TAT蛋白转导结构域介导融合蛋白在小鼠活体的跨膜递送作用

目的 探讨跨膜递送短肽--TAT蛋白转导结构域(简称TAT)介导的与其融合的活性蛋白在活体的跨膜递送作用.方法 以融合蛋白GST-TAT-GFP,GST-GFP-TAT和GST-GFP为研究模型蛋白,不经过蛋白质的变性处理、直接通过向小鼠腹腔注射和皮肤涂抹这两种含TAT的融合蛋白及作为对照的融合蛋白GST-GFP,一定时间作用后取体内器官和皮肤做冷冻切片,荧光显微镜检测这些融合蛋白的跨膜递送情况;并对分别融合在C端或者N端的TAT介导GFP在活体动物体内和皮肤的跨膜递送作用进行对比.结果 腹腔注射实验结果表明,TAT可以介导不经过蛋白质的变性处理的融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT跨膜递送进入到小鼠的心脏、肝、肾、脾和肺,甚至脑组织;其中GST-GFP-TAT跨膜递送效率比GST-TAT-GFP更高.结构模拟分析提示GST-GFP-TAT与GST-TAT-GFP中的TAT的暴露情况不同可能是造成两种蛋白跨膜递送活性差异的重要因素.皮肤实验的结果则表明TAT不仅介导融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT进入小鼠表皮,而且使其进入小鼠皮肤的真皮层.结论 TAT可以跨膜递送不经过变性处理的融合蛋白进入小鼠皮肤和体内,递送效率可能与TAT的暴露程度相关;这些结果为在蛋白质疗法方面应用TAT提供了进一步的理论依据.     

大肠杆菌HX88108膜孔蛋白初步研究

为了解大肠杆菌ＨＸ８８１０８耐药机理中有无膜孔蛋白缺失参与,用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）检测了大肠杆菌ＨＸ８８１０８的膜孔蛋白,并与膜孔蛋白标准株进行比较分析。结果发现：大肠杆菌ＨＸ８８１０８具有膜孔蛋白ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ,其耐药与膜孔蛋白缺失所致的抗生素进入减少无关     

反式激活蛋白转导结构域介导绿色荧光蛋白在小鼠体内的跨膜转运

目的探讨HIV-1反式激活蛋白（TAT）的蛋白转导结构域（PAD）介导绿色荧光蛋白（EGFP）在小鼠体内的跨膜转运作用。方法采用PCR及克隆技术构成表这载体pET28a—TAT—EGFP，在大肠杆菌中表达TAT—EGFP融合蛋白。将纯化后的融合蛋白注入小鼠尾静脉，取脑、心肌、肝、脾和肾等器官冰冻切片，荧光显微镜下观察融合蛋白在组织中的分布。结果表达和纯化了分子量为28KD的TAT—EGFP融合蛋白。在小鼠的肝、心肌、脑、肾和脾等组织切片荧光检测呈阳性。结论TAT可介导EGFP在广泛组织内的跨膜转导，这一研究为外源活性大分子物质进入组织细胞提供了一个新的途径。     

正常人胚早期绒毛膜及蜕膜组织中层粘连蛋白和纤维粘连蛋白的定位研究

目的　探讨层粘连蛋白和纤维粘连蛋白在绒毛发生、发育,胎盘的形成、构建过程中的作用。方法　采用免疫组织化学方法观察层粘连蛋白和纤维粘连蛋白在正常人胚早期绒毛膜和蜕膜组织中的分布。结果　层粘连蛋白在正常绒毛上皮基膜、毛细血管内皮基膜、蜕膜细胞及细胞间质内呈阳性表达。纤维粘连蛋白在绒毛间质、毛细血管内皮基膜、蜕膜细胞及细胞间质内呈阳性表达。结论　层粘连蛋白和纤维粘连蛋白是滋养细胞对子宫内膜粘附和侵蚀的重要生物学因素,在绒毛的发生、发育,胎盘形成和构建过程中均起重要作用。     

氧自由基水平变化对体外培养胃癌细胞中P53、ras基因表达的影响

目的:观察H2O2、SOD和膜固思达对人胃癌细胞系MGC-803细胞P53、P21ras蛋白表达的影响,探讨氧自由基在胃癌发生发展中的作用。方法:通过对MGC-803细胞培养并给予一定浓度的H2O2、SOD和膜固思达以调节细胞内氧自由基水平,采用硫代巴比妥酸反应物质法检测细胞内氧自由基中间产物丙二醛(MDA)的含量,应用免疫组织化学技术检测细胞的P53、P21ras蛋白表达的情况。结果:H2O2使细胞内氧自由基水平升高,P53、P21ras蛋白表达增强(P<0.01),SOD和膜固思达降低细胞内氧自由基水平,P53、P21ras蛋白表达减弱(P<0.01)。结论:H2O2、SOD和膜固思达可通过改变MGC-803细胞内氧自由基水平而影响其P53、P21ras蛋白的表达。     

