGFP阳性的BMSC.结果在不同转染条件下(DNA浓度、DNA:LP2000),LP2000介导EGFP基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率不同;通过阳离子脂法导入基因的表达效果受细胞周期制约;细胞移植后,能在大鼠心肌组织中检测到EGFP基因的转录以及表达EGFP基因的BMSC.结论阳离子脂可以作为基因修饰的细胞移植治疗的有效载体.为了提高基因转染的瞬时效率和基因的表达效率,降低毒性、满足转基因细胞移植的要求,尚需进一步的研究.     

BrdU体外标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 探讨连续培养的骨髓间充质干细胞(MSCs)的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)最佳标记时间、剂量。方法 差速贴壁法对SD鼠MSCs进行体外传代培养;第6代细胞行流式细胞仪鉴定细胞的表面抗原;以终浓度分别为5、10、15μmol/L的BrdU检测最佳标记剂量;在细胞生长融合前72、48、36、24、12、3h加入BrdU,使终浓度为10μmol/L,并分别孵育至细胞融合,测定BrdU的标记率,找出最佳标记时间;免疫组化分析BrdU标记率。结果 流式细胞仪检测所标记的细胞表达CD29和CD44,不表达CD11b和CD45;终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,并且连续传5代均可检测到。结论 传代后贴壁生长的梭形细胞为MSCs,终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,且可以连续检测到,提示BrdU标记可用于MSCs移植入体内后存活、生长和分化的动态观察。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养的适宜条件。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠骨髓MSCs,观察其形态,流式细胞仪检测细胞表面标记,MTT法观察不同浓度的胎牛血清(FBS)对MSCs生长曲线的影响及不同代MSCs的生长曲线和细胞贴壁率。结果:大鼠MSCs呈梭形或纺锤形,CD34、CD45表达阴性,CD44表达71.5%、CD166表达83.2%;MSCs用10%的FBS培养,其增殖明显高于用无血清、5%及20%的FBS培养;第1、3、5、10代MSCs的生长曲线及细胞贴壁率无明显差异(P>0.05)。结论:密度梯度离心法结合贴壁分离法适于大鼠MSCs的分离;10%的FBS适合MSCs的培养;早期传代对MSCs的增殖无影响。     

大鼠骨髓间充质干细胞通过膀胱壁注射改善大鼠逼尿肌无力

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone-derived mesenchymal stem cells,rBMSCs)膀胱壁注射法改善大鼠逼尿肌无力(acontractile detrusor,ACD)的可能性.方法 40只SD雌性大鼠分为4组,每组10只:正常大鼠对照组、低温诱导ACD组、生理盐水治疗组、rBMSCs治疗组.常规分离培养rBMSCs至第3代.建立大鼠膀胱壁冻伤模型模拟逼尿肌无力的情况,将rBMSCs或生理盐水注入大鼠膀胱壁肌层,14 d后检测各组大鼠膀胱排尿功能,逼尿肌肌条收缩力,RT-PCR和Western blot检测平滑肌收缩相关蛋白(α-SMA、Calponin和SM-MHC)的表达情况,HE染色了解各组大鼠膀胱壁组织学改变情况.结果 rBMSCs治疗组膀胱内压、肌条收缩力显著高于低温诱导ACD组和生理盐水治疗组(P＜0.01),恢复超过50％.治疗组α-SMA、Calponin及SM-MHC的表达明显高于低温诱导ACD组和生理盐水治疗组(P＜0.01).结论 rBMSCs通过膀胱壁注射能有效改善大鼠逼尿肌无力.     

大鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化潜能的研究

目的体外研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)分化为血管内皮细胞的潜能。方法采用密度梯度离心法分离rMSCs,体外扩增并进行鉴定。在内皮细胞生长培养基(EGM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导rMSCs向血管内皮细胞分化,观察细胞形态学变化。采用免疫细胞化学法和Dil荧光标记法,分别检测诱导后rMSCs的内皮细胞表型表达及对乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的摄取能力。结果形态学观察显示,诱导后的rMSCs可见类似内皮细胞样改变,并表达血管内皮细胞特异的表面标志vWF和CD31,但仅少数细胞具有摄取Dil-Ac-LDL的能力。结论VEGF和bFGF在体外能够诱导rMSCs出现内皮细胞表型,但尚不完全具备成熟内皮细胞的功能特性。rMSCs具有向血管内皮细胞分化的潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化潜能的研究

