针对caspase-3基因的RNA抑制对帕金森病细胞的抗凋亡作用

目的 探讨针对caspase-3基因的 RNA抑制对帕金森病细胞的抗凋亡作用.方法 NGF诱导PC12细胞为类神经细胞.细胞随机分为对照组、模型组、GFP siRNA组、caspase-3 siRNA组.对照组用完全培养液培养,其他3组细胞用6-羟基多巴胺制作帕金森病细胞模型.于制作模型前24 h进行转染.造模后对caspase-3及细胞凋亡率等指标进行检测.结果 (1)凋亡率:模型组细胞凋亡率[(65.36±10.10)%]明显高于对照组[(5.00±1.00)%],有显著性差异(P<0.01);caspase-3 siRNA组[(19.00±4.08)%]明显低于模型组(P<0.01).(2)caspase-3阳性率:模型组的caspase-3阳性率[(30.15±7.02)%]明显高于对照组[(8.20±2.45)%],差异有统计学意义(P<0.01);caspase-3 siRNA 组caspase-3阳性率[(12.00±2.90)%]明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01).结论 针对caspase-3的 siRNA能有效地抑制帕金森病细胞凋亡,对6-羟基多巴胺毒性作用下的神经细胞损伤有一定的保护作用.     

PDECGF特异性RNA抑制片段诱导裸鼠膀胱癌细胞凋亡的研究

目的 利用RNA干扰技术在裸鼠膀胱癌动物模型中通过抑制靶向沉默血小板源性内皮生长因子基因(PDECGF)的表达,探讨其在活体动物肿瘤组织中的作用.方法 将psiPDECGF-1及-2稳定转染的阳性T24细胞株及其他对照组直接接种于裸鼠皮下,观察肿瘤细胞生长及成瘤情况、测定肿瘤体积的变化;免疫组化检查PDECGF蛋白表达;TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡.结果 裸鼠体内成瘤实验发现siRNA2组第21天时成瘤率只有50%,而其他各组成瘤率为100%.siRNA2组生长速度明显慢于其他3组,siRNA2组不仅成瘤延迟,且生长速度明显慢于其他3组(P＜0.01).免疫组化证实siRNA2组肿瘤组织PDECGF 蛋白表达最低; TUNEL检测siRNA2组细胞凋亡数明显多于其他3组 (P＜0.05).结论 PDECGF siRNA载体稳定转染细胞株体内实验可见膀胱癌细胞成瘤率降低,成瘤延迟及肿瘤生长速度减慢,癌细胞凋亡增多.PDECGF siRNA在裸鼠体内依然对膀胱癌细胞有明显抑制作用.     

针对caspase-3基因的RNA抑制对缺血再灌注神经细胞的保护作用

目的探讨针对caspase-3基因的RNA抑制对缺血再灌注(I/R)神经细胞凋亡的影响,为I/R神经细胞基因治疗的可行性提供依据。方法 NGF诱导PC12细胞为类神经细胞。细胞随机分为对照组、模型组、GFPsiRNA组;caspase-3siRNA组。于制作模型前24h进行转染。于造模后对caspase-3及细胞凋亡率等指标进行检测。结果 (1)凋亡率:模型组细胞(48.30±12.15)明显高于对照组(5.00±1.08),差异有显著性(P0.01);caspase-3siRNA组(7.04±2.00)明显低于模型组(P0.01)。(2)Caspase-3阳性率:模型组模型组的caspase-3阳性率〔(36.55±8.72)%〕明显高于对照组〔(10.25±2.50)%〕,差异有统计学意义(P0.01);caspase-3siRNA组caspase-3阳性率〔(12.25±3.25)%〕明显低于模型组,差异有统计学意义(P0.01)。结论针对caspase-3的siRNA能有效地抑制细胞凋亡。对缺血再灌注神经细胞损伤有一定的保护作用。     

