重组葡萄球菌肠毒素B蛋白表达、纯化及生物活性的实验研究

 目的建立重组葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)表达、纯化方法,了解rSEB细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用。方法采用IPTG(1.0mmol·L^-1)诱导SEB原核表达系统pET32a-SEB-E.coliBL21DE3表达rSEB,10%SDS-PAGE检测其产量,Ni-NTA亲和色谱法纯化rSEB。采用Vero细胞测定rSEB的细胞毒性作用,并计算TCIC₅₀值。通过MTT法分别检测不同浓度rSEB体外促淋巴细胞增殖作用,以及对肿瘤细胞株HepG2、HeLa的生长抑制作用。结果所构建的SEB原核表达系统中,rSEB表达量约为细菌总蛋白的40%,主要以包涵体形式存在。纯化的rSEB对Vero细胞的TCIC₅₀为3.02μg。5.0～20.0mg·L^-1的rSEB对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用(P<0.05)。5.0～20.0mg·L^-1rSEB作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长(P<0.05)。结论建立了SEB高效表达、纯化方法,获得rSEB蛋白。所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法,为后续进一步分析SEB分子中相关活性位点及其减毒SEB突变体的筛选奠定了基础。     

重组葡萄球菌肠毒素A及其突变体蛋白促淋巴细胞增殖作用的研究

 目的 观察重组葡萄球菌肠毒素A（rSEA）及其突变体蛋白对淋巴细胞增殖、活化作用及对淋巴细胞亚群分群的影响。方法 分离健康人外周血单个核细胞（PBMC）及小鼠脾淋巴细胞悬液,体外经rSEA及其3种突变体（rSEA/H187A、rSEA/H225A和rSEA/D227A）蛋白刺激后,采用噻唑蓝法（MTT）检测人和小鼠脾淋巴细胞增殖水平,采用流式细胞术检测人外周血中T淋巴细胞亚群（CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T细胞）及活化CD4⁺、CD8⁺ T细胞和自然杀伤细胞（NK）的含量。结果 5~20 mg·L^-1的rSEA及其3个突变体蛋白对人PBMC和小鼠脾淋巴细胞均有明显促增殖作用（P<0.05）;经rSEA、rSEA/H225A刺激后的人PBMC中,CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T细胞的含量明显高于对照组,rSEA/H187A能上调CD3⁺和CD8⁺T细胞,而rSEA/D227A只上调CD8⁺T细胞（P<0.05）;rSEA及3种突变体蛋白均能上调活化CD4⁺和CD8⁺T细胞,rSEA、rSEA/H187A、rSEA/H225A能上调NK细胞含量（P<0.05）。结论 rSEA及其3种突变体（rSEA/H187A、rSEA/H225A和rSEA/D227A）蛋白对淋巴细胞均有明显促增殖和活化作用,并可不同程度地上调T淋巴细胞亚群CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ 及NK细胞的含量,为筛选出低毒、高效的升白细胞相关药物候选突变体奠定基础。
     

黄芪和天花粉对小鼠恶性黑色素瘤B16细胞增殖和迁移及E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响

目的观察黄芪、天花粉及其配伍对小鼠恶性黑色素瘤B16细胞增殖和迁移的影响,探讨其作用机制。方法 MTT法检测B16细胞增殖,根据结果计算细胞生长抑制率为0%时对应的各药物浓度(IC0)、为25%时对应的各药物浓度(IC25)、为50%时对应的各药物浓度(IC50)。设空白组、配伍组(黄芪注射液IC0+天花粉水煎剂IC0、黄芪注射液IC0+天花粉水煎剂IC25、黄芪注射液IC0+天花粉水煎剂IC50、黄芪注射液IC25+天花粉水煎剂IC0、黄芪注射液IC25+天花粉水煎剂IC25)。细胞划痕实验检测B16细胞迁移,Westernblot检测B16细胞迁移相关蛋白E-cadherin、N-cadherin表达。结果 MTT检测结果表明,不同剂量黄芪和天花粉均可抑制B16细胞增殖,具有浓度依赖性;细胞划痕实验结果显示,黄芪和天花粉均影响B16细胞划痕愈合,抑制细胞迁移,具有浓度依赖性;两药不同比例配伍的细胞增殖抑制率明显高于单味中药,差异有统计学意义(P<0.05);Westernblot检测结果显示,黄芪和天花粉均增加E-cadherin蛋白的表达,降低N-cadherin蛋白的表达。结论黄芪、天花粉及其配伍均可抑制小鼠恶性黑色素瘤B16细胞增殖及迁移,且两药配伍效果优于单味中药,黄芪和天花粉抑制细胞迁移的机制与E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达相关。     

