人巨细胞病毒体外感染巨核系细胞加重凋亡

为了研究人巨细胞病毒 (HCMV)感染对巨核系细胞加快凋亡的作用机制及HCMV感染引起血小板减少症的机制 ,采用巨核细胞株CHRF 2 88 11和HCMVAD16 9株共同培养 ,用PCR检测HCMVIEA ,用形态学观察、DNALadder形成及AnnexinV/PI流式细胞仪检测分析细胞凋亡情况。结果显示 :HCMVAD16 9株的不同浓度病毒组(10 -3 ,10 -2 ,10 -1)均能显著抑制CHRF细胞的生长。在感染 7天后 ,3组细胞的活率水平分别是 77% ,73%和 6 8% ,而对照组为 98%。用流式细胞仪检测AnnexinV/PI,在感染 7天后 ,10 -3 ,10 -2 和 10 -1病毒组凋亡细胞的百分数是(2 1.3± 2 .4 9) % ,(2 5 .8± 3.6 5 ) %和 (31.4± 3.91) % ,对照组则为 (3.6 8± 1.4 7) %。凋亡率随培养液中病毒浓度的加大和感染后时间的延长而增高 ,二者呈依赖关系。形态学观察和DNALadder的形成进一步证实了凋亡细胞的存在 ,用PCR确定了在CHRF细胞内有HCMVIEA的表达。结论 :HCMV可直接感染巨核系细胞并加重它的凋亡。     

慢性特发性血小板减少性紫癜患者巨核系祖细胞体外生长及成熟的研究

为研究慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)患者骨髓巨核系祖细胞体外生长及成熟状态,采用血浆凝块法进行培养,经SZ-21单抗和免疫组化染色后计数33例患者骨髓巨核祖细胞(CFU-Meg与BFU-Meg)集落数,用图像分析仪测定巨核祖细胞直径和面积.结果发现,CITP患者CFU-Meg为39.27±21.44,BFU-Meg为5.62±3.93,与对照组无明显差异,但GPⅢa+细胞面积为(134.90±6.08)μm2,直径为(12.89±3.66)μm,均低于对照组.骨髓涂片巨核细胞数正常组的患者CFU-Meg为19.43±7.28和BFU-Meg为4.67±1.53,均低于对照组.巨核系祖细胞总集落数与骨髓涂片巨核细胞数呈正相关,r=0.6503,而与外周血血小板计数和病程长短无相关.结果提示CITP患者巨核祖细胞存在成熟障碍,部分患者存在增殖障碍.     

无血清脐血巨核系祖细胞体外扩增的研究

脐血造血干细胞移植后血小板恢复延迟是一大难题,目前认为这主要与脐血中巨核系祖细胞数量不足及脐血巨核细胞分化成熟延迟有关,而将部分脐血进行巨核系祖细胞体外扩增后输注受者体内是有望解决这一难题的重要途径。但适用于临床应用的扩增条件至今仍未确立。本课题采用人脐血单个核细胞(MNC)在无血清培养体系中使用TPO,IL-3,SCF,IL-6等细胞因子进行不同的组合,在培养的0,6,10,14天进行MNC、CD41^ 细胞及CFU-MK数的检测。以寻找最佳的细胞因子组合及最佳的收获时机。结果表明：无血清条件下TPO与IL-3,SCF,IL-6等细胞因子联用可实现脐血巨核系祖细胞有效的体外扩增,各因子组中以TPO IL-3 SCF IL-6组扩增效果为最佳。其CFU-MK数于第10天最多,扩增达6．8倍,CD41^ 细胞扩增达8．8倍。结论：在人脐血MNC无血清培养条件下。TPO IL-3 SCF IL-6组为巨核系祖细胞体外扩增较佳的因子组合。由于TPO IL-3 SCF IL-6组的CFU-MK数于第10天最多,CD41^ 细胞数亦为同期最高,故培养后收获时间宜控制在其体外培养的第10天。     

人类巨核系造血祖细胞培养的应用

自从1979年Vainchenker首次成功地培养出人类巨核系造血祖细胞(CFU-MK)以来,其培养方法日趋完善,已成为研究巨核系造血机制及巨核细胞相关疾病的有力工具,且已取得可喜进展。     