RNA介导Survivin基因沉默对胰腺癌细胞Panc-1细胞株凋亡及增殖的影响

目的观察靶向封闭survivin基因对胰腺癌细胞株Panc-1增殖和凋亡的影响，探讨survivin基因在胰腺癌的发生、发展中作用：方法设计2对survivin-shRNA，体外转录制备shRNA。利用脂质体转染技术将survivin-shRNA转染胰腺癌细胞株（Panc-1），RT-PCR检测survivin-mRNA水平；MTT法检测细胞生长情况并绘制细胞生长曲线；细胞形态学观察及流式细胞仪分析细胞凋亡。结果转染2对survivin-shRNA可分别使Panc-1细胞survivin-mRNA水平下降54．86％，52．19％；MTT法检测结果显示：转染两对survivin-shRNA24、48、72小时对细胞增殖无明显影响（P〉0．05）；细胞形态学观察及流式细胞仪分析结果显示：转染两对survivin-shRNA 24、48、72小时对细胞凋亡无明显影响（P〉0．05）。结论应用RNAi技术，将survivin-shRNA转染胰腺癌细胞（Panc-1），能成功介导survivin基因沉默，达到部分靶向封闭survivin的目的：部分靶向封闭survivin对胰腺癌细胞株Panc-1凋亡及增殖无明显影响。提示：survivin在胰腺癌细胞增殖与凋亡调控中所起的作用可能并非关键性的。因而以survivin为靶基因的基因治疗对胰腺癌可能无效。     

应用RNA干扰抑制端粒酶逆转录酶表达诱导HepG2细胞凋亡

人端粒酶由RNA亚单位（hTR）和蛋白组分构成。蛋白组分包括端粒酶逆转录酶催化亚基（hTERT）和端粒酶相关蛋白1（hTEPl）。hTERT表达与端粒酶活性密切相关，是细胞永生化过程中端粒酶活化的限速步骤。抑制hTERT的表达可快速诱导细胞凋亡，其机制不是通过端粒缩短所致。表明hTERT除了其蛋白催化活性外，尚可与其他分子相互作用诱导细胞凋亡。     

细胞凋亡与Alzheimer病

细胞凋亡是细胞死亡的形式之一。它的启动和发展需要氧自由基和多种基因及其产物参与。β—淀粉样蛋白可诱导神经元凋亡,其机制可能是通过氧自由基诱导细胞早期立即反应基因及其表达而触发的,表明细胞凋亡在Alzheimer病神经元丢失中起重要作用。     

抗小鼠Caspase-12小干扰RNA对肝细胞凋亡的抑制作用

目的观察抗小鼠Caspase-12小干扰RNA（siRNA）对小鼠原代肝细胞凋亡的抑制作用。方法原位二步灌流法分离并培养Balb／c小鼠原代肝细胞，化学合成制备三种抗Caspase-12不同位点（130，214，521）的SiRNA，脂质体包裹转染小鼠原代肝细胞。毒胡萝卜素4μmol／L诱导肝细胞凋亡。逆转录聚合酶链反应、Westeril blot检测抑制效果；四甲基偶氮唑盐法检测对细胞凋亡的影响。结果在浓度为100nmol／L时。siRNA（130）对小鼠原代肝细胞Caspase-12 mRNA的抑制率为0，siRNA（214）为52．08％，siRNA（521）为30．73％（t=4．30，P〈0．05）；在浓度为200nmol／L时，三种siRNA的抑制率分别为88．07％、86．22％，89．41％。200nmol／L的siRNA（214）对凋亡细胞procaspase-12的抑制率为51．43％（f=4．30，P〈0．01）；MTT比色实验发现，凋亡细胞活力增高48．76％（f=2．23，P〈0．01）。结论抗Caspase-12 siRNA对小鼠原代肝细胞凋亡有一定的抑制作用。     

