rhBMP2作用下人牙周膜成纤维细胞中OCIF、ODF的表达研究

目的：本研究通过反转录聚合酶链反应来测定不同浓度的重组人骨形成蛋白2（rhBMP2）对人牙周膜成纤维细胞中OCIF、ODFmRNA在不同作用时间点表达的影响,了解rhBMP2对骨改建相关基因的调控方式。方法：原代培养人牙周膜成纤维细胞,取生长良好的第六代细胞,分别用25ng/ml、50 ng/ml及100 ng/ml的rhBMP2作用于细胞,于作用1、3、5、7天后收集细胞。反转录聚合酶链反应检测各组细胞四个时间作用点OCIF、ODF mRNA含量,PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳后,采用Image Pro Plus5.0图像分析软件对电泳胶带亮度进行分析。结果：在rhBMP2作用初期,由于OCIF mRNA的表达快速上升,ODF mRNA的表达缓慢增高,二者的表达差异远大于正常生理水平;随作用时间的延长,由于OCIF mRNA的表达下降,ODF mRNA的表达缓慢增高,二者的表达差异逐渐缩小,在作用末期低于正常生理水平。结论：基于OCIF与ODF二者表达的相对变化,HPDLfs在rhBMP2的作用下可能对破骨细胞的形成在初期表现为较强的抑制,随着作用时间的延长,HPDLfs对破骨细胞的抑制作用逐渐转变成为促进其活化的作用。     

MMP-1在人牙周膜成纤维细胞中的表达

目的：在基因和蛋白水平检测体外培养人牙周膜成纤维细胞（HPDLF）金属基质蛋白酶-1（MMP-1）的表达情况。方法：①收集4～6代体外培养的人PDL细胞,使用PCR方法检测细胞内MMP-1的基因表达;②取细胞外液用Westernblot方法检测MMP-1蛋白表达。结果：PCR结果显示MMP-1在PDL中基因水平上有表达,而Westernblot结果在蛋白水平上也证明了MMP-1在PDL中有表达,结论：体外培养的PDL具有MMP-1的功能。     

成纤维细胞生长因子2对凋亡成纤维细胞中S100蛋白表达的影响

目的观察热损伤后成纤维细胞凋亡模型中,外用成纤维细胞生长因子2(FGF2)对凋亡细胞S100蛋白表达的影响。方法用含体积分数5％小牛血清的DMEM溶液培养已大致融合的成纤维细胞24 h,置入45℃恒温水浴锅中孵育10 min,建立热损伤细胞模型(热损伤组,3瓶),在上述基础上立即加入FGF2(FGF2组,10μg/L,3瓶)。两组细胞继续常规培养30 min后作免疫荧光双标记,利用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)和增殖细胞核抗原(PCNA)以及S100蛋白、磷酸酪氨酸蛋白(P-tyr)、src基因产物蛋白同源的酪氨酸激酶催化功能区-2(SH2-P)表达的变化。结果热损伤组细胞可以同时表达caspase-3蛋白和PCNA两种抗体, 其灰度值分别为140±31、52±8;FGF2组细胞亦见上述两种抗体表达,灰度值分别为75±28、131± 17,PCNA表达量与热损伤组比较,差异有统计学意义(P<0．05)。同时,热损伤组成纤维细胞S100、 P-tyr蛋白、SH2-P蛋白表达阳性,FGF2组细胞S100蛋白和SH2-P的表达明显较弱(P<0．05)、P-tyr 的表达略有减弱。结论离体情况下,热损伤可诱导成纤维细胞凋亡信号的表达;S100蛋白在 FGF2对热损伤导致的凋亡成纤维细胞的增殖和抗凋亡作用中扮演重要角色。     

柚皮苷促进人牙周膜成纤维细胞成骨分化能力的研究

目的:研究柚皮苷对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(HPDLCs)成骨分化能力的影响。方法:组织块法培养原代HPDLCs,加入含不同浓度柚皮苷的培养液(100、10、1、0.1、0.01 mg/L),用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测HPDLCs的培养上清液中ALP的活性,用实时定量PCR检测加入柚皮苷后不同时间点(24h、48h、72h),HPDLCs的骨形成蛋白2(BMP2)、I型胶原蛋白(Col I)、骨保护蛋白(OPG)和核因子κb受体活化因子配体(RANKL)的mRNA表达水平的变化。结果:与对照组比较,不同浓度柚皮苷试验组HPDLCs培养上清液中的ALP活性显著增高(P<0.05),其中1mg/L组的ALP活性最高,此浓度柚皮苷作用下,24h后,BMP-2的mRNA表达水平显著升高,并呈时间依赖性,48h后,Col I和OPG的mRNA表达水平也显著上升。结论:柚皮苷促进了HPDLCs细胞向骨细胞分化功能,其作用可能是通过上调Coll I、BMP2和OPG基因的表达。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞培养中缺氧与缺氧诱导因子-1α表达的相关性

