基因转染Smad7对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的探讨Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化的影响。方法体外培养转染Smad7的大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞），分为强力霉素（Dox）诱导组和未加强力霉素的对照组，前者予Dox诱导24h后，给予高糖刺激，后者不加Dox诱导。采用免疫细胞化学方法检测P-Smad2／3核转位情况；Western blot方法检测Smad7、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏素（E-cadherin）蛋白的表达水平。结果成功构建了Dox调控的可上调表达Smad7的NRK52E细胞。NRK52E细胞在基础状态下可表达低水平P-Smad2／3（16．1％），与对照组比较，上调表达Smad7显著抑制高糖介导的NRK52E细胞P-Smad2／3核转位（30．3％掷58．5％，P〈0．01）。抑制α-SMA蛋白的表达，逆转高糖介导的NRK52E细胞E-Cadherin蛋白的下调表达。结论基因转染上调表达Smad7可通过抑制Smad2／3的活化和核转位而阻抑高糖介导的肾小管上皮细胞转分化。     

高糖通过TGF-β1／Smad信号通路介导肾小管上皮细胞1型胶原合成的机制探讨

目的探讨高糖对肾小管上皮细胞Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）合成影响的分子机制。方法体外培养的大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E细胞）分为四组：甘露醇组、高糖组、高糖＋TGF-β1中和抗体组、高糖＋IgG1对照组。ELISA法检测细胞培养上清中TGF-β1的浓度，细胞免疫化学方法检测p-Smad2／3核表达水平，RT—PCR和Western blot方法分别检测CollagenⅠmRNA和蛋白的表达。结果高糖以时间依赖方式上调CollagenⅠmRNA表达。高糖刺激NRK52E细胞24h和48h后内源性TGF-β1合成明显增加，约为甘露醇对照组的3倍。与刺激前和甘露醇组比较，高糖刺激24h可显著上调NRK52E细胞p-Smad2／3核表达水平（t=4．2，t=3．25，P〈0．01）。TGF—β1中和抗体能抑制高糖介导的p-Smad2／3核表达及CollagenⅠ蛋白的表达（t=3．12，t=3．02，P〈0．01）。结论高糖通过TGF-β／Smad信号通路介导肾小管上皮细胞CollagenⅠ的合成。     

大黄酸对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的观察大黄酸对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（EMT）的影响。方法雄性Wistar大鼠随机分为3组：正常对照组（N组，n=12）、糖尿病模型组（D组，／n=12）、糖尿病大黄酸干预组[R组，n=12，大黄酸100mg／（kg·d）灌胃]。成模后第8周末及16周末各组分别处死6只大鼠，测定24h尿蛋白排泄量、血肌酐；HE及MASSON染色法观察肾脏病理改变；免疫组织化学法检测E钙档蛋白（E-cad）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤连蛋白（FN）及转化生长因子13，（TGF-β1）的表达。结果（1）与N组比较，D组大鼠肾小管间质损伤指数、肾间质胶原面积明显增加（P〈0．01）；（2）D组大鼠肾小管上皮细胞E-cad阳性表达显著低于N组，α-SMA、FN和TGF-β1阳性表达均显著高于N组，E-cad表达和TGF-β1表达呈负相关（rs=-0．60，P〈0．05），α-SMA、FN表达和TGF-β1表达呈正相关（rs=0．88，P〈0．05；rs=0．91，P〈0．01）；（3）R纽大鼠肾小管间质损伤指数、肾间质胶原面积较D组明显减弱，其肾小管上皮细胞的E-cad的表达较D组明显增加，α-SMA、FN和TGF-β1表达较D组均明显减弱（P〈0．01）。结论大黄酸具有减轻糖尿病大鼠肾小管间质病变的肾脏保护作用，其机制可能与下调TGFβ1表达、阻抑EMT有关。     

镉对大鼠肾小管上皮细胞E-cadherin影响

目的 探讨镉对体内肾小管上皮细胞E-cadherin依赖的黏附连接是否产生损伤作用。方法将大鼠分2组。实验组皮下注射含Cd 1．4mg／kg CdCl2溶液，每周3次，共4周。对照组在相应时间内皮下注射生理盐水。4周后，收集大鼠24螺样，切取肾皮质。测定尿碱性磷酸酶（LDH）活性、尿蛋白和肌酐含量、肾皮质谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量，观察肾脏形态学变化及E-cadherin蛋白表达。结果CA组大鼠尿LDH活性和尿蛋白含量与对照组比较均明显升高。肾皮质GSH含量显著升高，MDA含量变化不明显。Cd组大鼠近端小管上皮细胞排列散乱，刷状缘大面积脱落。有局灶性的空泡变性。与对照组比较，Cd组中E-cadherin在肾小管上皮细胞的基底侧表达明显减少。结论在肾脏处于较低水平的氧化损伤时镉就可干扰体内肾小管上皮细胞E-cadherin依赖的黏附连接。E-cadherin是镉肾毒性的相对较早的靶部位；E-cadherin依赖黏附连接的损伤可能是镉肾毒性的一个重要机制。     

