诺帝对人恶性胶质瘤裸鼠原位移植瘤FPR、VEGF表达的影响及意义

目的观察诺帝对人恶性胶质瘤裸鼠原位移植瘤甲酰化肽受体(FPR)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨其在抗胶质瘤血管生成的治疗意义。方法脑立体定向注射技术复制人U87胶质母细胞瘤裸鼠脑原位移植瘤模型,接种7d后,随机分为空白对照组,生理盐水对照组和诺帝治疗组,诺帝治疗组按27mg/kg行腹腔注射进行治疗。观察处理前后动物生存、移植瘤生长状态以及移植瘤组织病理学形态变化,分别采用间接免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜技术、免疫组织化学技术观测FPR、VEGF的表达变化。结果空白对照组和生理盐水组、诺帝治疗组肿瘤体积分别为(1.040±0.263)mm3、(0.880±0.212)mm3和(0.195±0.054)mm3,治疗组较对照组明显缩小,抑瘤率为81.25%。三组FPR表达分别为(57.473±3.072)、(54.332±1.298)和(40.499±2.216),三组VEGF定量测定的积分光密度值(IOD)表达分别为(154.763±4.635)、(149.139±1.494)和(133.784±5.143),治疗组FPR、VEGF蛋白表达显著减弱(P<0.05)。结论诺帝能降低FPR和VEGF表达了可能是抗胶质瘤血管生成作用的重要分子机制之一。     

RNAi抑制STAT3表达、活化诱导人胶质瘤干细胞凋亡与分化

目的抑制人胶质瘤干细胞(GSCs)信号转导活化转录因子3(STAT3)表达、活化,了解STAT3在细胞凋亡、分化调节中的作用。方法 RNAi抑制人GSCs中STAT3表达、活化,流式细胞分析检测细胞凋亡和干细胞比例变化;实时定量多聚酶链反应(PCR)和Weastern-blot检测Bcl-2、BAX、Caspase-3表达;干扰组和对照组GSCs接种裸鼠,观察成瘤情况。结果干扰组人GSCs凋亡比例(16.03%)显著高于空白组(2.03%)和阴性对照组(3.19%)(P<0.05),CD133+细胞比例(5.7%)显著低于空白组(92.2%)和阴性对照组(87.7%);干扰组Bcl-2表达显著低于空白组和阴性对照组(P<0.05);裸鼠移植瘤实验中,阴性对照组3只成瘤,而干扰组均未成瘤。结论抑制人GSCs中STAT3表达、活化,可诱导凋亡,促进分化,抑制其成瘤能力。细胞凋亡增加可能与Bcl-2表达下调有关。     

RA/IFN-γ协同诱导C6胶质瘤细胞分化的研究

目的 探索诱导分化新策略对脑胶质瘤的潜在治疗作用。方法 观察协同诱导分化处理前后C6胶质瘤细胞形态改变并应用免疫组化染色法检测其胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达变化。结果 维甲酸（RA）及干扰素－γ（IFN－γ）诱导分化可使C6细胞出现的一步向星形细胞分化的特异性形态学改变；空白对照组细胞大多数呈GFAP弱阳性反应；而RA组与RA／IFN-γ组细胞的GFAP表达量显增加（P1，P2＜0．01），RA／IFN－γ组相比增加更显（P＜0．01）。结论 协同诱导分化疗法能促使胶质细胞进一步成熟分化。     