带3蛋白6种跨膜截断体阴离子转运功能的研究

目的 探寻带3蛋白膜段域不同跨膜片段在带3蛋白离子转运过程中的作用。方法 构建编码带3蛋白膜段域片段的重组质粒,将其转入酵母细胞诱导表达,并以蛋白免疫印记及荧光探针的方法检测目的蛋白。结果 拥有前10个跨膜α螺旋的带3蛋白片段TM1—10具有氯离子转运活性,而TM1-8,TM1-9则完全失去功能。此外,删除C末端后16个氨基酸的带3蛋白膜段域片段功能与拥有全长膜段域的带3蛋白相仿。结论 TM10在带3蛋白离子转运功能中发挥重要作用。     

膜连蛋白A2及相关钙结合蛋白与宫颈癌新辅助化疗疗效的相关性

目的 探讨膜连蛋白A2和相关的钙结合蛋白与宫颈癌新辅助化疗疗效之间的相关性,以期寻找化疗前预测肿瘤对化疗疗效的指标.方法 选取因早期巨块型(Ⅰb2和Ⅱa2期)宫颈鳞癌行新辅助动脉化疗和宫颈癌根治术的患者68例,其中36例为化疗有效,32例为化疗无效.采用免疫组化SP法,检测患者化疗前、后宫颈癌组织及间质中膜连蛋白A2及4种相关钙结合蛋白的表达情况.结果 (1)膜连蛋白A2及4种相关钙结合蛋白在化疗后宫颈癌组织的表达均高于相应化疗前癌组织(P均＜0.05).(2)化疗前宫颈癌组织中膜连蛋白A2在化疗有效组中的表达强度低于化疗无效组(P＜0.05),化疗前宫颈癌组织中钙粒蛋白A和B在化疗有效组中的表达强度高于化疗无效组(P均＜0.05).(3)膜连蛋白A2、钙粒蛋白A和B蛋白在化疗后宫颈癌间质中的表达均高于化疗前(P均＜0.05);钙血管蛋白和钙调磷酸酶19在化疗前宫颈癌组织间质中的表达显著高于相应化疗后癌组织(P均＜0.05).(4)化疗前宫颈癌间质中钙血管蛋白在化疗有效组中的表达强度高于化疗无效组(P＜0.05).结论 在巨块型宫颈癌患者行新辅助化疗之前,肿瘤组织中钙粒蛋白A和B的高表达、肿瘤间质中钙血管蛋白的高表达、肿瘤组织中膜连蛋白A2的低表达,可以预测化疗药物的敏感性升高.     

Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性

目的：获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白（GFP）标记的Tat-GFP融合蛋白,探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法：应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,检测不同异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）浓度（0.5和1.0 mmol•L^-1）和不同温度（22℃和37℃）诱导融合蛋白的表达情况;利用Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白,利用GFP特异性抗体采用Western blotting法分析洗脱液中的蛋白;激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。 结果：0.5和1.0 mmol•L^-1 IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的Tat-GFP蛋白量无明显差异;低温（22℃）诱导生产的Tat-GFP蛋白量较37℃更高;Western blotting分析,GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白,条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联;细胞穿膜实验,绿色荧光分布于MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。 结论：低温诱导时大肠杆菌BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高,所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。     

雌二醇对小鼠肝脏铁调素和膜铁转运蛋白表达的影响

目的研究雌二醇（E2）在小鼠铁调素和膜铁转运蛋白表达调节中的作用。方法在不同时间、使用不同浓度雌激素对小鼠进行腹腔注射,应用RT-PCR法检测肝脏铁调素和膜铁转运蛋白mRNA。结果注射50μgE212h和24h后小鼠铁调素表达增加（P〈0.05）,而注射100μgE212h后小鼠膜铁转运蛋白表达也出现上调（P〈0.05）。结论 E2可通过调节小鼠肝脏铁调素和膜铁转运蛋白表达而影响铁代谢。     

正常人胚早期绒毛膜及蜕膜组织中层粘连蛋白和纤维粘连蛋白的定 …

目的 探讨层粘连蛋白和纤维粘连蛋白在绒毛发生，发育，胎盘的形成，构建过程中的作用。方法 采用免疫组织化学方法观察层粘连蛋白和纤维粘连蛋白在正常人胚早期绒毛膜和蜕膜组织中的分布。结果 层粘连蛋白在正常绒毛上皮基膜，毛细血管内皮基膜，蜕膜细胞及细胞间质内呈阳性表达。纤维粘连蛋白在绒毛间质，毛细血管内皮基膜，蜕膜细胞及细胞间质内呈阳性表达。结论 层粘连蛋白和纤维粘连蛋白是滋养细胞对子宫内膜粘附子和侵蚀的     