TIEGsiRNA对AGEs介导肾小管上皮细胞PAI-1表达的影响

目的观察TIEG基因沉默对AGEs介导肾小管上皮细胞PAI-1表达的影响。方法以pshRNA-copGFP-lentivector作为载体,构建含有TIEG基因的慢病毒载体psiRNA-TIEG,转染至正常大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E),然后给予AGEs刺激24 h和48 h,采用Western blot方法测定PAI-1蛋白的表达水平。结果 AGEs以时间依赖方式上调NRK52E细胞TIEG mRNA和PAI-1蛋白表达。TGF-β1中和抗体可有效降低AGEs刺激NRK52E细胞48 h后PAI-1的表达水平(1.150±0.089vs0.707±0.015,P<0.05)。TIEGsiRNA转染后可显著下调AGEs刺激NRK52E细胞48 h后TIEG mRNA表达水平(0.852±0.019vs0.448±0.028,P<0.01),及PAI-1蛋白表达水平(0.396±0.042vs0.245±0.063,P<0.05)。结论 TIEG基因沉默能有效抑制AGEs诱导NRK52E细胞PAI-1的表达。     

镉对肾小管上皮细胞钙黏蛋白的影响

目的 探讨镉对原代培养的肾小管上皮细胞毒作用的早期环节。方法 采用筛网分离法分离Wistar大鼠肾小管上皮细胞;分别用10、20和50μmol/L的CdCl2溶液培养细胞0、1、2和4h,测定细胞活力、细胞内ALP活性、GSH含量、细胞外液LDH活性及上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin）表达。结果 不同浓度的CdCl2作用培养细胞后,可造成细胞内ALP活性下降,并表现出明显的剂量-反应关系和时间-反应关系;50μmol/L CdCl2作用细胞2h时,细胞外液LDH活性已明显高于对照组;4h时细胞内GSH含量与对照组比较显著下降;而10 μmol/L的CdCl2作用细胞2h,即可使肾小管上皮细胞钙黏蛋白在胞浆表达减少。结论 在肾小管上皮细胞没有发生氧化损伤时,Cd^2＋就可干扰肾小管上皮细胞钙黏蛋白依赖的黏附连接;镉对肾小管上皮细胞钙黏蛋白依赖的黏附连接的损伤可能是镉毒性的最早表现之一。     

桩蛋白在TGFβ1诱导入肾小管上皮-间充质转分化中的表达及意义

目的探讨不同浓度重组人转化生长因子β1（rhTGFβ1）诱导人近端肾小管上皮细胞（HKCs cells）发生小管上皮-间充质转分化（TEMT）过程中桩蛋白（Pax）的表达及金雀异黄素（Gen）干预来探讨Pax在此过程中的意义。方法将体外培养HKCs细胞随机分为3组：⑴对照（C）组：无血清培养基（FSM）培养;⑵TGFβ1培养（T）组：分别用含不同浓度的TGFβ1（T5组：5ng/ml,T10组：10ng/ml）的FSM培养;⑶T＋G组：TGFβ110ng/ml＋Gen50μmol/L共同培养。48h后用半定量逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）或免疫组化方法检测HKCs细胞E-cadherin、alpha-smooth muscle（α-SMA）和Pax的mRNA或蛋白表达;Western blot分析Pax蛋白表达变化。结果⑴C组：E-cadherin大量表达,αSMA表达阴性,Pax有基础的表达;⑵T组：E-cadherin表达减少,αSMA及Pax表达增加较C组差异均有统计学意义（P〈0.01）,且T10组较T5组差异有统计学意义（P〈0.01）。⑶T＋G组：E-cadherin表达减少及αSMA和Pax表达增加较T10组差异均有统计学意义（P〈0.01）,较C组差异有统计学意义（P〈0.01）。结论TGFβ1启动并介导HKCs细胞发生TEMT过程中能呈剂量依赖性诱导Pax表达增加;Pax参与TGFβ1诱导的TEMT部分是通过酪氨酸激酶（PTK）途径进行信号转导。     