抑制Survivin表达对胰腺癌细胞凋亡的影响

目的 探讨以Survivin为靶基因的胰腺癌基因治疗的可能性,为胰腺癌基因治疗提供依据.方法 采用化学合成的小十扰RNA(siRNA)和pGCSi载体中的小发夹RNA(shRNA)抑制胰腺癌细胞系PaTu8988的Sunrivin基因表达,通过观察胰腺癌细胞株Survivin基因表达的下调以及细胞形态、细胞凋亡、细胞活力、凋亡信号途径等的改变评价Survivin作为靶基因的治疗效果.结果 不同序列的siRNA和shRNA抑制胰腺癌细胞Survivin的表达后,Survivin mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05);碘化吡啶(PI)染色法观察发现RNA干扰(RNAi)后细胞出现核皱缩、细胞凋亡率>20%;流式细胞仪检测发现RNAi后在G0/G1期前出现了亚二倍体峰(P<0.05);Western blot法检测发现RNAi后Casptrqe-3被激活(P<0.05).结论 通过抑制胰腺癌细胞PaTu8988的Survivin表达可以诱导肿瘤细胞启动凋亡程序,加速肿瘤细胞凋亡,由此可望提高胰腺癌的治疗效果.     

caspase-8靶向小发夹RNA抑制肝细胞凋亡的研究

目的研究针对caspase-8 mRNA的小发夹RNA(shRNA)真核表达载体对肝Hepa1-6细胞凋亡的干扰作用。方法TNF-α诱导Hepa1-6细胞凋亡,脂质体法将shRNA表达载体转染入Hepa1-6细胞中,24h后应用荧光实时定量PCR和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平测定其caspase-8表达差异,流式细胞仪观察细胞凋亡的变化。结果TNF-α作用后Hepa1-6细胞caspase-8 mRNA由(0.050±0.006)升高至(0.286±0.063)(P<0.01),而shRNA表达载体Pgenesil-casp8使其下降至(0.098±0.037)(P<0.01)。转染Pgenesil-casp8重组质粒后caspase-8蛋白表达与mRNA荧光实时定量PCR结果吻合。TNF-α诱导Hepa1-6细胞凋亡率由(4.70±0.89)%升高至(17.40±2.21)%(P<0.01),Pgenesil-casp8作用后下降至(1.20±0.32)%(P<0.05)。结论针对caspase-8 mRNA的shRNA真核表达载体可有效抑制肝细胞Hepa1-6凋亡。     

基于Caspase-3基因的RNA干扰对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响

目的 研究RNA干扰Caspase-3基因表达对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响,探讨Caspase-3基因表达的RNA干扰方法在缺氧诱导的心肌细胞凋亡中的作用与机制.方法 以基于Caspase-3基因的small interferenceRNA(siRNA)处理缺氧诱导的心肌细胞,不同时期分别检测心肌细胞凋亡率、乳酸脱氢酶(LDH)漏出、钙浓度、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blot法分别检测Caspase-3基因表达水平和蛋白表达水平.结果 缺氧诱导心肌细胞后,心肌细胞、凋亡率随时间进程明显增加.缺氧诱导使心肌细胞LDH漏出、钙浓度、MDA含量增加而SOD活性降低.缺氧诱导下RNA干扰组心肌细胞Caspase-3基因mRNA转录水平、蛋白表达水平和心肌细胞凋亡率较空白对照组和错义RNA干扰组差异有统计学意义(P<0.05).结论 基于Caspase-3基因的RNA干扰显著抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡率,提示Caspase-3基因表达在缺氧诱导的心肌细胞凋亡中具有重要的作用.     

RNAi沉默Notch1基因对人骨肉瘤细胞MG63的促凋亡作用

目的采用RNA干扰(RNAi)技术抑制Notch1基因的表达,观察阻断Notch信号通路对人骨肉瘤细胞MG63的促凋亡作用及其机制。方法构建mNotch-1短发夹状RNA(mNotch-1 shRNA),利用MTT增殖试验分析mNotch-1 shRNA转染前及转染24、48、72 h时MG63细胞的增殖情况;通过Annexin V法染色和流式细胞术检测细胞凋亡率及与mNotch-1 shRNA作用时间的关系;Western blot检测细胞中Notch1、Bcl-2及Bax蛋白表达的变化。结果与对照组相比,mNotch-1 shRNA转染MG63细胞后,细胞增殖水平明显下降。Annexin V染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高。Western blot结果分析显示mNotch-1 shRNA转染MG63细胞后,细胞中Notch1基因表达明显降低,并且显著抑制Bcl-2基因和上调Bax基因的表达。结论 RNAi沉默Notch1基因能明显抑制人MG63细胞增殖,促进细胞凋亡;其作用机制可能与调控Bcl-2及Bax蛋白表达有关。     