当归多糖在体外抑制HCMV感染所致巨核系细胞凋亡中的作用探讨

本研究探讨当归多糖（angelica polysaccharide,APS）在体外抑制HCMV感染致人巨核系细胞凋亡中的作用。HCMV AD169体外感染巨核系细胞CHRF-288-11,在病毒感染后第3天向试验体系中加入APS。用PCR扩增检测HCMV DNA,用形态学、DNA片段化、细胞表面标志检测APS对HCMV感染所致巨核系细胞凋亡的影响。结果表明：APS在一定程度上能抑制HCMV体外感染诱导的巨核系细胞CHRF-288-11凋亡,且呈剂量依赖性。感染的巨核系细胞CHRF-288-11中有hCMV IEA的表达,形态学和DNA片段化分析证实了细胞凋亡的存在,Annexin V／PI双染流式细胞仪分析显示受感染的CHRF细胞中随着加入APS剂量的减少,凋亡率呈上升趋势。结论：HC—MVAD169株在体外可直接感染巨核系细胞并降低其存活率;HCMVAD169株在体外感染巨核系细胞后可诱导其加重凋亡,凋亡率与时间呈正相关。在HCMVAD169株体外感染巨核系细胞后,向培养细胞中加入APS,可以提高受染细胞的存活率,表明APS对HCMV感染的巨核系细胞有一定的保护作用;APS在一定程度上能抑制HCMV体外感染诱导的巨核系细胞凋亡,且呈剂量依赖性。     

原发性血小板增多症巨核系祖细胞体外自主性生长及Tpo作用的探讨

目的：研究原发性血小板增多症（ET）巨核系祖细胞的体外自主性生长以及Tpo对其生长的作用,方法：用ET患者骨髓纯化CD^ 34细胞以不同浓度的骨髓和外周血单个核细胞进行体外培养,检测其对自发性CFU－MK形成的影响,用RT－PCR技术检测液体培养自发性生长细胞的Tpo的自主分泌和旁分泌,观察CD^ 34细胞培养中加入Tpo对CFU－MK形成的影响,结果：体外培养纯倾CD^ 34细胞无自发性CFU－MK形成,单个核细胞稀释到一定浓度（10^4/ml或10^3/ml）时自发性集落消失,液体培养自发性生长细胞无Tpo mRNA的表达,CD^ 34细胞培养中加入Tpo后可形杨CFU－MK,结论：ET患者的体外自发性CFU－MK形成并非巨核系祖细胞的自主性生长所,民Tpo的自主分泌或旁分泌也无关,ET的巨核系祖细胞可能对Tpo或其他细胞因子敏感。     

动员人外周血巨核祖细胞体外扩增的研究

本研究探讨多种细胞因子(TPO、SCF、FL、IL-1、IL-3、IL-6)组合的几种培养体系对人外周血CD34+细胞体外诱导扩增生成巨核细胞的作用,研究人外周血来源的巨核细胞体外扩增的最佳细胞因子组合及培养时间。用Ficoll-Hapaque分离法分离动员的外周血(MPB)单个核细胞,免疫磁珠法分离纯化CD34+细胞,并将其在含胎牛血清的液体培养体系中、各组细胞因子诱导下培养15天。在不同时间点采用血细胞计数板进行细胞计数,采用流式细胞术检测培养体系中CD41+细胞的含量;同时采用甲基纤维素半固体培养法进行巨核细胞集落培养,测定巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)的数量。结果表明经过15天的培养,在MPB来源的CD34+细胞体外诱导并扩增巨核祖细胞体系中,以TPO/FL/IL-6/IL-3组合的扩增效果最好,明显高于其它3组,CD41+细胞第5天、10天分别扩增了93.97±17.27倍、131.23±18.26倍。第15天CD41+细胞含量及CD41+细胞数迅速下降。CFU-MK产率(/1×103个细胞)第5天、10天分别为83.33±10.02个、120.67±13.01个,明显高于其余3组。结论以TPO/FL/IL-6/IL-3因子组合为体外诱导扩增巨核祖细胞的最佳组合,动员外周血的巨核祖细胞体外诱导扩增以培养第10天为宜。本实验建立了动员人外周血来源的巨核祖细胞体外扩增体系。     