目的研究缺氧程度与瘢痕疙瘩中缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor,HIF－1α）基因表达的量化关系和关联性,进一步探讨缺氧通过HIF-1a途径促进异常瘢痕形成的机制。方法设立不同O2浓度组,在常氧及不同程度缺氧条件下培养瘢痕疙瘩成纤维细胞,应用Western印迹技术检测比较各组间HIF－1α基因蛋白的表达,进行数据处理和统计学分析。结果瘢痕疙瘩成纤维细胞在常氧（20％）、不同缺氧浓度（10％、5％、1％）下．HIF－1α蛋白表达相对含量（HIF－1α／β肌动蛋白）分别为0．007±0．006、0．133±0．006、0．537±0．015和0．903土0．021,表明缺氧系统中瘢痕疙瘩成纤维细胞HIF—1α蛋白表达明显上调。结论缺氧条件促进了瘢痕疙瘩中HIF-1α蛋白的表达,而且表达的量与缺氧程度呈正相关。缺氧通过HIF－1α基因途径与异常瘢痕的形成密切相关。     

瘢痕成纤维细胞α1-4整合素表达研究

目的 了解增生性瘢痕组织内成纤维细胞膜上α１－４整合素粘附分子表达水平,并探讨整合素在瘢痕增生发展过程中的作用及意义。方法 提取增生性瘢痕及正常皮肤组织中的细胞膜蛋白,以免疫斑点杂交检测整合素表达水平;组织标本石蜡切片,以免疫组织化学染色方法显示不同亚型整合素的表达部位。结果 ①从增生性瘢痕组织中提取的膜蛋白内含有相对较高的α１、α２、α３和α４整合素成份;②在正常皮肤及增生性瘢痕组织的表皮基底细     

葡萄糖对人牙周膜成纤维细胞OPG、RANKLmRNA表达的影响

目的：以体外培养的人牙周膜成纤维细胞（HPDLF）为研究对象,观察不同浓度的葡萄糖对HPDLF中骨保护素（OPG）、核因子KB受体活化剂配体（RANKL）mRNA表达的影响,探讨葡萄糖在牙槽骨吸收中的作用。方法：组织块法体外原代培养HPDLF并鉴定,选择4-8代的HPDLF作为实验的靶细胞,不同浓度的葡萄糖（0、5．5、11．1、16．7、22．2、33．3mmol／1）干预HPDLF,半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HPDLF中OPG、RANKL mRNA的表达。结果：高浓度的葡萄糖可下调HPDLF中OPG mRNA的表达,呈剂量依赖性;可上调RANKL mRNA的表达,也呈剂量依赖性,且使RANKL／OPG mRNA的比值随着葡萄糖浓度的增高而呈现持续上升的趋势。结论：糖尿病时,牙周组织中高浓度的葡萄糖,可下调OPG的表达,上调RANKL的表达,使RANKL／OPG的比值升高,调节破骨细胞分化,刺激骨吸收,导致牙槽骨的破坏,加重牙周病的病情。     

α黑素细胞刺激素对人皮肤成纤维细胞作用的蛋白质表达初步测定

目的 观察α黑素细胞刺激素（α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH）对人皮肤成纤维细胞作用的蛋白质表达谱的变化,从整体的蛋白质水平为α-MSH的抗纤维化机制研究提供线索.方法 体外培养人皮肤成纤维细胞,利用固相pH梯度（immobilized pH gradient,IPG）双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）分离人皮肤成纤维细胞α-MSH处理组和对照组的总蛋白质,考马斯亮蓝显色,建立双向凝胶电泳图谱,经PDQuest软件图像分析,选取部分差异表达的蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析获取肽质量指纹图谱,MascotTM软件搜索MSDB数据库鉴定蛋白质.结果 得到分辨率和重复性较好的α-MSH处理组和对照组人皮肤成纤维细胞2-DE图谱.筛选出8个差异表达蛋白质点进行质谱分析,经查询蛋白质序列数据库鉴定为膜联蛋白I、热休克蛋白27和核纤层蛋白A等.结论 人皮肤成纤维细胞在α-MSH作用后蛋白质的表达谱有差异,其差异表达的部分蛋白质功能涉及细胞凋亡、细胞内信号转导及细胞骨架构建等方面的因素,可能与α-MSH的抗纤维化作用有关.     