骨髓间充质干细胞源性神经细胞对C6胶质瘤的趋向性

目的探索骨髓间充质干细胞(BMSCs)源性神经细胞对C6胶质瘤的趋向性。方法阿尔法最低必需培养基(α-MEM)、神经细胞生长添加剂B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)和全反式维甲酸(ATRA)诱导BMSCs向神经细胞分化。体外通过Transwell系统共培养BMSCs源性神经细胞与C6胶质瘤细胞培养基,HE染色分析穿过聚醋酸纸膜微孔的细胞数量;体内在C6胶质瘤模型中移植5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的BMSCs源性神经细胞,免疫组化分析移植细胞的迁移能力。结果条件培养基诱导BMSCs分化的细胞表达神经元核抗原(NeuN)为47%±0.08%,高分子量神经丝蛋白(NF-H)为45%±0.07%及部分巢蛋白(Nestin)为10%±0.04%,体外Transwell结果显示BMSCs源性神经细胞透过聚碳酸酯膜微孔的数量明显高于对照组(P<0.05),体内移植结果显示BMSCs源性神经细胞与BMSCs对胶质瘤的迁移无明显差异(P>0.05)并呈现时间特异性(P<0.01)。结论 BMSCs源性神经细胞对C6胶质瘤有明显的趋向性。     

骨髓间充质干细胞干预大鼠C6胶质瘤的试验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)干预对大鼠脑胶质瘤C6细胞分化的影响及其相关机制.方法 采用Transwell小室共培养骨髓间充质干细胞及C6细胞,并以细胞计数法对C6细胞增值水平进行检测,以流式细胞术对C6细胞的细胞周期进行检测;以免疫荧光对波形蛋白(vimentin)的表达情况进行检测,以免疫组化法对胶质纤...     

卡莫司汀对C6胶质瘤细胞凋亡作用机制的研究

目的研究卡莫司汀(BCNU)对胶质瘤凋亡的作用机制。方法取生长状态良好的C6胶质瘤细胞悬液,按1×107个细胞/25μl的密度接种于20只SD大鼠腹股沟区皮下,观察其生长情况。将16只成瘤大鼠随机等分为治疗组与非治疗组,前者按相同剂量隔日腹腔内注射BCNU。治疗2周后处死全部大鼠,取大鼠右侧腹股沟区皮下肿瘤行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色,检测胶质瘤的病理学特征及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、bax和bcl-2蛋白的表达情况,观察瘤细胞凋亡情况。结果C6胶质瘤细胞皮下接种4～5d后,大鼠腹股沟区皮下形成实体瘤;治疗2周,非治疗组和治疗组SD大鼠平均肿瘤质量差异有统计学意义(P<0.01),治疗组肿瘤抑制率为29.6%。肿瘤GFAP表达为阳性;BCNU治疗后bax基本无改变,bcl-2下调明显(P<0.01),bax/bcl-2比值明显增加。结论BCNU腹腔注射治疗大鼠神经胶质瘤导致胶质瘤细胞凋亡,其主要机制可能与下调凋亡蛋白bcl-2的表达和升高bax/bcl-2的比值有关。     

JAK-STAT3信号通路调节大鼠骨髓间充质干细胞神经定向分化

探索体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（rat mesenchymal stem cells,MSCs）神经诱导分化的内在分子机制。方法：体外贴壁法培养MSCs,纯化培养传至3代后,诱导组采用含有表皮生长因子（EGF）,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）,脑源性神经神经生长因子（BDNF）的L-DMEM作为神经诱导培养基,诱导MSCs向神经细胞分化;含AG490组采用含有AG490（JAK-STAT3通路抑制剂）5uM的诱导组神经诱导培养基,同等条件下诱导MSCs神经分化。倒置显微镜下观察细胞形态变化、免疫细胞化学检测神经元特异性烯醇化酶(NSE),微管相关蛋白2（MAP2）,胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）阳性率。Western blot检测JAK-STAT3通路中总STAT3蛋白和酪氨酸(Tyr705) STAT3磷酸化蛋白表达水平。结果：神经诱导培养基可以诱导MSCs向神经元和神经胶质细胞转分化,诱导5天后细胞轴突逐渐变长,呈典型神经细胞样形态,并且细胞轴突间相互接触。Western blot结果表明在神经诱导过程中酪氨酸(Tyr705)STAT3磷酸化逐渐增强,JAK-STAT3信号通路被激活。而JAK-STAT3通路特异性抑制剂AG490处理后,再经神经诱导培养基诱导后,MSCs向神经胶质细胞分化比例明显下降,而MSCs向神经元分化没有受到影响, 从而提高了 MSCs向神经元分化的比例。 结论 JAK2/STAT3信号通路参与了MSCs神经定向分化的调节,抑制此信号通路可以减少向星形胶质细胞分化的比例,提高了MSCs向神经元分化的比例。     

