8型重组腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因在角膜基质细胞中的表达及影响

目的:评价8型重组腺相关病毒(rAAV8)介导增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)转染角膜基质细胞后的表达及对细胞增殖的影响。方法:以不同MOI的rAAV8-EGFP转染大鼠角膜基质细胞,转染后以倒置荧光显微镜观察角膜基质细胞中GFP的表达,流式细胞仪分析角膜基质细胞中rAAV8-EGFP表达的阳性率。MTT法分别检测rAAV8和rAAV8-EGFP转染对角膜基质细胞增殖的影响。结果:倒置荧光显微镜观察rAAV8-EGFP转染角膜基质细胞后GFP的阳性表达7d达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV8-EGFP对角膜基质细胞的转染效率分别为31.5%(MOI=5×103),42.5%(MOI=5×104),54.8%(MOI=5×105);MTT检测结果显示rAAV8及rAAV8-EGFP转染对角膜基质细胞增殖均无明显影响。结论:rAAV8-EGFP能有效地转染角膜基质细胞,并且对细胞增殖无明显影响。     

腺相关病毒介导的增强型绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究

目的比较四种不同血清型腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞(guinea pig scleral fibroblast,GSF)的转染效率及安全性,筛选合适的基因转染载体。方法原代分离培养GSF并鉴定,利用AAV2、AAV5、AAV8、AAV9介导EGFP基因并按不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)10、100、1000、10 000转染GSF,空白对照组加入空白培养基,转染后2 d、3 d、4 d、5 d荧光显微镜下观察GFP表达强度及细胞生长状态,流式细胞术检测细胞转染率及凋亡率,CCK-8法检测细胞活力。结果 AAV感染GSF后2 d各组均可见弱荧光,荧光强度随时间延长及MOI值增大而增强,而AAV9-EGFP组全程弱荧光,空白对照组全程无荧光。转染后5 d,MOI=10 000时各组荧光最强,基因转染率组间整体比较,差异具有统计学意义(P<0.05);组间两两比较,AAV8-EG...     

腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养IPE细胞的转染和表达

目的 研究重组腺相关病毒（rAAV)载体介导的绿色荧光蛋白基因（GFP）对体外培养虹膜色素上皮（IPE）细胞的转染和表达，为rAAV携带目的基因治疗视网膜色素变性提供理论依据。方法 酶辅助的显微分离方法体外培养IPE细胞并鉴定。按转染倍数（MOI）为10^3,10^4,10^5,10^6转录已培养3d的传二代IPE细胞，转染后的第1、3、5、7、9d，在倒置荧光显微镜下观察IPE中GFP表达阳性的情况，记录100个IPE细胞中GFP阳性所占的百分比。当GFP表达稳定后，共聚焦显微镜照相，流式细胞仪检测rAAV-GFP对IPE的转染效率，结果 rAAV-GFP在细胞中的表达呈绿色，弥漫于整个胞浆。MOI=10^3时，转染后48h,GFP开始表达，MOI=10^4,10^5,10^6时，转染后24h时便可看到GFP表达阳性的细胞，细胞的起始表达强度不一，随MOI值的增高而增强，同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强，转染后第7-9d达到高峰并维持，此时检测rAAV-GFP对IPE的转染效率，MOI=10^3时是26.7%,MOI=10^4时是53.6%,MOI=10^5时是60.2%,MOI=10^6时是63.7%。结论 rAAV-GFP对体外培养的IPE细胞转染效率可达60%以上，将腺相关病毒载体介导的基因治疗和IPE移植结合起来治疗视网膜色素变性是可行的。     

腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养IPE细胞的转染及毒性

目的 研究腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体介导的绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein，GFP)对体外培养虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelial，IPE)的转染和病毒载体对IPE细胞的毒性，为rAAV携带目的基因治疗视网膜色素变性提供理论依据。方法酶辅助的显微分离方法体外培养IPE细胞并鉴定。按转染倍数(multiple of infection,MOI)为10^3,10^4,10^5,10^6转染已培养3d的传二代IPE细胞，流式细胞仪检测rAAV—GFP对IPE的转染效率。MTT法检测rAAV—GFP对IPE细胞的毒性。结果 rAAV-GFP对IPE的转染效率，MOI=10^3时为26．7％、MOI=10^4时为53．6％、MOI=10^5时为60．2％、MOI=10^6时是63．7％。AAV—GFP转染IPE细胞后，细胞生长正常。MTT法显示各转染组与未转染组的OD值无统计学差异。结论 rAAV—GFP对体外培养的IPE细胞转染效率可达60％以上，而且腺相关病毒对细胞生长无明显抑制，腺相关病毒作为视网膜色素变性基因治疗的载体是安全可行的。     