牛肌腱复合胶原与人牙周膜成纤维细胞培养的实验研究

目的　观察牛肌腱复合胶原三维支架材料 (tendon mixed extraction of bovine collagen,t MEBC)与人牙周膜成纤维细胞的生物相容性 ,探讨其应用于牙周组织工程的可行性。　方法　胎牛肌腱经脱细胞、冷冻 -干燥方法构建复合胶原三维支架载体 ,取 4～ 6代人牙周膜成纤维细胞 (human periodontal ligament fibroblasts,HPDL Fs) ,接种浓度 5× 10 6 / ml与 t MEBC复合材料共培养 ,于培养第 1、3、5及 10天 ,细胞计数法了解细胞附着及增殖情况 ;培养第 5、10天 HE染色、扫描电镜行形态学观察。　结果　 t MEBC具有良好的多孔网状结构 ,HPDL Fs黏附良好 ,复合培养 1d细胞密度达 0 .5 5 6× 10 4 / ml,随培养时间延长细胞增殖明显 ,培养第 10天细胞密度达 3.94 4× 10 4 / ml;组织学检测显示细胞均匀分布于材料内部 ,形成良好的细胞材料复合体。　结论　 t MEBC具有良好的生物相容性 ,可作为支架材料复合HPDL Fs应用于牙周组织工程研究。     

α-促黑素细胞激素在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达和作用

目的检测α－MSH在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达和作用,为研究瘢痕疙瘩的形成机理提供新的理论依据.方法将取自患者躯干部位的瘢痕疙瘩皮肤,用组织块培养法进行成纤维细胞原代培养,DMEM培养液传代、扩增培养,以细胞形态学鉴定成纤维细胞.应用免疫组织化学染色方法检测α－MSH在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达,并应用流式细胞仪从细胞生长及增殖特性方面分析α－MSH对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长和增殖的影响.结果α－MSH能够在瘢痕疙瘩成纤维细胞中得到高表达,浓度为10－6 mmol/L的α－MSH可明显促进瘢痕疙瘩成纤维细胞生长、增殖.结论α－MSH能够在瘢痕疙瘩成纤维细胞中得到高表达,瘢痕疙瘩成纤维细胞对α－MSH的反应性增强表明α－MSH可能在促进瘢痕疙瘩的形成中起着重要的作用.     

α-促黑素细胞激素在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达和作用

目的 检测α-MSH在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达和作用，为研究瘢痕疙瘩的形成机理提供新的理论依据。方法 将取自患者躯干部位的瘢痕疙瘩皮肤，用组织块培养法进行成纤维细胞原代培养，DMEM培养液传代、扩增培养，以细胞形态学鉴定成纤维细胞。应用免疫组织化学染色方法检测α-MSH在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达。并应用流式细胞仪从细胞生长及增殖特性方面分析α-MSH对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长和增殖的影响。结果 α-MSH能够在瘢痕疙瘩成纤维细胞中得到高表达，浓度为10^-6mmol／L的α-MSH可明显促进瘢痕疙瘩成纤维细胞生长、增殖。结论 α-MSH能够在瘢痕疙瘩成纤维细胞中得到高表达，瘢痕疙瘩成纤维细胞对α-MSH的反应性增强表明α-MSH可能在促进瘢痕疙瘩的形成中起着重要的作用。     

肿瘤坏死因子α对瘢痕成纤维细胞生物学作用的实验研究

目的　探讨肿瘤坏死因子α(TNF α)对瘢痕成纤维细胞的生物学作用及其在异常瘢痕的发生和防治中的意义。方法　采用组织培养技术 ,建立了成纤维细胞系 ,以MTT法测定细胞活力 ,流式细胞仪检测纤维粘连蛋白 (FN)表达及间接免疫荧光法等技术和方法。对来源于增生性瘢痕和正常皮肤的成纤维细胞进行了对比研究。结果　①高浓度的TNF α( 10 0 0U/ml　↑ )对增生性瘢痕成纤维细胞活力具有明显抑制作用 ,并使其FN表达减少 11 7% ;②TNF α对正常皮肤成纤维细胞活力具有明显促进作用 ,并使其FN表达增加 5 8%。结论　TNF α对于增生性瘢痕和正常皮肤的成纤维细胞具有不同的生物学作用。研究TNF对增生性瘢痕的调控机制 ,有可能为防治瘢痕的异常增生提供新的方法和途径。     