重组人红细胞生成素对大鼠脑缺血再灌注损伤后XIAP及Smac蛋白表达的影响

目的探讨大鼠脑缺血再灌注后线粒体通路第二种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物（Smac）和凋亡抑制蛋白（XIAP）的表达变化及重组人红细胞生成素（rh-EPO）的干预作用机制。方法将大鼠随机分成缺血组、rh-EPO治疗组,大鼠脑缺血再灌注6h、12h、24 h、72h和7 d检测凋亡,免疫组化法检测Smac和XIAP阳性细胞数。结果缺血组神经元凋亡增多,XIAP、Smac蛋白的表达明显上升;rh-EPO能显著降低神经功能症状,减少神经元凋亡,促进XIAP表达,下调Smac表达。结论脑缺血再灌注后脑组织XIAP和Smac蛋白的表达均明显增加,XIAP作为内源性保护蛋白在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用,rh-EPO可能通过促进XIAP并抑制Smac表达保护神经功能。     

重组人胰高血糖素样肽前药的表达、纯化及生物活性分析

 目的建立重组人胰高血糖素样肽前药(prodrug of recom binant human GLPs,Pro-rhGLPs)的表达、纯化方法,研究Pro-rhGLPs对体内血糖水平及血清胰岛素水平的影响。方法采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,0.01mmol·L^-1)诱导原核表达系统E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-hGLPs表达Pro-rhGLPs,12%SDS-PAGE检测蛋白表达量,Ni-NTA亲和层析纯化Pro-rhGLPs,应用Westernblot在体外观察前体药物的活性分子释放过程。在C57BL/6小鼠上进行葡萄糖耐量实验检测其生物学活性,不同时间间隔取血测定血糖及血清胰岛素水平。在糖尿病db/db小鼠上观察其降糖作用。结果所构建的Pro-rhGLPs原核表达系统中,Pro-rhGLPs表达量约为细菌总蛋白的50%。纯化得到的蛋白纯度达到95.43%,并且可以在特异性酶作用下缓慢降解,释放出多个胰高血糖素样肽1(GLP-1)分子。纯化的Pro-rhGLPs呈剂量依赖性降低血糖浓度,同时升高血清胰岛素水平。等剂量Pro-rhGLPs的降糖作用较GLP-1作用更强。结论建立了Pro-rhGLPs高效表达、纯化方法,获得了高纯度Pro-rhGLPs,对糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用。     

相思子蛋白P2对B16黑色素瘤的抑制作用及机制研究

目的:研究相思子蛋白P2对小鼠黑色素瘤B16生长的抑制作用及作用机制。方法:MTT法观察相思子蛋白P2对B16细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪检测对B16细胞周期和细胞凋亡的影响,JC-1染色法检测相思子蛋白P2对B16细胞线粒体膜电位的影响;相思子蛋白P2 50、75、100μg/kg连续灌胃给药10天,观察对小鼠黑色素瘤B16移植性肿瘤生长的抑制作用。结果:相思子蛋白P2对B16细胞具有显著的生长抑制作用,IC50值为4.6×10-3μg/ml,浓度为1μg/ml时抑制率可达95.45%;流式细胞仪分析显示,相思子蛋白P2主要将细胞周期滞留在S期,阻断向G2/M期发展,从而抑制肿瘤细胞增殖。相思子蛋白P2可明显诱导B16细胞凋亡。荧光显微镜检测结果显示相思子蛋白P2可显著降低B16细胞线粒体膜电位。相思子蛋白P2口服给药对小鼠B16移植性肿瘤生长有抑制作用,100μg/kg抑瘤率达53.75%,有明显剂量-效应依赖关系,且对胸腺和脾脏质量指数的影响较环磷酰胺小。结论:相思子蛋白P2于体内外均可显著抑制B16细胞的生长,此作用与阻止肿瘤细胞增殖周期,降低线粒体膜电位,诱导细胞凋亡有关。     