马兜铃酸对人肾小管上皮细胞转分化和凋亡作用的体外实验研究

目的　探讨马兜铃酸 (AA)对人类肾小管上皮细胞 (HKC)转分化和凋亡的影响。方法将不同浓度的AA(5、10、2 0和 4 0mg/L)分别加入HKC细胞培养液中培养 4 8h ,应用下列方法观察HKC细胞转分化 :间接免疫荧光法检测HKC细胞角蛋白和波形蛋白的表达 ,免疫组化双染色技术测定HKC细胞E 钙黏连蛋白和α 平滑肌肌动蛋白 (α SMA)的表达 ,流式细胞技术测定HKC细胞表达α SMA阳性百分率 ;应用Giemsa染色、TUNEL反应和琼脂糖凝胶电泳观察HKC细胞凋亡 ,流式细胞技术测定HKC细胞凋亡的百分率。结果　 10mg/L的AA作用于HKC细胞 4 8h后角蛋白、E 钙黏连蛋白表达减弱 ,波形蛋白表达增强 ,HKC细胞表达α SMA阳性率 (14 .17± 0 .6 1) %比无血清对照组的 (3.5 7± 0 .5 2 ) %显著增高。 4 0mg/L的AA作用HKC细胞 4 8h后细胞凋亡 (5 3.4 % )比无血清对照组 (2 % )显著增高。 5和 2 0mg/L的AA未能引起HKC明显凋亡或转分化。结论　较低浓度 (10mg/L)的AA对HKC细胞有轻度的促转分化作用 ,较高浓度 (4 0mg/L)的AA作用 4 8h后引起多数HKC细胞凋亡 ,AA的上述作用可能与马兜铃酸肾病的发病机制有关。     

吡格列酮对小鼠肾小管上皮细胞炎症性刺激的保护作用

目的观察吡格列酮对小鼠肾脏内髓集合管上皮细胞（IMCD）炎性刺激是否具有保护作用。方法培养成片的IM-CD细胞随机分为6组：空白对照组,PIO对照组,GW9662对照组,TNFα刺激组,PIO＋TNFα组,GW9662＋PIO＋TNFα组。MTT方法观察TNFα刺激下细胞增殖情况,ELISA方法检测细胞培养上清液中MCP-1和TGF-β1含量。结果TNFα50ng/ml刺激使IM-CD细胞增殖抑制（P〈0.05）,细胞培养上清液中MCP-1和TGF-β1含量明显增加（P〈0.05）。Pio能阻断TNFα刺激所致的IM-CD细胞增生抑制,减少细胞分泌MCP-1和TGF-β1。而上述保护性作用可被PPARγ特异性拮抗剂GW9662所阻断。结论Pio能保护IMCD细胞免受TNFα刺激所致的损伤,其保护性作用可能通过PPARγ途径发挥效应。     

不同剂量γ射线对肾小管上皮细胞增殖与功能的影响

目的研究受不同剂量γ射线照射后,原代培养肾小管上皮细胞增殖和功能的改变情况。方法机械过滤加酶消化法分离培养肾小管上皮细胞,以01、、51、0 Gyγ射线照射细胞,MTT法测定细胞的增殖,RT-PCR法分析基因mRNA表达,Western Blot法检测相关蛋白的表达。结果肾小管上皮细胞受1 Gyγ射线照射后对数生长期延迟,受5 Gy1、0 Gyγ射线照射后不出现对数生长期。受1 Gy、5 Gy1、0 Gyγ射线照射的肾小管上皮细胞Na ,K -ATP酶、1α羟化酶、24羟化酶mRNA表达明显降低,TGF-βmRNA和蛋白质表达明显升高。受1Gy射线照射后OPN蛋白量提高,而受5 Gy、10 Gy照射后OPN蛋白量降低。结论不同剂量γ射线可明显抑制肾小管上皮细胞的增殖,促使肾小管上皮细胞向成纤维细胞转化,并通过增加TGF-β的分泌促进纤维蛋白等基质蛋白在细胞外的堆积,这种作用存在明显的剂量依赖关系。     