目的 体外研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)分化为血管内皮细胞的潜能.方法 采用密度梯度离心法分离rMSCs,体外扩增并进行鉴定.在内皮细胞生长培养基(EGM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导rMSCs向血管内皮细胞分化,观察细胞形态学变化.采用免疫细胞化学法和Dil荧光标记法,分别检测诱导后rMSCs的内皮细胞表型表达及对乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的摄取能力.结果 形态学观察显示,诱导后的rMSCs可见类似内皮细胞样改变,并表达血管内皮细胞特异的表面标志vWF和CD31,但仅少数细胞具有摄取Dil-Ac-LDL的能力.结论 VEGF和bFGF在体外能够诱导rMSCs出现内皮细胞表型,但尚不完全具备成熟内皮细胞的功能特性.rMSCs具有向血管内皮细胞分化的潜能.     

BrdU体外标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

OBJECTIVE: To study the optimal dosage and timing for bromodeoxyuridine (BrdU) labeling of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) in vitro. METHODS: Bone marrow-derived MSCs of SD rats were cultured in vitro routinely and the sixth passage was taken for identification of specific surface antigens by flow cytometry. Before reaching cell confluence, the purified MSCs were incubated with BrdU at different concentrations (5, 10, and 15 micromol/L) for different incubating time (3, 12, 24, 36, 48, and 72 h) with 10 micromol/L BrdU, to identify the optimal BrdU concentration and incubating time for cell labeling. Immunohistochemistry was performed to calculate the labeling index (LI). RESULT: Flow cytometry showed that MSCs expressed CD29 and CD44 but not CD11b or CD45. Incubation of the MSCs with BrdU at 10 micromol/L and for an optimal length of 48 h appeared to achieve the highest LI, both of which exceeded 98%, with the labeling identifiable in five consecutive passages. CONCLUSIONS: The continually passaged cells are MSCs, the incubation of which with 10 micromol/L BrdU for 48 h may achieve a LI over 98% without producing obvious cell damages. The results suggest that BrdU labeling provides a feasible means for a dynamic in vivo observation of the survival, growth and differentiation of the implanted MSCs.     

干细胞因子对骨髓间充质干细胞定向迁移的影响

目的 初步探讨干细胞因子对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stemcells,BMSCs)定向迁移的影响.方法 密度梯度离心和贴壁培养法分离培养BMSCs,并予以传代.利用KT-PCR方法检测BMSCs对干细胞因子受体c-kit的表达,使用Transwell小室建立体外趋化迁移模型,评估干细胞因子对BMSCs定向迁移的影响以及p38丝裂原活化蛋白激酶通路(p38MAPK)抑制剂SB203580对干细胞因子诱导BMSCs迁移能力变化的影响.结果 通过密度梯度离心和贴壁培养法获得了纯化的MSCs.RT-PCR证实BMSCs表达c-kit;干细胞因子可趋化体外模型中BMSCs通过聚碳酸酯膜向下室内迁移,在0～50ng/mL浓度范围内迁移细胞数量随干细胞因子的浓度增加而增加.加入SB203580后干细胞因子诱导的BMSCs迁移受到抑制.结论 干细胞因子可以趋化BMSCs发生定向迁移,这一迁移过程的细胞内信号转导与p38MAPK通路有关.     

Effect of growth and differentiation factor 6 on the tenogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells

Background Recent studies showed that bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) had risk of ectopic bone formation.In this study,we aimed to investigate the effect of growth and differentiation factor 6 (GDF-6) on the tenogenic differentiation of BMSCs in vitro,and then combined with small intestine submucous (SIS) to promote tendon regeneration in vivo.Methods The BMSCs were isolated from the green fluorescent protein (GFP) rats,and were characterized by multi-differentiation assays following our previous study protocol.BMSCs cultured with different concentrations of GDF-6,without growth factors served as control.After 2 weeks,mRNA expression and protein expression of tendon specific markers were examined by qRT-PCR and Western blotting to define an optimal concentration of GDF-6.Mann-Whitney U-test was used to compare the difference in relative mRNA expression among all groups; P ≤0.05 was regarded as statistically significant.The GDF-6 treated BMSCs combined with SIS were implanted in nude mice and SD rat acute patellar tendon injury model,the BMSCs combined with SIS served as control.After 12 and 4 weeks in nude mice and tendon injury model,the samples were collected for histology.Results After the BMSCs were treated with different concentration of GDF-6 for 2 weeks,the fold changes of the specific markers (Tenomodulin and Scleraxis) mRNA expression were significantly higher in GDF-6 (20 ng/ml) group (P ≤0.05),which was also confirmed by Western blotting result.The BMSCs became parallel in orientation after GDF-6 (20 ng/ml) treatment,but the BMSCs in control group were randomly oriented.The GDF-6 (20 ng/ml) treated BMSCs were combined with SIS,and were implanted in nude mice for 12 weeks,the histology showed neo-tendon formation.In the SD rat patellar tendon window injury model,the histology also indicated the GDF-6 (20 ng/ml) treated BMSCs combined with SIS could promote tendon regeneration.Conclusions GDF-6 has tenogenic effect on the tenogenic differentiation of BMSCs,and GDF-6 (20 ng/ml) has better tenogenic effect compared to other concentrations.The GDF-6 (20 ng/ml) treated BMSCs combined with SIS can form neo-tendons and promote tendon regeneration.     