重组人Cu,Zn-SOD包含体的复性、纯化及复性蛋白稳定性研究

 目的通过体外复性和纯化技术获得具有高纯度、高生物活性的重组人铜锌超氧化物歧化酶(rhCu,Zn-SOD),并研究复性蛋白的稳定性。方法以透析法对在大肠杆菌中以包含体形式表达的rhCu,Zn-SOD进行复性,采用金属螯合亲和层析对复性样品进行纯化,通过酶活性测定考查复性和纯化的rhCu,Zn-SOD的热稳定性、pH稳定性和对变性剂的稳定性。结果建立了体外透析复性的基本条件,其比活可达2 380 U·mg^-1。该复性样品经金属螯合亲和层析纯化后,结果得到纯度大于95%、比活5 000 U·mg^-1、活性回收率大于100%的目的蛋白。复性和纯化蛋白在温度25～70℃和pH 5.0～10.5内活性稳定,并可耐受2～10 mol·L^-1的尿素和2%～8%的十二烷基硫酸钠(SDS),对更强烈的变性剂盐酸胍稳定性较弱。结论确定了重组人Cu,Zn-SOD包含体的体外复性条件和复性蛋白纯化方法,且复性蛋白表现出很好的稳定性,为重组人Cu,Zn-SOD的生产奠定了良好基础。     

溃结灵对Caco-2炎症细胞模型IκBα基因和蛋白表达的作用

目的观察溃结灵对白介素-1β(IL-1β)刺激的Caco-2炎症细胞模型核因子抑制蛋白-κB(IκBα)基因表达及蛋白表达的作用,对其抗溃疡性结肠炎(UC)作用机制进行探讨。方法将生长融合至70%～80%的Caco-2细胞分为7个组:正常对照组、模型组、蛋白酶抑制剂组、阳性药柳氮磺胺吡啶组(SASP)及溃结灵高、中、低剂量组。IL-1β刺激细胞建立炎症模型,收集细胞标本。采用实时荧光定量PCR方法检测Caco-2细胞IκBα的基因表达,Western blot方法检测其蛋白表达。结果 IL-1β刺激的Caco-2炎症细胞中,模型组IκBα基因表达明显低于正常对照组(P<0.05),溃结灵中剂量组IκBα基因表达明显高于模型组(P<0.05);IL-1β刺激的Caco-2细胞炎症中,模型组IκBα蛋白表达低于正常对照组,但差异无统计学意义(P>0.05),而溃结灵高剂量组IκBα蛋白表达明显高于模型组(P<0.01)。结论溃结灵对IL-1β刺激的Caco-2炎症细胞IκBα基因和蛋白的表达有上调作用,其抗UC作用的机理可能为抑制IκBα蛋白的降解,最终抑制NF-κB的活化,减轻炎症反应。     

电针对干眼症兔结膜细胞凋亡及相关蛋白Caspase-3、Fas和Bcl-2表达的影响

目的:通过观察电针对干眼症兔结膜细胞凋亡及相关蛋白Caspase-3、Fas和Bcl-2表达的影响,从细胞凋亡角度探讨电针治疗干眼症的作用机制.方法:雄性新西兰兔随机分为正常组、模型组、电针组和假电针组.采用0.1%苯扎氯铵滴眼制作兔干眼症模型.检测各组兔泪液分泌量、泪膜破裂时间;采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定(TUNEL)法检测结膜细胞凋亡情况;应用免疫组化法检测结膜细胞Caspase-3、Fas和Bcl-2蛋白表达.结果:与正常组比较,模型组兔泪液分泌量降低,泪膜破裂时间缩短(均P<0.01);与模型组、假电针组比较,电针组兔泪液分泌量增多,泪膜破裂时间延长(均P<0.05).与正常组比较,模型组兔结膜细胞凋亡增加(P<0.01),Caspase-3和Fas蛋白表达增加(均P<0.05),Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01);与模型组、假电针组比较,电针组兔结膜细胞凋亡减少(均P<0.01),Caspase-3和Fas蛋白表达减少(均P<0.05),Bcl-2蛋白表达增加(均P<0.01).结论:电针能抑制干眼症兔结膜细胞凋亡,下调凋亡相关蛋白Caspase-3和Fas表达,上调Bcl-2蛋白表达,该作用可能是电针治疗干眼症的作用机制之一.     