C6大鼠胶质瘤模型及其在脑胶质瘤治疗研究中应用的缺陷

C6细胞是大鼠经化学致癌剂N-亚硝基甲脲体内诱发产生的脑胶质瘤细胞。具有较典型的人脑胶质瘤组织学特点。大鼠脑内立体定向接种C6细胞建立的动物模型。因成瘤高，动物手术死亡率低。所以广泛应用于脑胶质瘤治疗的研究中。国外研究发现，来源于非纯种大鼠的C6细胞具有有强的免疫原性；其主要组织相容性基因复合体中存在与大鼠是异源性的基因；C6细胞接种于大鼠体内引发强烈的免疫排斥反应可使肿瘤不能持续生长甚至自行消退，因此混淆了治疗所产生的效应。尤其当用于免疫和基因免疫治疗的研究时，存在较大缺陷。     

C6细胞热休克蛋白抗原肽复合物的提纯及抑瘤作用的研究

目的 提纯大鼠脑胶质瘤C6细胞热休克蛋白抗原肽复合物(HAC),免疫SD大鼠,观察HAC的抑瘤作用。方法 采用免疫亲和层析方法提纯大鼠脑胶质瘤C6细胞HAC,免疫20只大鼠为实验组,以另20只大鼠作为对照组,于免疫后1周,采用立体定向脑内接种方法,以C6细胞攻击两组大鼠,于肿瘤细胞攻击后第二周,取两组动物外周静脉血,测定外周静脉血淋巴细胞计数,并应用流式细胞仪技术测定外周血中CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞的比例。观察饲养过程中实验动物出现的症状、体征和第四周实验动物存活率。于第四周处死存活动物,取脑组织进行HE染色病理组织学检查,并用免疫组化方法分析脑胶质瘤浸润区T淋巴细胞分布情况。结果 实验组大鼠外周血淋巴细胞计数显著高于对照组(P<0.01),CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞的比例实验组均显著高于对照组(P<0.01)。实验组动物症状出现时间显著晚于对照组动物(P<0.01),实验组动物第四周末存活率显著高于对照组(P<0.05)。实验组胶质瘤局部浸润的CD3+和CD4+细胞数均显著高于对照组(P<0.01),实验组胶质瘤局部浸润的CD8+细胞数与对照组比较无显著差异(P>0.05),实验组胶质瘤局部浸润T淋巴细胞CD4+/CD8+显著高于对照组(P<0.01)。结论 C6细胞中HAC可以诱导大鼠产生对C6细胞的细胞免疫,提高大鼠存活率。     

γ刀照射对荷胶质瘤大鼠C-myc蛋白表达的抑制

目的观察荷胶质瘤大鼠γ刀照射后,C-myc蛋白表达的变化。方法建立颅内种植胶质瘤C6细胞的荷瘤大鼠模型。3周后,实验组给予γ刀治疗。计数荷瘤大鼠生存时间。免疫组化SP染色及计算机图像分析检测C-myc基因蛋白水平表达。结果实验组及对照组荷瘤大鼠生存时间分别为(36.5±3.1)d和(28.0±2.4)d,两组相较,差异显著(P<0.01)。实验组及对照组荷瘤大鼠C-myc基因蛋白阳性表达率分别为(40.98±15.46)%和(77.62±12.11)%,二者差异显著(P<0.01)。结论γ刀诱导胶质瘤凋亡的机制可能与抑制肿瘤细胞C-myc基因蛋白水平表达有关。     