Ox-LDL通过LOX-1促进NRK52E细胞摄取脂质的实验研究

目的 探讨血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）在氧化低密度脂蛋白（oxLDL）刺激肾小管上皮细胞摄取脂质中的作用.方法 体外培养NRK52E,加入不同浓度（0,25,50,100μg/ml）的ox-LDL及预先与LOX-1阻滞剂多聚肌苷酸（polyinosonic acid,poly I）和爱兰苔胶（carrageenan）作用2 h,再加入50μg/ml的ox-LDL,24 h后用Realtime-PCR测定LOX-1 mRNA的表达水平,Western blot测定LOX-1蛋白表达,用油红O法测定细胞内脂质聚集情况.结果 在25～100μ/ml范围内随着ox-LDL浓度的增加,LOX-1 mRNA和蛋白的表达增加,分别为0 μg/ml的2.13、10.14、20.81倍和2.53、12.18、21.45倍,各组间比较差异均有统计学意义（P〈0.05）;而随着LOX-1 mRNA和蛋白的表达增加细胞内脂质聚集也增加,分别为0μg/ml的3.2,6.4和12.5倍（P〈0.05）;polyI或carrageenan使50μg/ml的ox-LDL诱导的LOX-1 mRNA和蛋白的表达分别下降（48%,47%）和（72%,65%）,同时细胞内脂质聚集减少41%和49%,LOX-1与细胞内脂质呈正相关（r=0.97,P〈0.05）.结论 ox-LDL诱导NRK52E细胞表达LOX-1,又通过LOX-1促进脂质在细胞内聚集从而损伤细胞,这种诱导作用可被LOX-1的阻断剂部分阻断.     

辛伐他汀下调OX—LDL诱导的NRK52E细胞LOX-1表达和ROS生成

目的 探讨辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的NRK52E细胞血凝素样氧化低密度脂蛋白受体（lectin-like ox-LDL receptor,LOX-1）表达和活性氧生成的作用.方法 体外培养NRK-52E,同步化后分为三组：（1）空白对照组（NRK52E细胞＋0μg/ml ox-LDL）;（2） ox-LDL组（NRK52E细胞＋50 μg/ml ox-LDL）;（3）辛伐他汀组（NRK52E细胞＋10μmol/L辛伐他汀＋50 μg/mlox-LDL）,用Western blot测定LOX-1蛋白表达,激光共聚焦检测ROS的表达.结果 （1）正常NRK52E细胞表达LOX-1非常低,50 μg/ml ox-LDL明显刺激NRK52E细胞表达LOX-1增加6.80倍,加用10 μmol/L辛伐他汀后,ox-LDL刺激的NRK52E细胞LOX-1表达降低65％;（2）正常NRK52E细胞内ROS生成很少,50 μg/ml ox-LDL可明显刺激NRK52E细胞内ROS生成增多了4.86倍,加用10μmol/L辛伐他汀后,ox-LDL刺激的NRK52E细胞ROS生成减少60％.结论 辛伐他汀可下调ox-LDL诱导的NRK52E细胞LOX-1表达和ROS生成,从而保护肾脏.     

人肾系膜细胞Smad-7稳定表达细胞系的筛选及其拮抗TGF-β1作用

目的构建Smad-7基因真核表达载体并筛选获得其稳定表达细胞系，观察Smad-7拮抗TGF-β1对人肾系膜细胞（HMC）的影响。方法用PCR方法从胎肝cDNA文库扩增Smad-7编码序列，将其构入真核表达载体pcDNA3．1／myc-his-B（-），酶切及测序鉴定重组质粒。重组质粒转染HMC细胞，G418筛选获得Smad-7的稳定表达细胞克隆，运用Western Blotting验证目的基因表达。运用MTT和流式细胞术检测稳定表达Smad-7对TGF-β1诱导的拮抗作用。结果酶切和测序证实目的基因被克隆入表达载体，Western Blotting证实目的基因成功表达，获得稳定表达Smad-7的细胞克隆；Smad-7过表达可明显缓解TGF-β1对HMC细胞的生长抑制、细胞周期G1阻滞作用，并可降低TGF-β1对HMC细胞的凋亡诱导作用。结论成功构建Smad-7真核表达载体并获得其稳定表达细胞克隆，过表达Smad-7可拮抗TGF-β1对HMC细胞的影响。     