宫颈癌组织中D2-40标记淋巴管密度与高迁移率族蛋白B1表达的关系研究

目的探讨宫颈癌组织中淋巴管密度(LVD)与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达的关系。方法采用免疫组化法检测86例宫颈癌患者正常组织与癌组织中的D2-40(LVD特异性标记物)表达情况,计算组织LVD;用Western blot法检测正常组织和癌组织中HMGB1表达情况,并进行定量分析;用Pearson相关分析法分析LVD与HMGB1之间的相关性。结果宫颈癌患者癌组织中LVD及HMGB1表达水平均显著高于正常组织(P均<0.05),Ⅲ+Ⅳ期患者癌组织中LVD及HMGB1表达水平均显著高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P均<0.05);癌组织中LVD与HMGB1表达水呈显著正相关关系(r=0.97,P<0.05)。结论宫颈癌组织中LVD与HMGB1的表达呈显著正相关关系,与肿瘤的发展密切相关,二者可能通过相互作用,共同促进肿瘤细胞的侵袭、转移等活动。     

金黄色葡萄球菌肠毒素E的克隆表达及其生物活性研究

 目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)基因,获得重组SEE蛋白(rSEE),并对rSEE进行生物活性分析。方法通过PCR从金黄色葡萄球菌FR1326菌株基因中得到肠毒素SEE的成熟肽基因,将其克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌进行表达并对融合蛋白进行亲和色谱纯化,通过MTF法研究其生物活性。结果成功构建了SEE的表达载体,并得到高纯度的重组蛋白。MTY法结果表明,rSEE具有良好的促淋巴细胞增殖的能力以及肿瘤细胞的杀伤活性。结论具超抗原活性和高纯度的rSEE,为进一步研究该蛋白的抗肿瘤机制,构建靶向抗肿瘤融合蛋白奠定了基础。     

重组蜂毒肽对C6胶质瘤细胞的抑制作用及对 VEGF,Flt-1,MMP-9表达的影响

目的： 探讨重组蜂毒肽作用于大鼠C6胶质瘤细胞后,对细胞生长的抑制作用及对血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子受体（Flt-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响。方法： 对大鼠C6胶质瘤细胞进行体外培养后,分为对照组及重组蜂毒肽低、中、高剂量治疗组,治疗组分别给予相应浓度的重组蜂毒肽（20,50,80 mg·L^-1）,采用MTT法于24,48,72 h分别测定C6胶质瘤细胞的生长情况;并采用Western blot法测定不同浓度重组蜂毒肽作用72 h后C6胶质瘤细胞VEGF,Flt-1,MMP-9的表达情况。结果： 与对照组比较,不同浓度的重组蜂毒肽作用于细胞24 h后,细胞生长情况无明显变化,但48,72 h后,低、中、高浓度治疗组的细胞的增殖活性均有不同程度的降低、生长抑制率增高（P<0.01或P<0.05）;同时中、高浓度重组蜂毒肽作用72 h后,胶质瘤细胞的VEGF,Flt-1,MMP-9表达水平均有不同程度的降低（P<0.01或P<0.05）。结论： 重组蜂毒肽对C6胶质瘤细胞的生长和VEGF,Flt-1,MMP-9的表达均有明显的抑制作用,因此重组蜂毒肽可能通过抑制VEGF,Flt-1,MMP-9的表达来抑制胶质瘤的生长。     

姜黄素对匹罗卡品致痫大鼠海马S100B蛋白表达的影响

目的:观察氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠海马组织S100B表达,探讨姜黄素对癫痫大鼠神经保护作用机制。方法:动物随机分为3组,空白对照组、癫痫组、姜黄素治疗组。癫痫模型采用氯化锂-匹罗卡品诱导大鼠癫痫持续状态(SE),给药SE后予姜黄素300 mg/kg腹腔,大鼠癫痫造模后24 h和72 h取海马组织,苏木素-伊红(HE)染色观察海马组织病理形态学变化,免疫组化染色和免疫印迹法检测海马组织S100B蛋白的表达。结果:癫痫组海马神经元脱失和损伤明显,姜黄素治疗组明显减轻;与对照组相比,海马神经元S100B免疫反应阳性表达增加,差异显著(P<0.05);与模型组比较姜黄素治疗组海马神经元S100B阳性表达水平降低,差异显著(P<0.05)。结论:姜黄素治疗可降低匹罗卡品致痫大鼠海马神经元S100B蛋白表达,可能通过抑制星形胶质细胞活化来减轻癫痫发作脑损伤发挥神经保护作用。     