巨细胞病毒对人骨髓粒-巨噬系祖细胞生长的影响

目的探讨人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）对人骨髓粒巨噬系祖细胞集落（ＣＦＵＧＭ）是否有直接抑制作用。方法采用造血祖细胞体外培养技术,研究病毒株ＨＣＭＶＡＤ１６９对ＣＦＵＧＭ生长的影响,用原位聚合酶链反应（ＩＳＰＣＲ）技术检测ＣＦＵＧＭ的细胞内ＨＣＭＶＡＤ１６９ＤＮＡ。结果高浓度ＨＣＭＶＡＤ１６９（２×１０６ｐｆｕ／ｍｌ和２×１０５ｐｆｕ／ｍｌ）在体外能明显抑制ＣＦＵＧＭ的生长（Ｐ＜０．０１）,而低浓度（２×１０４ｐｆｕ／ｍｌ）ＨＣＭＶＡＤ１６９则无此作用,ＨＣＭＶＡＤ１６９对骨髓ＣＦＵＧＭ的抑制作用因其浓度的不同而有差异;经ＩＳＰＣＲ检测发现在ＣＦＵＧＭ的细胞核中存在ＨＣＭＶＡＤ１６９ＤＮＡ。结论ＣＦＵＧＭ是ＨＣＭＶＡＤ１６９的宿主细胞之一,ＨＣＭＶＡＤ１６９对骨髓ＣＦＵＧＭ生长的抑制作用与其对ＣＦＵＧＭ的直接感染有关。     

2项对诊断儿童人巨细胞病毒活动性感染的比较

目的比较血清人巨细胞病毒(HCMV)-IgM抗体(以下简称IgM抗体)与HCMV pp65抗原(以下简称pp65)两种方法对HCMV活动性感染诊断检测的实用意义。方法采集临床疑似HMCV活动性感染儿童血标本91份,分离血浆和多形白细胞,分别用于IgM抗体检测和pp65抗原检测,同时用聚合酶链反应(PCR)检测HCMV DNA,与pp65抗原作平行比较。结果 pp65抗原检测的结果与IgM抗体检测的符合率为70.3%,与HC-MV DNA检测相比,pp65抗原检测的符合率、特异性和敏感度分别为85.5%、70.6%和75.6%,而且高pp65抗原血症与患者临床症状密切相关。结论 pp65抗原血症反映该病毒活动状况,可监测HCMV活动性感染。     

人巨细胞病毒感染巨核祖细胞及反义寡核苷酸抗病毒感染作用的研究

目的探讨人巨细胞病毒 (HCMV)对人巨核细胞及其前体细胞的抑制作用及其机制 ,并观察HCMV反义寡核苷酸 (ASON)的抗病毒感染作用。方法在半固体培养基上定向诱导CD34 细胞向巨核细胞分化。用HCMVAD16 9病毒株感染培养的巨核细胞和经ASON预处理的CD34 细胞 ,观察CFU MK形成率的变化 ,分别用PCR、RT PCR法检测CFU MK细胞中HCMV即刻早期蛋白 (IEP)基因DNA和mRNA、即刻早期基因 (UL36 )mRNA表达。用MTT法测定ASON的细胞毒性。结果CD34 细胞在半固体培养基中定向分化为巨核祖细胞。HCMVAD16 9株能明显抑制巨核细胞的体外增殖 ,与灭活病毒组比较 ,三个不同病毒滴度感染组的CFU MK分别减少了 2 1.6 %、33.8%、4 6 .3% ,显示抑制程度与病毒感染滴度呈剂量依赖关系 ;HCMV感染的CFU MK细胞中可检出HCMVIEP基因DNA、IEP基因mRNA和UL36mRNA。 0 .0 8μmol/L的UL36ASON (UL36Anti)能使HCMV感染细胞CFU MK形成率恢复正常 ,与 10 0 0 0TCID50 HCMV感染组比较 (分别为 5 8.2 4± 7.4 2和 31.17± 4 .4 5 ) ,差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ,RT PCR未能检出UL36mRNA。而改变UL36Anti中 1个碱基的ASON(MM1) ,浓度只有达到 0 .4 0 μmol/L才能对抗HCMV的作用。MTT结果表明UL36Anti显著影响细胞生长的浓度为 90 .0 0 μmol/L。结     

套式聚合酶链反应检测巨细胞病毒的初步研究

目的建立套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）加限制性酶切分析方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）。方法在ＨＣＭＶ直接早期蛋白ＥｃｏＲＩＪＤＮＡ片段内，自行设计两对引物，建立套式ＰＣＲ检测ＨＣＭＶＤＮＡ，同时结合病毒分离检测临床标本。结果２３例新生儿肝炎综合征患儿中，１０例病毒分离及套式ＰＣＲ均阳性；１例病毒分离阴性，但套式ＰＣＲ阳性。对５８例妊娠早期孕妇血标本进行检测，套式ＰＣＲ阳性率为９％，病毒分离阳性率则为７％。结论套式ＰＣＲ加限制性酶切分析是一种临床检测ＨＣＭＶ的快速有效手段，值得临床推广。     