白血病骨髓基质细胞黏附对Jurkat细胞周期及调控的影响

目的观察白血病骨髓基质细胞-Jurkat细胞共培养模型中Jurkat细胞的化疗敏感性,探讨基质细胞黏附对Jurkat细胞周期及其调控蛋白表达的影响。方法常规分离、培养骨髓基质细胞,Jurkat细胞与^60Co照射的基质细胞层黏附培养,构建基质细胞-Jurkat细胞共培养模型,扫描电镜观察,通过MTT法测定Jurkat细胞DNR的IC50,流式细胞仪检测Jurkat细胞周期分布,Westernblot检测黏附培养4、24和48h Jurkat细胞周期调控蛋白cyclin A、cyclin E及p27的表达。结果悬浮培养Jurkat细胞的IC50为0．45μmol／L,而白血病基质细胞及正常基质细胞黏附组IC50分别为2．30μmol／L和1．78μmol／L。Jurkat细胞与基质细胞黏附培养24h,Go—G1期细胞的比例明显升高（48．74％±8．77％）,与悬浮对照组（27．83％±1．86％）比较差异有统计学意义P〈0．01,G2-M期细胞比例明显降低为2．01％±1．17％,与悬浮对照组（20．33％±1．84％）比较差异有统计学意义P〈0．01;Western Blot检测发现cyclin A、cyclin E的表达在Jurkat细胞黏附培养4h时即有所下调,24h和48h尤为明显,而p27的表达则出现上调,以48h最为明显。结论白血病基质细胞黏附能介导白血病细胞耐药,其机制可能与白血病细胞周期改变有关。     

广东阳江高本底辐射地区居民适应性反应机制研究

目的 通过检测广东阳江天然高本底辐射地区(high background radiation area,HBRA)和对照低辐射地区(control area,CA)居民晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)和钙结合蛋白S100A6 mRNA及蛋白的表达,研究HBRA居民适应性反应机制.方法 以HBRA及CA居民为研究对象,分别选取50～60岁健康无遗传疾病家族史的男性长住居民各53名,收集血液及痰液样品,逆转录PCR(RT-PCR)检测血细胞中RAGE和S100A6 mRNA的表达,Western Blotting方法 分析痰细胞中RAGE和S100A6蛋白的表达.热释光剂量计(thermo luminescent dosemeter,TLD)检测居民暴露水平的外照射剂量及评估年有效剂量.结果 CA和HBRA组的平均年有效剂量分别为1.95 mSv和6.24 mSv,HBRA组的剂量约为CA组的3倍.与CA组相比,HBRA组居民RAGE与S100A6 mRNA与蛋白的表达量均有明显下降:以β-肌动蛋白(β-actin)为内参,血细胞mRNA中,RAGE和S100A6在CA组的相对中位表达量分别为0.28和1.06;而在HBRA组中分别为0.16和0.79,以Wilcoxon秩和检验分析,两者差异有统计学意义(Z值分别为-2.587和-2.328,P<0.05).痰细胞总蛋白中,以β-actin为内参,RAGE和S100A6在CA组的相对中位表达量分别为2.98和2.25;而在HBRA组中分别为0.53和0.47,以Wilcoxon秩和检验分析,两者差异有统计学意义(Z值分别为-2.201和-2.366,P<0.05).结论 长期接受天然高本底辐射的人群中RAGE及S100A6的表达量降低,可能与HBRA居民的适应性反应及低癌症死亡率有关.     

妊娠高血压综合征中可溶性细胞粘附分子水平的变化

目的 探讨可溶性细胞粘附分子(sCAM)在妊娠高血压综合征(PIH,简称妊高征)发病中的作用及与其病情严重程度之间的关系.方法 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测66例妊高征患者(轻度20例,中度24例,重度22例)和24例正常晚期孕妇(对照组)的产前和产后1周血清可溶性血管细胞粘附分子-1(sVCAM-1)、细胞间粘附分子-1(sICAM-1)以及血浆E选择素(sE-selectin)及P选择素(sP-selectin)的表达水平,并进行各组统计学分析.结果 妊高征患者产前的sCAM 水平均显著高于正常对照组,差异有显著性(P＜0.01及P＜0.05);轻度患者sVCAM-1、sE-selectin水平与对照组比较差异有显著性(P＜0.05),中度患者sVCAM-1、sICAM-1、sE-selectin及sP-selectin水平与轻度患者比较,差异有显著性(P＜0.01及P＜0.05),重度患者sVCAM-1、sICAM-1、sE-selectins及sP-selectin水平与中度患者比较,差异有显著性(P＜0.01及P＜0.05),相关分析显示,sE-selectin及sP-selectin与sVCAM-1及sICAM-1显著正相关(r分别为0.542、0.498、0.503、0.487,P均＜0.05).产后各组sCAM表达水平与产前相比大幅度下降(P＜0.01及0.05).结论 血管内皮细胞损伤是妊高征的重要发病机理,sVCAM-1、sICAM-1、sE-selectin及sP-selectin的表达水平升高与妊高征的发生发展有关.