瘢痕成纤维细胞中cyclin D1、p16的表达及关系研究

目的:了解细胞周期蛋白D1、p16在病理性瘢痕中的表达及它们之间的相互关系,以探讨他们在瘢痕形成过程中的作用。方法:采用免疫组化(SP法)对8例成熟瘢痕、11例增生性瘢痕、11例瘢痕疙瘩及8例正常皮肤组织进行染色,观察CyclinD1和p16在不同组织中的表达。结果:正常皮肤及普通瘢痕成纤维细胞中CyclinD1、p16均为阴性;增生性瘢痕与瘢痕疙瘩成纤维细胞中CyclinD1、p16与正常皮肤相比均有极显著性差异(P<0.05);瘢痕疙瘩成纤维细胞CyclinD1表达高于增生性瘢痕,且有显著性差异(P<0.05);p16在瘢痕疙瘩成纤维细胞的表达比增生性瘢痕为高,但两者之间没有统计学差异.结论:CyclinD1、p16在病理性瘢痕的发生及发展中起重要的作用。在瘢痕疙瘩里p16的细胞抑制作用可能无法与CyclinD1的促细胞增殖作用相拮抗,所以细胞呈现持续增殖状态;而在增生性瘢痕里CyclinD1与p16可能处于相对的平衡状态,所以其生长具有一定的自限性。     

碱性成纤维细胞生长因子对成骨细胞中转化生长因子-β1和碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达的影响

目的　探讨外源性碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对体外成骨细胞中的生长因子 :转化生长因子 β1 (TGF β1 )和bFGFmRNA表达的影响。 方法　将体外培养的新生SD大鼠颅骨成骨细胞 ,用不同浓度的bFGF(5～ 50 μg/L)进行处理 ,利用核酸原位分子杂交 ,检测两种生长因子在细胞中mRNA的表达。结果　依bFGF浓度的增加成骨细胞内TGF β1mRNA表达分别是对照组的 1 .5、1 .6、1 .9和 2 .0倍 ;bFGFmRNA表达则分别是对照组的 1 .2 8、1 .37、1 .40和 1 .51倍。bFGF组中 ,TGF β1和bFGFmRNA的表达量均明显高于对照组 (P <0 .0 1 )。结论　外源性bFGF可以对成骨细胞自分泌bGFG产生影响 ,还能够促进TGF β1的合成     

TGF-β_1影响人牙周膜成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶-1的初步研究

目的：研究转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）在体外对人牙周膜成纤维细胞（human peri-odontal ligament fibroblasts,HPDLFs）分泌基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1,MMP-1）的影响,进而探讨TGF-β1对HPDLFs分泌MMP-1的调控作用,以期为通过生物学途径建立防治正畸过程中牙根吸收的有效方法提供理论依据。方法：原代培养HPDLFs,取传代至第5代HPDLFs实验。设立TGF-β1工作浓度梯度：0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.07ng/ml、0.09ng/ml;0ng/mlTGF-β1为空白对照组;选取4h、8h、12h、24h、48h5个时间点收获上清液。双抗体夹心酶联免疫吸附实验（enzyme-linked-immunosorbent serologic assay,ELISA）法检测各样本中MMP-1含量。采用多元线性回归方法分析实验结果。结果：MMP-1分泌量与TGF-β1作用时间总体上存在时间依赖性,具有统计学差异,P＆lt;0.05。但各作用时间下MMP-1分泌量与TGF-β1工作浓度并没有表现出一致的剂量依赖关系;4h时各实验组MMP-1分泌量随TGF-β1浓度的递增而下降;8h、12h、24h时,各实验组MMP-1分泌量与TGF-β1工作浓度基本呈正相关;48h时各组MMP-1含量变化较大没有明显趋势。结论：MMP-1分泌量与TGF-β1作用时间存在显著时间依赖性,TGF-β1可通过促进MMP-1分泌参与正畸过程中牙根吸收的发生和发展。     

