TIMP-1特异性小干扰RNA真核表达载体转染肝星状细胞效率的检测

目的 提高TIMP-1小干扰RNA真核表达载体pGCsi-U6/TIMP-1 shRNA在大鼠肝星状细胞HSC-T6中的转染效率.方法 构建携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的小干扰RNA真核表达载体pGCsi-U6/TIMP-1 shRNA,采用阳离子脂质体介导法将pGCsi-U6/TIMP-1 shRNA质粒转染入HSC-T6细胞,实验根据质粒DNA和阳离子脂质体LipofectamineTM 2000的不同比例分为5组:2 μg/0μL、2 μg/4 μL、2 μg/6 μL、2 μg/8 μL、2 μg/10 μL,同时设空白对照组.转染48 h后,应用激光共聚焦显微镜观察各组转染情况,同时用流式细胞仪计算转染效率.结果 激光共聚焦显微镜观察和流式细胞仪检测均说明质粒与脂质体比例为2 μg/8 μL组转染效率显著高于其余各比例组,差异具有统计学意义.转染效率与脂质体和质粒的比例有关.结论 按照合适的质粒和脂质体比例,质粒pGCsi-U6/TIMP-1 shRNA转染HSC-T6可达较高转染效率,是转染HSC-T6较为理想的瞬时表达载体.     

胞内氯离子通道蛋白1基因沉默对小鼠肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响

目的 合成和筛选有效抑制细胞内氯离子通道蛋白1 (CLICl) 基因的shRNA序列,构建表达质粒,并进一步研究CLIC1基因的表达被抑制后小鼠肝癌细胞株Hca-F细胞增殖及侵袭能力的变化.方法 设计并合成3条理论上最佳的siRNA序列,进而将相应的双链DNA插入pGPU6/GFP/Neo质粒中,以脂质体Lipofectamine 2000将DNA质粒稳定转染至小鼠Hca-F细胞中,收取细胞进行逆转录多聚酶链反应分析各组的CLIC1 mRNA表达水平,选出最佳干扰序列.应用细胞计数试剂盒检测最佳干扰序列表达质粒稳定转染的Hca-F细胞,对比观察其干扰前后增殖情况的变化;应用transwell小室检测其侵袭能力的变化.对研究数据应用统计学软件SPSS13.0进行方差分析.结果 靶向CLIC1 mRNA的3个shRNA重组质粒载体经测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致.经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.稳定转染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-3表达质粒的Hca-F细胞对其CLIC 1 mRNA抑制效果明显,抑制率达42.4%.经该表达质粒的干扰后,Hca-F细胞的增殖能力明显增强,侵袭能力显著下降,空白对照组、无关序列处理组、shRNA干扰组的穿膜细胞个数分别为98.93±5.00、96.27±2.60、50.73±3.89,P值均<0.01.结论 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-3表达质粒能高效地抑制小鼠Hca-F细胞中CLIC1 mRNA的表达,CLIC1基因具有抑制小鼠肝癌细胞的增殖和促进其侵袭的作用.     

Rac1shRNA对卵巢癌细胞株Skov3细胞周期及凋亡的影响

目的 为Rac1 shRNA应用于卵巢癌治疗提供实验依据.方法 将筛选的有效的Rac1 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-524以LipofectimineTM2000介导转染卵巢癌细胞株Skov3,48 h后收集细胞,RT-PCR检测转染细胞cyclin D1 mRNA的表达;将转染细胞标记AnnexinⅤ,流式细胞术检测分析转染细胞的凋亡情况.结果 转染Rac1 shRNA pGPU6/GFP/Rac1-524的卵巢癌细胞株Skov3的cyclin D1 mRNA表达量下降;Annexin Ⅴ阳性细胞数(54%)明显高于未转染组(5.6%);Annexin Ⅴ和PI双阳性的细胞数(32.3%)也明显高于未转染组(3.2%).结论 Rac1 shRNA pGPU6/GFP/Rac1-524可以下调cyclin D1的表达,并促使Skov3细胞凋亡.     