重组增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒转染兔晶状体上皮细胞的研究

目的研究2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)对体外培养兔晶状体上皮细胞(N/N1003A)的转染和病毒载体对晶状体上皮细胞增生的影响,探讨rAAV2作为后囊膜混浊基因治疗载体的可行性。方法rAAV2-EGFP按感染复数(mul-tiplicity of infection,MOI)为104、105、2×105、106转染N/N1003A细胞,倒置荧光显微镜下观察晶状体上皮细胞中EGFP的表达,流式细胞仪检测rAAV2-EGFP对N/N1003A细胞的转染效率,MTT比色法测定rAAV2载体对N/N1003A增生的影响。结果EGFP在细胞中的表达呈绿色,弥漫于整个胞浆。rAAV2-EGFP的转染效率随着MOI的增加和时间的延长而增加,MOI=106时,转染后第7d达到71.12%.MTT法显示各转染组与未转染组A值无统计学差异。结论重组腺相关病毒载体可以介导EGFP基因高效稳定转染晶状体上皮细胞,并且对细胞增生无抑制作用,腺相关病毒作为后囊膜混浊基因治疗载体是可行的。     

腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在晶状体上皮细胞中的表达

目的研究Ⅱ型重组腺相关病毒(recombinantadeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导的增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)对体外培养兔晶状体上皮细胞的转染和表达情况,为rAAV携带目的基因防治后囊膜混浊提供理论依据。方法组织块培养法体外培养兔晶状体上皮细胞。rAAV2-EGFP按感染复数(multiplic-ity of infection,MOI)为103、104、105、4×105、106转染传2代细胞,转染后第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天在倒置荧光显微镜下观察晶状体上皮细胞中EGFP表达的阳性情况,记录200个细胞中EGFP阳性表达所占的百分比。当EGFP表达稳定后用激光共聚焦显微镜照相。用倒置显微镜观察rAAV转染对细胞生长和形态的影响。结果当MOI=103、104时,转染后第72小时晶状体上皮细胞中EGFP开始表达,当MOI=105、4×105、106时,转染后第24小时便可见EGFP阳性表达。随着MOI值的增大及时间的延长,EGFP表达效率逐渐增高,转染后第8~第9天达到高峰并维持,此时,MOI=103、104、105、4×105、106的转导效率分别为16%、41%、55%、86%、94%。对照组和转染组细胞的生长和形态特征无明显改变。结论腺相关病毒载体可以携带报告基因稳定转染晶状体上皮细胞,并且转染效率高,因而腺相关病毒携带目的基因防治后囊膜混浊是可行的。     

腺伴随病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养的鼠视网膜神经节细胞转染的实验研究

目的评价重组腺伴随病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因(recombinant adeno-associated virus-mediated green fluorescence protein,rAAV-GFP)对体外培养的鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells ,RGCs)的转染效率和安全性。方法取出生24 h内的SD乳鼠的视网膜神经上皮层,行视网膜神经细胞的体外混合培养;培养2 d后,按转染倍数(multiple oninfection,MOI)为10、102、103、104、105对细胞进行转染;5 d后行流式细胞仪检测细胞表达绿荧光的比率,并应用PE-Thy1 .1抗体标记RGCs ,评价不同MOI的rAAV-GFP对RGCs的转染效率。应用MTT比色方法检测各组细胞的生长活性。结果MOI为10、102、103、104、105时,对混合培养的全体细胞的转染效率分别为6·4 %、15.6 %、20.2 %、45.1 %和65.8 %,其中对RGCs的转染效率分别为11.7 %、22.5 %、27.7 %、52.0 %和75.3 %;rAAV-GFP转染RGCs后,细胞生长状态正常;MTT比色结果显示,各转染细胞和未转染细胞的光吸收值无显著性差异(P>0 .05)。结论 rAAV作为体外培养的SD乳鼠RGCs转染的载体是安全可行的,且对细胞生长无明显影响。     

腺伴随病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养的鼠视网膜神经节细转染的实验研究

目的 评价重组腺伴随病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因(recombinant adenoassociated virus-mediated green fluorescence protein,rAAV-GFP)对体外培养的鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGCs)的转染效率和安全性.方法 取出生24 h内的SD乳鼠的视网膜神经上皮层,行视网膜神经细胞的体外混合培养;培养2 d后,按转染倍数(multiple on infection,MOI)为10、102、103、104、105对细胞进行转染;5 d后行流式细胞仪检测细胞表达绿荧光的比率,并应用PE-Thy1.1抗体标记RGCs,评价不同MOI的rAAV-GFP对RGCs的转染效率.应用MTT比色方法检测各组细胞的生长活性.结果 MOI为10、102、103、104、105时,对混合培养的全体细胞的转染效率分别为6.4%、15.6%、20.2%、45.1%和65.8%,其中对RGCs的转染效率分别为11.7%、22.5%、27.7%、52.0%和75.3%;rAAV-GFP转染RGCs后,细胞生长状态正常;MTT比色结果显示,各转染细胞和未转染细胞的光吸收值无显著性差异(P＞0.05).结论 rAAV作为体外培养的SD乳鼠RGCs转染的载体是安全可行的,且对细胞生长无明显影响.     