沉默Bcl-2基因对A549细胞的影响

目的 探讨Bcl-2基因在抑制细胞凋亡的作用.方法 利用RNA干扰技术,通过向人非小细胞肺癌A549细胞中导入siRNA表达载体,抑制Bcl-2基因表达,诱导细胞凋亡.结果 Bel-2基因沉默导致A549细胞发生凋亡.结论 Bcl-2家族成员之间相互拮抗的关系及由此产生的A549细胞凋亡,为治疗肿瘤提供了一条新的途径.     

小干扰RNA抑制核因子-κB活化对HepG2细胞凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(SiRNA)抑制核转录因子(NF)-κB活化对肝癌细胞凋亡的影响.方法 化学合成NF-κB siRNA和阴性对照siRNA,脂质体法转染HepG2细胞,用巢式RT-PCR和荧光定量PCR检测NF-κB mRNA表达情况;免疫组织化学法、酶联免疫吸附法、Western b10t检测NF-κB蛋白表达情况;用磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素法检测细胞凋亡,分析NF-κB表达抑制和细胞凋亡间关系.多个样本均数间的比较先行方差齐性检验,方差齐时行单因素方差分析;计数资料比较采用确切概率法分析.结果 NF-κBp65 mRNA在HepG2细胞相对表达量为1.13±0.03,在正常肝细胞L02为0.29±0.07,两者比较,t=27.02,P<0.05,差异有统计学意义.利用NF-κB siRNA干扰可下调NF-κB表达,且呈剂量、时间依赖;NF-κB siRNA转染HepG2细胞72h后,NF-κBmRNA和蛋白表达分别下降了93%和62%,抑制NF-κB表达使HepG2细胞凋亡增加85%. 结论 NF-κB在肝癌细胞中高表达,NF-κB SiRNA能特异性抑制其在肝癌细胞中活化并促进癌细胞凋亡发生.     

一例胎儿克山病心肌检出肠道病毒RNA及凋亡细胞的探讨

一例胎儿克山病心肌检出肠道病毒ＲＮＡ及凋亡细胞的探讨周令望钟学宽牛美娟于祖熙既往研究报道母亲因患克山病可在其胎儿心肌上检出病变程度和性质相对应的病理改变，称其为胎儿克山病［１］。为探讨胎儿克山病与肠道病毒感染的关系，我们应用柯萨奇Ｂ３病毒的ｃＤＮＡ探...     

靶向survivin基因siRNA在食管癌细胞增殖和凋亡中作用的研究

目的 研究survivin基因特异性RNA干扰对食管癌Eca-109细胞株体外增殖能力和凋亡的影响. 方法 构建靶向survivin的小干扰RNA(siRNA)表达载体,用脂质体法转染Eca-109细胞后,采用半定量RT-PCR、Western Blot检测转染前后survivin mRNA及蛋白表达水平的改变,采用噻唑兰(MTT)法检测细胞的生长增殖情况,采用流式细胞术测定细胞的凋亡情况. 结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以有效地抑制Eca-109细胞survivin基因的表达.转染靶向survivin的siRNA表达质粒可以显著抑制Eca-109细胞的增殖(细胞接种24 h、48 h后增殖抑制率分别为21.05%和33.96%),诱导明显的细胞凋亡[转染24 h、48 h后的凋亡率分别为(8.03±1.05)%和(6.22±1.06)%]. 结论 survivin基因特异性RNA干扰可以显著抑制食管癌Eca-109细胞的体外增殖并诱导明显的细胞凋亡.     