聚羟基丁酸-羟基异戊酯与绵羊软骨细胞的相容性

背景：聚羟基丁酸-羟基异戊酯是微生物在生长条件不平衡状态时合成的产物，具有可降解性、热塑性，作为组织工程的新型支架材料，越来越受到重视。 目的：评估聚羟基丁酸-羟基异戊酯作为组织工程支架，与绵羊关节软骨细胞的相容性。 设计、时间及地点：体外对比观察实验，于2005-11/2007-05在中山大学附属第三医院中心实验室和广东冠昊生物科技公司动物手术室完成。 材料：聚羟基丁酸-羟基异戊酯膜和泡沫样三维支架由华南理工大学材料学院提供。6月龄雄性实验绵羊1只，体质量17 kg，由广东冠昊生物科技公司提供。 方法：切取绵羊膝关节软骨后，分离、原代培养软骨细胞，将第2代软骨细胞接种至聚羟基丁酸-羟基异戊酯膜和泡沫样三维支架上，以单纯细胞培养为对照。 主要观察指标：扫描电镜观察细胞形态，计数1，2，6 h时的细胞黏附率；按培养液量与支架体积10 mL/cm³为标准浓度制备浸提液，并制备标准浓度1/16~16倍的浸提液，以MTT法检测细胞毒性；流式细胞仪分析接种到材料上的细胞周期，计算增殖指数；接种于聚羟基丁酸-羟基异戊酯三维支架上4，8，12 d，以Hoechst33258荧光法定量测定细胞内DNA含量，二甲基亚甲蓝法测定糖胺聚糖含量。 结果：第2代软骨细胞在聚羟基丁酸-羟基异戊酯膜上6 h的黏附率75.6%，与对照组比较差异无显著性；9个浓度梯度的浸提液毒性均为0级；扫描电镜观察见细胞在聚羟基丁酸-羟基异戊酯膜上伸展良好，形态佳，细胞间连接正常，在三维支架的孔隙内立体生长，并分泌大量基质；流式细胞分析接种于材料上的细胞周期无变化；与培养瓶内软骨细胞相比，8 d时，聚羟基丁酸-羟基异戊酯三维支架上的细胞内糖胺聚糖浓度显著增高，12 d时，支架上的细胞内DNA量显著增高。 结论：聚羟基丁酸-羟基异戊酯作为软骨组织工程支架材料，与绵羊关节软骨细胞具有良好的生物相容性，但早期细胞黏附率低，是其不足。     

The action of γ-vinyl-GABA and γ-acetylenic-GABA on the resting and stimulated release of GABA in vivo

The effects of γ-vinyl-GABA (4-amino-hex-5-enoic acid, RMI 71754) and γ-acetylenic-GABA (4-amino-hex-5-ynoic acid, RMI 71645), the selective and irreversible inhibitors of GABA-transaminase (E.C. 2.6.1.19), on the resting and stimulated release of GABA and other amino acids from sensorimotor cortex of rats was studied using a superfusion technique.Administration of a single dose of γ-vinyl-GABA (1500 mg/kg i.p.) caused the appearance of GABA in superfusate. This reached a maximal peak size after 50 min and remained high for 3 h. γ-Vinyl-GABA was also released and reached a maximum value after 20 min and decreased to low levels during 3 h. There was no direct parallelism between the time courses of release of GABA and γ-vinyl-GABA. Also, the amount of GABA released was much larger when the drug was administered by i.p. injection than when applied directly to the cortex surface through the cannula at 100 μM.In the presence of γ-vinyl-GABA, stimulation of the brachial plexus contralateral to the superfusion cannula increased GABA and glutamate release, but was without effect on γ-vinyl-GABA itself or any other amino acid.In the presence of γ-acetylenic-GABA the contralateral stimulation increased significantly only the rate of release of glutamate and the combined peaks of GABA and γ-acetylenic-GABA. These changes were not observed to follow stimulation of the ipsilateral plexus. Stimulation of either plexus had no detectable action on the rates of release of GABA from the visual cortex.The changes in rates of release of GABA and glutamate due to stimuli were reversible, returning to control levels after cessation of the stimulation.     