TGF-β1对UVA照射皮肤成纤维细胞HSP70表达的影响

目的:探讨转化生长因子-β1(tansforming gowth fetor-beta 1,TGF-β1)对长波紫外线(ultraviolet A,UVA)照射皮肤成纤维细胞热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)表达的影响.方法:通过酶联免疫法(ELISA)测定不同剂量UVA即对照组(UVA 0J/cm2)、UVA 5J/cm2、UVA 10 J/cm2、UVA 20J/cm2照射成纤维细胞上清液中HSP70的含量;选择UVA照射剂量为15J/cm2,不同剂量TGF-β1即小剂量组(UVA TGF-β1 0.1ng/m1)、中剂量组(UVA TGF-β1 1ng/m1)、大剂量组(UVA TGF-β1 10ng/m1)处理后成纤维细胞HSP70上清液中HSP70的含量.结果:UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞导致HSP70表达下降,UVA 20J/cm2照射组与对照组比较,HSPT0含量明显降低,有非常显著性差异(P＜0.01),OVA 10J/cm2照射组差异有统计学意义(P＜0.05);不同剂量TGF-β1处理后,大剂量TGF-β1,组,皮肤成纤维细胞上清液中HSP70含量明显升高,与照射组比较有非常显著性差异(P＜0.01),中剂量组差异有统计学意义(P＜0.05).结论:UVA照射抑制体外培养成纤维细胞HSPT0表达,TGF-β1可提高UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞HSP70表达水平,对皮肤成纤维细胞起保护作用.     

碱性成纤维细胞生长因子促进人血管内皮细胞αv整合素的表达及意义

血管生成是创伤修复过程的重要环节,已有实验证明碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast grow- th factor,bFGF)可明显加速血管生成,加速血管内皮细胞迁移增殖.我们研究bFGF对αv整合素表达的影响,探讨其促进血管生成,修复创伤的机制.     

TGF-β1对人肾间质成纤维细胞PAI-1表达的影响

近年研究结果显示肾间质病变与慢性肾功能衰竭进展密切相关[1].肾间质纤维化以间质成纤维细胞的大量增殖和细胞外基质的过度沉积为特征.多种细胞因子具有致纤维化的作用,但转化生长因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)可能是最主要的,它可参与肾间质纤维化的各个环节.细胞外基质的合成与降解受多种因素的影响,基质降解酶及其抑制物的平衡是降解过程中主要调节因素.我们以往的研究已显示TGF-β1可促进肾间质成纤维细胞增殖及胶原的合成和分泌[2],我们进一步观察其对基质降解酶的抑制物-纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor type 1,PAI-1)表达的影响.     

α—平滑肌肌动蛋白在瘢痕成纤维细胞中的表达

目的 研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对瘢痕成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的诱导作用。方法 以5例增生性瘢痕为实验组,3例正常瘢痕为对照组,采用成纤维细胞二维培养和三维培养体系及LSAB免疫组织化学染色技术,观察在不同TGF-β1浓度作用下,来源于实验组和对照组的成纤维细胞表达α-SMA的情况。结果 实验组的成纤维细胞,三维培养体系中α-SMA含量明显低于二维培养体系,不同浓度TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞表达α-SMA的作用不同,以5ng/ml的TGF-β1作用最有效;与对照组的成纤维细胞相比,实验组的成纤维细胞在表达α-SMA方面,对TGF-β1的反应更为敏感。结论 在体外,TGF-β1诱导α-SMA在瘢痕成纤维细胞中的表达作用存在着浓度差异;实验组与对照组中的成纤维细胞在细胞性状方面存在差异,对TGF-β1敏感性不同;细胞外基质成分可能会降低TGF-β1的诱导作用,使α-SMA的表达减少。     

肿瘤坏死因子-α和骨形成发生蛋白2诱导成纤维细胞成骨表型表达的体外研究

成纤维细胞的成骨作用已在体内外得到证实。为进一步探索诱导成纤维细胞成骨潜能得以表现的调控因素，以实现体外获得大量成骨型成纤维细胞、形成骨修复材料的设想，采用分离，纯化人皮肤成纤维细胞，使其生长在含不同浓度的ＥＧＦ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＢＭＰ２培养液的干预条件下，采用生物化学，组织化学和电镜观察方法，检测成纤维细胞成骨性标志物形成状况。发现：ＴＮＦ－α和ＢＭＰ２联合应用，可使成纤维细胞分泌碱性磷酸