Alzheimer病和细胞凋亡

Alzheimer病(AD)的病理改变除经典的神经原纤维缠结和老年斑之外,还有突触丢失和神经元丢失。其中神经元丢失是脑萎缩的形态学基础。关于AD病人种经元丢失的发生机制近年来受到AD研究的关注。虽然到目前为止还没有人在AD患脑中观察到正在凋亡的神经元,但很多研究结果都表明AD患脑中的神经细胞死亡是以凋亡的形式发生的。本就AD患脑中神经元凋亡的研究进展作一综述。     

RNA介导survivin基因沉默对肝癌细胞HepG2细胞株凋亡及增殖的影响

目的观察靶向封闭survivin基因对肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响,探讨survivin基因在肝癌的发生、发展中的作用。方法设计1对survivin-siRNA,体外转录制备siRNA。应用脂质体转染技术将survivin-siRNA转染肝癌细胞株HepG2,应用有荧光标记的非特异性小分子siRNA检测转染效率;RT-PCR检测survivin-mRNA水平;SABC免疫组化染色技术检测survivin蛋白表达情况;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞仪分析细胞凋亡。结果转染survivin-siRNA可使HepG2细胞survivin-mRNA水平下降53.8%,并可使survivin蛋白表达明显减少;转染survivin-siRNA对细胞增殖及细胞凋亡无明显影响(P>0.05)。结论抑制survivin表达对肝癌细胞株HePG2凋亡及增殖无明显影响。提示survivin在肝癌细胞增殖与调亡调控中所起的作用可能并非是关键性的。     

Livin基因沉默对大肠癌细胞凋亡和化疗敏感性的影响

目的 观察沉默Livin基因对大肠癌HT-29细胞凋亡和化疗敏感性的影响.方法 采用脂质体转染技术将化学合成的Livin siRNA转入HT-29细胞,RT-PCR和Western印迹法检测转染效果.选用5-氟尿嘧啶(5-FU)作用于转染和未转染的细胞,MTT检测各组细胞的增殖、流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 si-Livin1转染组Livinα mRNA、Livinβ mRNA和Livin蛋白表达水平较其余干扰组和对照组显著降低(P<0.01).5-FU对HT-29细胞的生长抑制作用强于si-Livin1转染组(P<0.01),而si-Livin1+5-FU组对细胞的生长抑制率显著高于单独si-Livin1转染组和单独5-FU作用组(P<0.01).与空白对照组比较,si-Livin1转染可使细胞出现明显凋亡现象(P<0.01),5-FU对细胞的促凋亡作用强于si-Livin1转染组(P<0.01),si-Livin1+5-FU组的凋亡率显著高于单独si-Livin1转染组和单独5-FU作用组(P<0.01).结论 siRNA沉默Livin基因能够抑制HT-29细胞的生长,促其凋亡,提高5-FU的化疗敏感性.Livin基因有望成为大肠癌治疗的新靶点.     

体外RNA干扰抑制RegⅣ基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:拟探讨RegⅣ基因在胃癌细胞中的表达及干扰该基因对胃癌细胞增殖和凋亡的影响.方法:应用实时定量PCR方法检测九株胃癌细胞株中RegⅣ基因的mRNA表达. 针对RegⅣ基因设计三条小干扰RNA片段(siRNA1、siRNA2、siRNA3), 瞬时转染高表达胃癌细胞株, 实时定量PCR方法检测转染后RegⅣ基因的mRNA的表达水平, CCK-8法检测细胞增殖能力, 流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:以永生化正常胃黏膜细胞株GES-1作为参照, 除MKN-45和SNU-1胃癌细胞株外, 其余胃癌细胞株中RegⅣ表达水平均升高5倍以上, 尤以SNU-16细胞株明显, 其RegⅣ的表达水平高出GES-1细胞数千倍, 遂选用SNU-16细胞进行RNA干扰. 合成的三对siRNA对RegⅣ基因表达均有明显抑制作用, 抑制率分别为79.3%、77.4%和60.4%. 选用siRNA1干扰SNU-16细胞株后96 h和120 h, 其细胞增殖率受到明显抑制( P = 0.0057, 0.0173). 流式细胞仪检测显示72 h细胞凋亡率明显增加( P =0.0231).结论:干扰RegⅣ基因具有抑制胃癌细胞增殖,促进凋亡的作用, RegⅣ基因可能成为胃癌基因靶向治疗的分子靶点.