CXCR4基因shRNA表达质粒的构建及筛选鉴定

目的 构建编码CXCR4mRNA的短发卡样RNA(shRNA)表达质粒用以筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 根据GenBank中登录的CXCR4基因的核苷酸序列,应用shRNA设计软件设计并合成4条短发卡shRNA的oligo DNA,构建shRNA重组质粒.采用酶切电泳和测序方法进行鉴定.将鉴定后的CXCR4基因shRNA重组质粒经脂质体介导转染胶质瘤U251细胞,24 h后经RT-PCR筛选有效的shRNA重组质粒.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出目的条带,DNA测序结果与理论序列完全一致.RT-PCR检测显示,转染pG-PU6/GFP/Rac 1-421的U251细胞CXCR4基因mRNA的转录水平下降.结论 成功构建CXCR4基因shRNA表达质粒,并筛选出效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pGPU6/GFP/Rac1-421.     

Rac1 shRNA对卵巢癌细胞株Skov3生物学行为的影响

目的为Rac1 shRNA治疗卵巢癌提供实验依据。方法 Rac1 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-524以L ipofectim ineTM2000介导转染卵巢癌细胞株Skov3,Transwell肿瘤细胞迁移和侵袭实验检测转染细胞的迁移和侵袭能力,W estern印迹分析转染细胞MMP2蛋白的表达情况。结果转染Rac1 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-524组、转染非特异shRNA载体pGPU6/GFP/NC组和未转染组迁移到滤膜底面的细胞数分别为97±21、319±75、365±92,而侵袭到滤膜底面的细胞数分别为79±22、285±63、324±84,转染Rac1 shRNA载体组与转染pGPU6/GFP/NC组、未转染组比较差异显著(P<0.05),转染pGPU6/GFP/NC组与未转染组相比无统计学意义(P>0.05)。转染Rac1 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-524组MMP2蛋白的表达量下降。结论 Rac1 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-524可有效抑制卵巢癌细胞Skov3的迁移和侵袭,该抑制作用可能是通过调控MMP2的表达而实现的。     

STAT3靶向短发夹RNA干扰重组载体对结肠癌SW480细胞的沉默作用

目的 探讨STAT3基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对结肠癌SW480细胞STAT3基因的干扰作用.方法 根据siRNA设计原则,构建靶向STAT3基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/STAT3),使用脂质体法转染人结肠癌细胞系(SW480),通过RT-PCR和 Western 印迹检测结肠癌SW480细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平.结果 pGPU6/GFP/STAT3重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确.质粒成功转染SW480细胞后,该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05).结论 成功构建靶向STAT3基因的shRNA表达载体,转染SW480细胞,能有效抑制细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达,为STAT3基因靶向治疗提供前期的实验依据.     

SAA在鼻咽癌CNE-2细胞中的表达及其对细胞生长、凋亡的影响

目的 观察血清淀粉样蛋白A(SAA)在鼻咽癌CNE-2细胞中的表达及其对细胞生长、凋亡的影响.方法 构建针对SAA基因的shRNA表达干扰载体,筛选出有效的小干扰RNA(siRNA)序列,利用siRNA技术和高表达载体分别沉默及过表达SAA,检测SAA表达对鼻咽癌CNE-2细胞的生长及凋亡的影响.结果 pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482和pCD3.1(+)-SAA在鼻咽癌CNE-2细胞中可有效地沉默及过表达SAA基因的mRNA和蛋白,且与对照组比较差异具有统计学意义(P均＜0.05);SAA增高可促进鼻咽癌CNE-2细胞生长,降低可促进鼻咽癌CNE-2细胞凋亡.结论 在SAA基因的shRNA表达干扰载体中,只有pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482可有效沉默SAA在鼻咽癌CNE-2细胞中的表达;SAA增高可促进鼻咽癌CNE-2细胞生长,SAA沉默可促进鼻咽癌CNE-2细胞凋亡.     

pGPU6/GFP质粒介导的表达钙网织蛋白基因的短发夹RNA的构建和鉴定

目的构建靶向钙网织蛋白(CRT)基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒并鉴定。方法设计并合成4对针对CRT基因的shRNA链,退火形成双链,与酶切的质粒pGPU6/GFP连接,构建4个重质粒,转化DH5а菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。脂质体法转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过荧光倒置显微镜判定转染效率,并通过Western印迹法检测细胞中CRT基因及蛋白的表达水平。结果经酶切鉴定筛出的重组质粒测序结果与目的序列相同,重组质粒pGPU6/GFP/Neo-CRT构建成功;转染MDA-MB-231细胞后,CRT基因在mRNA及蛋白水平的表达均降低,其中pGPU6/GFP/CRT1的抑制效果最好。结论成功构建了靶向CRT基因的shRNA表达质粒,并筛选出1种对CRT基因有显著抑制作用的shRNA。     