14-3-3蛋白在星形细胞瘤中的表达及意义

目的探讨14-3-3蛋白在星形细胞瘤中的表达与肿瘤病理分级和预后间的关系。方法采用免疫组化ABC法检测10例正常脑组织和67例确诊并有随访的人脑星形细胞瘤石蜡标本中14-3-3蛋白的表达情况。分析14-3-3蛋白的表达与肿瘤恶性程度及预后间的关系。结果在正常脑组织标本中，14-3-3蛋白主要表达于神经元胞体和突起，而在少数的胶质细胞中仅见其弱表达。绝大部分星形胶质细胞瘤中可见14-3-3蛋白阳性表达，其阳性表达率为：Ⅱ级76．5％（13／17），Ⅲ级76．2％（16／21），Ⅳ级79．3％（23／29）。不同恶性级别的星形细胞肿瘤中，14-3-3蛋白的阳性表达率无显著差别（P〉0．05），但14-3-3蛋白表达的强度和范围有随肿瘤的恶性度增高而增加的趋势（P〈0．05）。52例14-3-3蛋白阳性表达患者的生存期明显短于15例14-3-3蛋白表达阴性的患者（P〈0．01）。结论14-3-3蛋白在人脑星形细胞瘤中的表达上凋与肿瘤的恶性程度及预后相关。14-3-3蛋白有望成为星形细胞瘤基因治疗的新靶点。     

Alcohol embryo- and fetopathy. Neuropathology of 3 children and 3 fetuses.

Maternal chronic ethanol abuse during pregnancy causes malformations of the offspring. Three children (aged 6 months, 9 months, 4 1/2 years) and 3 fetuses (17th, 18th, and 20th gestational week) showed a wide spectrum of disorders ranging from severe dysraphic state, arhinencephaly, porencephaly, agenesis of corpus callosum, a range from hydranencephaly to microdysplasias (p.e. reduced gyration of dentate nucleus and inferior olives), and a range from gastrochisis or congenital heart defects to craniofacial dysmorphogenesis and palmar crease anomalies. The patterns of the cerebral malformations were not as uniform as the clinical phenotype of the alcohol embryopathy. The observations did not support the assumption that there exists a specific period for alcohol teratogenicity.     

pcDNA3/NT-3真核表达载体的构建及其表达

目的构建大鼠神经营养因子3（NT-3）基因真核表达载体并观察其在真核细胞内的表达情况。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以阳离子脂质体Li-pofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NT-3在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为822bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/NT-3酶切后产生822bp和5.2kb的片段,DNA测序证实822bp片段的碱基序列与大鼠NT-3基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/NT-3重组质粒。将其转染真核细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NT-3能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒载体pcDNA3/NT-3,为后续的研究奠定基础。     

Differential impact of semaphorin 3E and 3A on CNS axons

During the development of the central nervous system (CNS), the correct wiring of outgrowing neurites is mediated by antagonistic mechanisms. Aberrant growth is prevented by repulsive factors such as semaphorins. Expression of the ligands Sema3A and -3E and the receptors neuropilin Npn-1, -2a and -2b in the chick visual system were analyzed by RT-PCR. Whereas Sema3A and its major receptor Npn-1 were abundant, Sema3E and Npn-2 isoform expression was highly restricted and developmentally regulated. Peak expression occurred during retinal axon innervation of the tectum. Functional in vitro assays with recombinant proteins revealed a topography-specific growth cone collapsing activity of Sema3A for tectal axons. Interestingly, whereas tectal axons collapsed in a topographic-specific manner only in the presence of Sema3A, retinal axons responded only to Sema3E. The collapsing activity was intracellularly mediated by cGMP. For a detailed analysis of neuronal responses to sempahorins, time lapse video recording was performed. When tectal and retinal axons were pre-exposed to brain-derived neurotrophic factor (BDNF), a protective effect was evident only in the case of retinal axons. Our results suggest a molecular mechanism whereby ingrowth of retinal axons into the tectum can be regulated by Sema3E/BDNF modulation without disturbing tectal axon growth out of the tectum mediated by Sema3A.     