巨细胞病毒即刻早期基因mRNA检测方法的建立

目的建立快速简便的逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）即刻早期（ＩＥ）基因ｍＲＮＡ。方法设计合成跨越ＨＣＭＶＩＥ基因内含子区的一对引物，分别用ＲＴＰＣＲ和ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶｍＲＮＡ和ＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定阳性产物。结果ＨＣＭＶＩＥ基因ｍＲＮＡ表达在感染后６小时即可出现，并持续到感染后至少９６小时，ＲＴＰＣＲ检测的最低敏感性为１００ｆｇ总ＲＮＡ，其他病毒和细胞ＲＮＡ不能被扩增。结论ＲＴＰＣＲ技术检测ＨＣＭＶｍＲＮＡ敏感、特异，有望应用于临床作为ＨＣＭＶ活动性感染的早期诊断方法     

荧光定量聚合酶链反应检测移植受者的巨细胞病毒DNA载量

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测移植后受者的巨细胞病毒感染情况。方法应用定性PCR检测59例骨髓移植受者和9例肝移植受者的150份外周血标本中的巨细胞病毒DNA,比较外周血白细胞和血浆的检出差异;应用实时荧光定量PCR检测上述150份血浆样本和54份对照血浆中巨细胞病毒DNA载量。结果以实时荧光定量PCR为参照,定性PCR检测白细胞的敏感度和特异度分别为62·5%和95·5%;检测血浆的敏感度和特异度分别为57·5%和99·1%。所检测的150份血浆样本中,定量PCR阳性率为26·7%,阳性者其病毒拷贝数介于5·065×102~3·570×105/ml之间;对照组仅1例阳性,且拷贝数小于103/ml。临床调查显示病毒拷贝数大于5×103的患者具有较高的机会发展为巨细胞病毒病。结论实时荧光定量PCR是一个快速、敏感、特异的,可用于监测移植后患者巨细胞病毒感染的方法,帮助临床及早治疗,缩短治疗时间。     

FQ-PCR技术检测新生儿黄疸患者外周血巨细胞病毒

目的采用实时荧光定量PCR技术同时检测新生儿黄疸患者外周血白细胞和血浆中巨细胞病毒，并分析两者之间的相关性。方法采用0.8％氯化胺（NH4Cl）裂解红细胞法提取新生儿黄疸患者外周血白细胞，然后进行实时荧光定量PCR检测，同时检测血浆中巨细胞病毒。结果79例标本中白细胞和血浆均检出巨细胞病毒7例，阳性率为8．86％；白细胞巨细胞病毒定量平均值为4．16（对数值）；血浆平均值为2．37（对数值），经相关性分析，两者呈正相关（r=0．78）。结论荧光定量PCR检测巨细胞病毒快捷、简便、高效；提取白细胞扩增和血浆水平高度相关。     

早期监测人巨细胞病毒激活感染的两种检测方法的比较

目的　探讨人巨细胞病毒 (HCMV)的低基质磷酸化蛋白 (pp6 5 )抗原血症检测与荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)方法 ,对不同人群中HCMV活动性感染的检测价值。方法　用 2种方法对从不同人群 (共 10 6例 )中收集的 2 0 4份血标本进行平行检测比较。结果　HCMVpp6 5抗原血症与血浆中HCMVDNA检测结果的一致性为 84 .8% ,相关性很高 (r=0 .86 1) ;与外周血多形核细胞 (PMNLs)中HCMVDNA检测结果的一致性为 79.8%。6例骨髓移植患者有 5例均在术后 30～ 5 0d间出现HCMVDNA拷贝数增加 ,同一时间PMNLs中HCMVDNA的拷贝数高于血浆 (81 7% )。免疫状况不同群体间HCMV激活程度不同 ,但无论有无免疫能力 ,有症状HCMV感染者HCMVDNA拷贝数平均值(7.71× 10 3 /ml)与HCMVpp6 5抗原阳染细胞数平均值 (10 4个 / 2× 10 5)均大于无症状HCMV感染者(1 5 3× 10 2 /ml;2 7个 / 2× 10 5)。结论　FQ PCR方法对监测低水平HCMV复制更为敏感 ,但HCMVpp6 5抗原血症检测对HCMV病的预测以及对抗HCMV药 (更昔洛韦 )的敏感性均高于DNA检测。两种方法的联合应用对监测HCMV活动性感染、临床疗效及预后更加客观、准确     

Evaluation by polymerase chain reaction of cytomegalovirus reactivation in intensive care patients under mechanical ventilation