小鼠TRAF6基因shRNA真核表达载体的构建与表达

目的:构建并筛选肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)短发夹RNA(shRNA)表达质粒.方法:针对小鼠TRAF6 mRNA设计4条理论上最佳的siRNA序列,经退火成互补双链,将相应双链DNA插入pGCsi-U6/GFP/Hygro质粒中,构建重组表达质粒pGCsi-TRAF6 -shRNA1,2,3,4,并以不同比例DNA质粒/脂质体转染重组质粒(1∶2、2∶5、1∶3和1∶4)至RAW 264.7细胞中,观察转染效果.结果:靶向TRAF6 mRNA的4个shRNA重组质粒载体pGCsi-TRAF6 shRNA1,2,3,4,经测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,证实载体构建成功.应用荧光显微镜分析转染效率显示,DNA(g)/脂质体转染重组质粒(L)按1∶2、2∶5、1∶3和1∶4比例转染细胞的效率分别为13.7%±1.2%、24.5%±2.1%、19.3%±1.7%、16.3%±2.8%,以2∶5为最佳比例.只加了脂质体未加质粒(试剂对照)的细胞无荧光表达.结论:TRAF6靶向RNA干扰重组表达质粒构建成功,为进一步研究阻断TRAF6表达对急性肝衰竭过度炎症反应的基因治疗奠定基础.     

Racl shRNA对卵巢癌细胞株Skov3生物学行为的影响

目的 为Racl shRNA治疗卵巢癌提供实验依据.方法 Racl shRNA载体pGPU6/GFP/Racl-524以LipofectimineTM2000介导转染卵巢癌细胞株Skov3,Transwell肿瘤细胞迁移和侵袭实验检测转染细胞的迁移和侵袭能力,Western印迹分析转染细胞MMP2蛋白的表达情况.结果 转染Racl shRNA载体pGPU6/GFP/Racl-524组、转染非特异shRNA载体pGPU6/GFP/NC组和未转染组迁移到滤膜底面的细胞数分别为97±21、319±75、365±92.而侵袭到滤膜底面的细胞数分别为79±22、285±63、324±84,转染Racl shRNA载体组与转染pGPU6/GFP/NC组、未转染组比较差异显著(P<0.05),转染pGPU6/GFP/NC组与未转染组相比无统计学意义(P>0.05).转染Racl shRNA载体pGPU6/GFP/Racl-524组MMP2蛋白的表达量下降.结论 Racl shRNA载体pGPU6/GFP/Racl-524可有效抑制卵巢癌细胞Skov3的迁移和侵袭,该抑制作用可能是通过调控MMP2的表达而实现的.     

Genetic evidence that mutations in the COL1A1, COL1A2, COL3A1, or COL5A2 collagen genes are not responsible for mitral valve prolapse

DNA markers were used to assess the segregation of genes encoding the collagen types that predominate in the mitral valve (types I, III, and V) in two family pedigrees that are phenotypically different but showed dominantly inherited mitral valve prolapse. The inheritance of these markers was compared with the segregation of the phenotype for mitral valve prolapse in both families. In one family it was shown that the COL1A1, COL1A2, COL3A1, and COL5A2 genes segregated independently of the phenotype; in the other family the results for COL1A1, COL1A2, and COL5A2 were similar but analysis at the COL3A1 locus was not possible. These data indicate that in these families mitral valve prolapse does not arise from a defect in one of these collagen genes.     

Genetic evidence that mutations in the COL1A1, COL1A2, COL3A1, or COL5A2 collagen genes are not responsible for mitral valve prolapse.

DNA markers were used to assess the segregation of genes encoding the collagen types that predominate in the mitral valve (types I, III, and V) in two family pedigrees that are phenotypically different but showed dominantly inherited mitral valve prolapse. The inheritance of these markers was compared with the segregation of the phenotype for mitral valve prolapse in both families. In one family it was shown that the COL1A1, COL1A2, COL3A1, and COL5A2 genes segregated independently of the phenotype; in the other family the results for COL1A1, COL1A2, and COL5A2 were similar but analysis at the COL3A1 locus was not possible. These data indicate that in these families mitral valve prolapse does not arise from a defect in one of these collagen genes.     