14-3-3蛋白在人脑胶质瘤中的表达及生物学意义

目的检测14-3-3蛋白在人脑胶质瘤中的表达情况,探讨其在胶质瘤发生发展中的生物学意义。方法采用免疫组化亲和素-生物素过氧化物酶复合物(ABC)法检测5个胶质瘤细胞系(U251MG,U87MG,BT325,SHG44和C6)、121例人脑胶质瘤石蜡标本和10例正常脑组织中14-3-3蛋白的表达情况。分析14-3-3蛋白的表达在胶质瘤发生发展中的作用。结果在正常脑组织标本中,13-3-3蛋白主要表达于神经元的胞体和突起,仅在少数的胶质细胞中可见14-3-3蛋白的弱表达。然而,5个胶质瘤细胞系和绝大部分星形细胞瘤中可见14-3-3蛋白的阳性表达,其表达阳性率为:Ⅰ级78.6%(11/14),II级75%(18/24),III级76.2%(16/21),IV级80%(20/25)。不同恶性级别的星形细胞瘤中,14-3-3蛋白的阳性表达率无显著差别,但14-3-3蛋白的表达强度和范围有随肿瘤的恶性度增高而增加的趋势。其它类型的胶质瘤中也可见14-3-3蛋白的大量表达,其表达阳性率为:少突胶质细胞瘤66.7%(4/6),间变型少突胶质细胞瘤100%(4/4),室管膜瘤50%(2/4),间变型室管膜瘤66.7%(2/3),脉络从乳头状瘤100%(5/5),松果体细胞瘤100%(3/3),髓母细胞瘤66.7%(8/12)。结论14-3-3蛋白在人脑胶质瘤中有大量的表达。14-3-3蛋白表达上调可能是胶质瘤细胞对抗调亡的一种共同机制,以14-3-3蛋白为靶点有望成为一种有前景的新的胶质瘤生物学治疗方法。     

两种3T3光毒性试验方法在防晒化妆品光毒性评价中的应用

背景：评价化妆品光毒性,传统多采用兔或豚鼠动物实验,即将化学物涂抹在动物背部去毛的皮肤上,经一定时间间隔后暴露于UVA 光线下,观察其变化,费时,费力,且给动物带来很大痛苦。各国实验室都在寻找动物替代实验的方法。 目的：采用2种3T3细胞光毒替代试验方法（中性红法与MTT法）作为替代方法评价防晒化妆品引起皮肤光毒性的可能性。 设计、时间及地点：动物替代实验。实验于2008年8月~2008年12月中中国检验检疫科学研究院毒理学实验室完成。 材料：3T3小鼠胚胎成纤维细胞,购于美国ATCC公司。 方法：选用SPF值分别为10,15,30的防晒化妆品霜剂和乳液各一种,作用于3T3 细胞后,暴露或不暴露于紫外线下,用中性红法与MTT法判定细胞毒性情况,分析其细胞存活率,,光刺激因子( PIF) ,以判断待测物质是否具有光毒性。 主要观察指标：PIF值。 结果：防晒化妆品SPF30-2（霜剂）可能有光毒性,2≤PIF<5。MTT与NRU两种方法均得到了相同的结论。 结论：3T3细胞光毒性试验用来评价化妆品的光毒性是可行的,应加强对防晒化妆品的监管。