Objective The study was undertaken to determine if critically ill patients under mechanical ventilation could reactivate latent cytomegalovirus (CMV) in either lung or blood.Design Prospective study in critically ill patients.Setting The study was performed in a multidisciplinary intensive care unit in a university hospital.Patients 23 non-immunocompromised, mechanically ventilated patients who were anti-CMV immunoglobulin G-positive. Ten immunocompromised patients with active CMV infection and 16 asymptomatic CMV seropositive non-immunocompromised patients constituted the positive and negative control groups.Measurements and results The presence of CMV in blood and bronchoalveolar lavage (BAL) was evaluated by both viral cultures and polymerase chain reaction (PCR). Thirty-seven blood and 22 BAL samples were investigated. Sequential samples were evaluated in 8 patients. For PCR, a 290 bp fragment in the first exon of the immediate early 1 gene was amplified. In order to exclude inhibitors of PCR amplification, a 268 bp fragment of the -globin gene was concurrently amplified in all samples. Viral cultures of blood and BAL were negative in all 23 non-immunocompromised, mechanically ventilated patients. Moreover, no CMV DNA could be amplified in blood or BAL samples, whereas a -globin amplification was observed in all samples.Conclusion In a series of 23 critically ill patients under mechanical ventilation who were seropositive for CMV, no reactivation of CMV in blood or lung was demonstrated.     

荧光定量PCR检测血清巨细胞病毒DNA的临床应用

目的建立一种区分巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)潜伏性感染与活动性感染并适于临床大量标本CMV DNA检测的常规检测方法。方法利用血清作为待检标本,通过优化实验方案,建立血清CMV DNA的荧光定量PCR(fluorogenic quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测方法;并利用FQ-PCR技术对54例疑似CMV感染的患儿(1个月～15岁,抗CMV IgM阳性或IgM与IgG双阳性)及32例患非感染性疾病的患儿(3个月～14岁,抗CMV IgM检查均阴性,部分患儿抗CMV IgG阳性)血清CMV DNA进行检测。结果54例CMV疑似感染患儿中,CMV DNA检测大于1×10~3拷贝/ml者占40.74%,而32例非感染性疾病患儿中,CMV DNA检测大于1×10~3拷贝/ml者只占18.75%,两者比较有显著性差异(P<0.05)。采用FQ-PCR技术,在LightCycler和Rotor-Gene检测仪上检测具有相同的灵敏度,且具有可比性。结论FQ-PCR定量检测血清CMV DNA的方法能够更灵敏地反映CMV活动性感染,假阴性率低,重复性好,结果可靠。FQ-PCR定量检测血清内CMV DNA的方法可作为临床CMV DNA的检测的常规方法。     

尿液上皮细胞中巨细胞病毒载量预测婴儿巨细胞病毒激活感染的价值

目的 探讨尿液上皮细胞(EC)中人巨细胞病毒(HCMV)DNA载量预测婴儿活动性HCMV感染的应用价值.方法 分别收集82例HCMV潜伏感染组和84例活动性感染组婴儿外周血和尿液标本,采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCB)和化学发光免疫分析检测血浆HCMV DNA载量和HCMV IgM/IgG抗体;间接免疫荧光法检测外周血多形核白细胞(PMNLs)中HCMV pp65抗原;UF-100尿沉渣全自动分析仪和FQ-PCR分别做尿液EC计数和HCMV DNA载量检测,并计算尿液EC中HCMV DNA载量.同时,用受试者工作特征曲线(ROC)评价尿液上皮细胞中HCMV DNA载量在婴儿HCMV激活感染诊断中的敏感度和特异度.结果 166例HCMV感染婴儿尿液上皮细胞中HCMV DNA阳性检出率最高,为94.58%(157/166),病毒载量范围为5.67×102-1.31×107拷贝/103EC;不同时段尿液EC中HCMV DNA载量差异无统计学意义(F=0.19,P>0.05);活动性感染组尿液EC中HCMV DNA载量[5.13±0.99(拷贝/103EC,lg)]显著高于潜伏感染组[3.92±0.82(拷贝/103EC,lg),t=8.52,P<0.01];根据ROC曲线,当cut-off值为4.55时,尿液EC中HCMV DNA载量对活动性感染诊断的敏感度和特异度分别为71.4%和75.2%;活动性感染患儿更昔洛韦治疗后尿液EC中HCMV DNA载量显著低于治疗前(t=5.44,P<0.01).结论 尿液EC中HCMV DNA载量用于预测婴儿HCMV活动性感染是一种简便、有效的方法,并能用于治疗监测.