肝细胞癌癌组织Hic-5和COL1A1表达及其对术后生存的预测价值*

目的 探讨肝细胞癌(HCC)组织氧化氢诱导的克隆基因-5(Hic-5)和I型胶原α1链(COL1A1)表达及其对HCC患者术后生存时间的预测价值。方法 2013年9月～2016年7月我院行肝癌切除术的HCC患者97例,术后取癌组织和癌旁肝组织。采用RT-PCR法和免疫组化法分别检测组织Hic-5和COL1A1 mRNA和蛋白表达。随访3年。结果 HCC患者癌组织Hic-5蛋白表达阳性率为53.6%,显著高于癌旁组织(16.5%,P＜0.05),其mRNA阳性率为66.0%,也显著高于癌旁组织(25.8%,P＜0.05);HCC患者癌组织COL1A1蛋白表达阳性率为71.1%,显著高于癌旁组织(25.8%,P＜0.05),其mRNA阳性率为78.4%,也显著高于癌旁组织(30.9%,P＜0.05);TNM Ⅰ～Ⅱ期患者癌组织Hic-5 mRNA阳性率为56.4%,显著低于Ⅲ～Ⅳ期者(78.6%,P＜0.05),COL1A1 mRNA阳性率为70.9%,也显著低于Ⅲ～Ⅳ期者(88.1%,P＜0.05),存在门静脉癌栓患者癌组织Hic-5 mRNA阳性率为82.5%,显著高于无门静脉癌栓者(54.4%,P＜0.05),COL1A1 mRNA阳性率为90.0%,显著高于无门静脉癌栓者(70.2%,P＜0.05);随访的87例患者生存时间为8.2~36.0个月,中位生存时间为36.0(14.6,36.0)个月;癌组织Hic-5阳性表达患者3 a生存时间为26.3(16.1,36.0)月,显著短于Hic-5阴性者【36.0(30.6,36.0),P＜0.05】,3 a无事件生存时间为21.4(11.7,36.0)月,也显著短于Hic-5阴性者【36.0(24.2,36.0),P＜0.05】。结论 HCC患者癌组织Hic-5阳性表达预示术后生存时间缩短,其原因可能与肿瘤分期差或门静脉存在癌栓有关。     

COL4A1基因突变与脑血管病

Ⅳ型胶原蛋白基因α1(α1type IV collagen,COL4A1)编码Ⅳ型胶原的α1链,是构成所有组织基底膜的主要成分。COL4A1基因突变可引起脑内小动脉病变,在一定的环境压力下引发脑内小血管的阻塞或破裂,造成脑出血(intracerrbral hemorrhage,ICH)。本文综述了COL4A1与α1链的结构,构成IV型胶原的方式,Ⅳ型胶原在基底膜中的作用以及目前发现的COL4A1突变引发的人类脑血管方面的疾病,并对发病机理进行了简要综述。     

COL11A1在消化系统肿瘤中的研究进展

胶原蛋白XI(collagen type XI,COL11)是一种次要胶原,其主要生理功能是调节主要胶原纤维的直径.COL11A1编码前胶原XI A1和成熟胶原XI A1的α1链,通常存在于软骨中,它在肌肉骨骼性疾病中的致病作用已被证实.但作为肿瘤微环境的重要成分之一,COL11Al近年来引发越来越多的关注.研究表明,...     

Precocious osteoarthritis in a family with recurrent COL2A1 mutation

OBJECTIVE: To examine the genotypic and phenotypic characteristics of a Micronesian kindred with autosomal dominant precocious osteoarthritis (OA). METHODS: We reviewed records and radiographs of 3 index patients and their parents, administered questionnaires to 16 additional kindred members, performed whole-genome scans of 24 family members, and sequenced relevant genes from 16 family members. RESULTS: The kindred displayed early onset OA, enlarged epiphyses, platyspondyly, and brachydactyly with dysplastic findings consistent with mild spondyloepiphyseal dysplasia. Genetic analysis revealed an arginine to cysteine substitution at position 75 of the collagen 2A1 gene, a mutation that has been described in 4 other geographically distinct families. The major phenotypic differences among the families were in height (ranging from short to tall) and hearing loss noted in 3 of the 5 families. CONCLUSION: The presence of the COL2A1 Arg75Cys mutation in 5 geographically distinct areas helps to confirm a potential mutational hotspot. The diverse phenotypic spectrum suggests that modifier genes and environmental factors play a role in the expression of this mutation.