呼吸道合胞病毒重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法及免疫原性研究

 目的建立呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,并研究其免疫原性。方法PCR扩增G1和F/M2基因片段,经酶切后插入原核表达载体pET-DsbA中,构建重组质粒pET-DsbA-G1F/M2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni⁺螯合亲和色谱法纯化尿素变性的包涵体溶液,梯度透析复性,Western-blot鉴定重组蛋白的RSV特异性,免疫BALB/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL)。结果构建的重组质粒在E.coli中表达了RSV特异性的重组蛋白,经变性、纯化并复性后获得了高纯度的DsbA-G1F/M2(>90%);该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体和CTL活性。结论建立了重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础。     

丹酚酸B预适应对缺氧复氧损伤细胞热休克蛋白70mRNA表达的影响

[目的]探讨丹酚酸B(Sal B)预适应的细胞保护机制是否与诱导热休克蛋白70(HSP70)合成有关。[方法]在缺氧复氧损伤大鼠心脏微血管内皮细胞(CMEC)后，采用RT-PCR法观察Sal B预适应对细胞HSP70 mRNA表达的影响。[结果]HSP70 mRNA在正常的CMEC有较低表达，缺氧刺激使其表达明显增强。Sal B预适应促进HSP70 mRNA表达增强，作用明显优于缺氧预适应(HPC)。晚期预适应保护中，Sal B预适应同样促使HSP70 mRNA表达明显增强，与HPC具有增强表达的叠加效应。[结论]Sal B预适应通过诱导HSP70表达升高发挥细胞保护作用。     

五味子蛋白的提取纯化及含量测定

目的:通过HPLC测定黄芩和半夏不同配伍比例后黄芩苷溶出量的变化,以探讨中药药性配伍的科学内涵。方法:采用Diamonsil C18(2)柱(4.6 mm×250 mm,5μm),乙腈-0.4%磷酸溶液(26∶74)为流动相,检测波长280 nm,流速1.0 mL.min-1,柱温30℃。建立黄芩与半夏配伍[以寒为主(9∶6);寒热各半(9∶9);以热为主(6∶9)]后黄芩苷的含量测定方法,并比较不同配伍后黄芩苷溶出量的大小。结果:黄芩苷质量浓度在0.010 25～0.102 5 g.L-1线性关系良好(r=0.999 9),平均回收率99.21%(n=9),RSD 2.0%;黄芩配伍半夏后[以寒为主(9∶6)、寒热各半(9∶9)、以热为主(6∶9)]和黄芩单煎后黄芩苷平均含量分别为64.018,63.6805,0.581,62.529 mg.g-1。结论:黄芩配伍半夏后黄芩苷的HPLC检测方法可靠、稳定、重复性好。不同比例配伍后黄芩苷的溶出量有较大差异,尤其是以热为主配伍(6∶9)对黄芩苷的溶出影响最大,溶出最低,体现了中药药性配伍中以半夏的温热之性抑制黄芩之寒凉之性的科学内涵。     

丹参中丹酚酸B的提取分离及分析方法研究进展

系统综述了提取、纯化、分析丹参中治疗心脑血管病的有效成分丹酚酸B的方法, 并对微波提取、超临界流体萃取、大孔树脂吸附技术与传统技术上作了比较和论述。     

丹参素、丹酚酸B与不同血浆蛋白结合率的测定

目的:建立测定丹酚酸B和丹参素与大鼠、牛血清白蛋白(BSA)、人血浆蛋白结合率的方法,比较丹酚酸B和丹参与不同血浆蛋白结合率的差异。方法:采用UPLC测定丹酚酸B和丹参素含量,流动相乙腈(A)-1%甲酸溶液(B)梯度洗脱(0~2 min,18%A;2~3 min,18%~30%A;3~6 min,30%A),检测波长280 nm。通过平衡透析法考察丹酚酸B和丹参素与不同血浆的蛋白结合率。结果:丹酚酸B和丹参素在3种不同血浆中线性范围均为2~200 mg·L-1,透析外液均为0.5~20 mg·L-1。丹酚酸B在大鼠、人血浆和BSA中的平均血浆蛋白结合率分别为90.60%,92.25%,87.55%;丹参素在大鼠、人血浆及BSA中的平均血浆蛋白结合率分别为35.44%,37.71%,33.49%。结论:不同质量浓度的丹酚酸B和丹参素在同一种血浆中的蛋白结合率无显著性差异,丹酚酸B与3种血浆蛋白结合率较丹参素高。