脂质体介导Bcl-xL基因体外转染人角膜基质细胞的动态表达

目的:观察脂质体LipofectamineTM(LF)2000介导Bcl-xL基因在人角膜基质细胞中表达的时间规律。方法:Bcl-xL/LF2000载体复合物转染人角膜基质细胞,转染后1～15d,采用定量RT-PCR及流式细胞计数法检测目的基因Bcl-xL表达阳性细胞率,观察目的基因在角膜基质细胞中表达的时间变化规律。结果:RT-PCR及流式细胞计数法均显示:在转染后1d开始检测到Bcl-xL表达阳性细胞,阳性率在转染后3d最高(48.3%),此后逐渐降低,转染后15d有少量细胞仍表达Bcl-xL基因。结论:LF2000能有效介导外源基因Bcl-xL转染人角膜基质细胞。     

慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究

目的 观察慢病毒载体转染豚鼠巩膜成纤维细胞的有效性及对细胞活性的影响.方法 转染组用慢病毒携带绿色荧光蛋白(lentiviral mediated green fluorescent protein,Lenti-GFP)转染豚鼠巩膜成纤维细胞,对照组加入空白培养液,转染组按最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50、100、200、400加入Lenti-GFP,转染2d、3d、4d、5d、6d和7d后,在倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测病毒对细胞增殖的影响.结果 Lenti-GFP转染细胞后48 h可以看见绿色荧光;在同一MOI值下,随时间延长转染效率增高,第5天达到高峰;在MOI为400,转染5d时转染效率达82.86％;转染5d行MTT检测显示:MOI为50 ～400时,同一转染时间各组IOD值与对照组比较,差异均无统计学意义(均为P＞0.05).结论 慢病毒载体可以在体外稳定而有效地转染豚鼠巩膜成纤维细胞,且不影响细胞活性,是巩膜成纤维细胞理想的基因转染载体.     

A feasibility study of recombinant adeno-associated virus as a vector for transferring a target gene to retina

AIM: To study the feasibility of recombinant adeno-associated virus (rAAV) as a vector to transfer the green fluorescent protein (GFP) gene as a target gene into rabbit retina. METHODS: Intravitreal injection of rAAV-gfp was performed in either eye for each rabbit with the other eye taken as control. At the 3rd, 7th, and 14th day after injection, the eyeballs were removed, and the retinas were flat-mounted on glass slides to inspect the retinal fluorescence, respectively. RESULTS: After intravitreal injection of rAAV-gfp, the presence of fluorescent spots in the cytoplasm of retinal cells indicated that GFP gene was efficiently transferred and expressed in the rabbit retina. CONCLUSION: Recombinant adeno-associated virus is a reliable and simple vector for transferring target gene, e.g., GFP gene, to the retina.     

AAV载体介导的视网膜基因转移实验研究

目的以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为标记基因,观察腺相关病毒(AAV)载体介导视网膜基因转移作用,为视网膜疾病的基因治疗打下基础.方法制备重组腺相关病毒rAAV-gfp;将纯化的rAAV-gfp病毒10μL(10×10     

绿色荧光蛋白在大鼠角膜移植术后植片中的表达

目的研究穿透角膜移植术（PKP）后重组腺相关病毒（rAAV）载体介导的绿色荧光蛋白（GFP）在大鼠植片中的转染及表达情况。方法建立32只大鼠穿透角膜移植的动物模型,SD大鼠作为受体,Wistar大鼠作为供体,供体植片置于含1010μg/mL（病毒基因组数/mL）rAAV-GFP的DMEM/F121：1混合培养液中培养30min。按照不同的观察时间点用抽签法将角膜移植术后的大鼠随机分成4组,每组8只。手术后隔日在裂隙灯显微镜下观察角膜植片的存活情况。于角膜移植术后1、2、4、12周取各组眼球在共焦显微镜下观察角膜组织中GFP的表达情况,Infinity-capt软件测量角膜植片内皮层中荧光的表达强度。结果各组中选取的受体角膜植片无水肿、混浊、新生血管及其他并发症发生。GFP基因表达阳性的角膜内皮细胞呈绿色荧光。各组角膜内皮细胞绿色荧光强度与背景亮度比值,A组：91.83±10.83;B组：128.67±4.32;C组：117.33±3.01;D组：118.50±3.02,转染后1周即有明显表达,4周及12周组较1周组强（P〈0.01）,2周组强度最高（P〈0.01）。结论通过共培养的方法,rAAV-GFP能够有效地转染到角膜内皮细胞中。PKP后GFP基因能够持续、高效、稳定地在移植片的角膜内皮细胞中表达。