姜黄素促进炎症微环境下大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化

目的 研究姜黄素对炎症微环境下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响。方法 分离、培养大鼠BMSCs,以10 ng/mL的肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱发细胞炎症反应,用不同浓度姜黄素处理细胞,CCK-8检测细胞增殖以便筛选出实验所需姜黄素适宜浓度;实验分组为正常组、炎症组和炎症+姜黄素组;碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色检测成骨分化,实时荧光定量PCR检测骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)的表达。结果 成功分离培养BMSCs;低浓度的姜黄素无细胞毒性,1μmol/L为适宜浓度;炎症降低大鼠BMSCs成骨相关基因BSP、Runx2表达,且ALP染色变浅、矿化结节减少;而姜黄素则可以逆转这种趋势,促进炎症状态下成骨相关基因 BSP、Runx2的表达(P＜0.05),较炎症组ALP染色加深,矿化结节增多。结论 姜黄素可以促进炎症微环境下BMSCs成骨分化。     

人骨髓间充质干细胞体外分化为肝样细胞的实验研究

目的 探索肝细胞生长因子（HGF）联合成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）诱导人骨髓间充质干细胞（HMSCs）向肝细胞方向分化的能力,为生物人工肝及肝细胞移植等找到新的种子细胞来源。方法 分别用HGF、FGF-4、HGF＋FGF-4诱导HMSCs分化为肝样细胞：以未加诱导因素的HMSCs、L-02人肝细胞株为阴、阳性对照组。相差显微镜观察细胞形态的变化：在不同诱导分化阶段免疫细胞化学染色检测AFP和CK18,并用图像分析法计算HMSCs的分化比率;免疫荧光细胞化学染色法检测AFP、ALB的表达;RT-PCR检测AFP和ALB mRNA表达的情况。结果 HMSCs经诱导向肝样细胞转化,变成纺锤形、不规则圆形或多角形细胞。免疫细胞化学染色各诱导组均可检测出AFP和CK18表达,图像分析表明HGF＋FGF-4联合诱导分化的AFP、CK18阳性率最高,HGF次之,FGF-4则较弱;免疫荧光细胞化学染色发现各诱导组AFP、ALB均为阳性表达,而阴性对照组则为阴性表达;各诱导组RT-PCR均可检测出AFP和ALB mRNA的表达,而阴性对照组则没有表达。结论 HGF、FGF-4、HGF＋FGF-4均能诱导HMSCs分化为肝样细胞,分化的肝样细胞能分泌肝细胞特异性产物AFP、ALB、CK18等。以HGF＋FGF-4诱导HMSCs分化为肝样细胞的阳性率最高,HGF次之,FGF-4则较弱。     

Treatment of cerebral ischemia with combination of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and Chinese medicine

Many laboratories have been attempting to integrate Chinese medicine(CM) with the research of stem cells in order to explore this promising frontier.Studies on the combination of CM and bone marrow-derived mesenchymal stem cells(BMSCs) have found that some effective components from CM could activate endogenous stem cells and induce stem cells to differentiate into neural-like cells in vitro and promote angiogenesis.This review summarized the latest research findings of BMSCs and their application combined with CM in the treatment of cerebral ischemia.     

骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养的实验研究

目的：建立骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养的模型,研究间充质干细胞对体外培养的髓核细胞活性的影响。方法：通过transwell插入式培养皿构建间充质干细胞-髓核细胞共培养模型,观察共培养条件下髓核细胞形态变化,计数细胞增殖,ELISA方法检测蛋白多糖含量变化。结果：经过8 d共培养,实验组中的髓核细胞计数较对照组增加明显（P〈0.01）,培养上清液中蛋白多糖合成较对照组明显提高（P〈0.01）。结论：成功建立共培养模型,与间充质干细胞共培养后髓核细胞活性上调。