Annexin I表达下调与鼻咽癌分化转移的关系

目的检测膜联蛋白I（AnnexinI）在正常鼻咽黏膜上皮组织（NNET）、原发鼻咽癌（NPC）组织及颈淋巴结转移鼻咽癌（LMNPC）组织中的表达,探讨其临床病理学意义。方法采用免疫组织化学S-P法检测30例NNET、98例原发NPC组织（高分化鳞癌5例,中度分化鳞癌13例,低分化和未分化癌80例）及20例LMNPC组织中AnnexinI蛋白的表达情况;采用SPSSl3．0软件包对数据进行非参数检验。结果与NNET比较,AnnexinI在原发NPC组织中的表达明显下调（P〈0．05）;与原发NPC比较,AnnexinI在LMNPC中的表达水平明显下调（P〈0．01）;98例原发NPC组织标本中,AnnexinI的表达水平与NPC的病理分化程度、临床分期、复发及局部淋巴结和远处转移有关,AnnexinI低表达的肿瘤较高表达的肿瘤分化差,有更晚的临床分期、更容易复发、更容易发生局部淋巴结和远处转移（P〈0．05or0．01）。结论AnnexinI与NPC的分化程度、转移和预后相关,有望成为预测鼻咽癌转移、预后和区别NPC分化程度的分子标志物。提示AnnexinI在鉴别NPC组织学分化程度、预测鼻咽癌病人预后及预警鼻咽癌转移和复发方面有一定的临床价值。     

AnnexinⅠ在鼻咽癌中的表达及意义

目的：AnnexinⅠ是钙磷脂结合蛋白家族的一员,探讨AnnexinⅠ在慢性鼻咽炎、鼻咽癌组织中的表达及与鼻咽癌多项临床病理特征的关系。方法：采用免疫组织化学SABC法检测Annexin I在慢性鼻咽炎、鼻咽癌组织中的表达。结果：①Annexin I在鼻咽癌组织中的阳性表达率为29.55%,明显低于其在慢性鼻咽炎组织中的阳性表达率93.33%,差异具有显著性（P〈0.01）。②Annexin Ⅰ的表达与鼻咽癌的组织分化程度有关（P〈0.01）,与临床分期、颅神经侵犯、颈淋巴结转移无相关性（P〉0.05）。结论：AnnexinⅠ在鼻咽癌中的表达明显下调,鼻咽癌中Annexin I的表达与组织分化程度密切相关,Annexin I可能与鼻咽癌的发生发展有关。     

Annexin A1在胃癌中的表达及其与胃癌预后的关系

 【目的】 通过检测Annexin A1蛋白在胃癌原发灶和转移灶中表达,探讨Annexin A1表达的病理临床意义及对预后的影响。【方法】 构建组织芯片包含胃癌原发灶及相应的转移灶70对、癌旁组织30例,应用免疫组化方法检测Annexin A1在胃癌组织芯片中的表达,结合病理临床资料及生存资料,分析Annexin A1表达与病理临床参数的相关性。【结果】 Annexin A1在癌旁组织中不表达,在胃癌原发灶中的阳性表达率为4/70(5.7%),淋巴结转移灶中的表达率为17/70(24.3%),差异有统计学意义(P < 0.05)。淋巴结转移灶ANXA1的表达与TNM高分期相关(P < 0.05)。Kaplan-Meier分析显示淋巴结转移灶ANXA1表达阳性组患者生存时间较阴性组短,差异有统计学意义(P<0.05)。logistic回归多因素分析ANXA1表达阳性是胃癌早期死亡的危险因素。【结论】 Annexin A1的表达与肿瘤的远处转移、胃癌患者的早期死亡密切相关。     

Annexin B1分子结构、Ca2+结合位点与进化的分析

目的:研究Annexin B1与其他膜联蛋白的相关性及生物学功能.方法:从Swiss-Prot和NCBI-Structure数据库中已知的膜联蛋白氨基酸序列中,根据物种的分类挑选68个,用生物信息学方法分析Annexin B1的结构、功能与进化.结果:Annexin B1包含4个序列和结构高度相似的结构域,含有8个Ca2 结合位点,二级结构显示蛋白主要由α螺旋结构组成,具有寄生生物所特有的氨基酸残基.在物种进化上,Annexin B1和节肢动物为1支,新杆线虫、植物、鸟类和脊椎动物为1支,原虫、腔肠动物、两栖类和脊索动物为1支.另外,Annexin B1与Annexin A1在进化上有较强的亲缘关系,结构和功能上An-nexin A1和Annexin A5相似.结论:Annexin B1具有膜联蛋白的结构特征,含有抗凝血、参与细胞凋亡、炎性反应、信号转导和细胞分化等细胞生理功能的氨基酸结构域和决定种属特异性的氨基酸序列,在进化上同源于Annexin A1.     

抗β2糖蛋白Ⅰ抗体诱导血液单核细胞表达组织因子活性的机制探讨

目的：探讨抗β2糖蛋白Ⅰ（抗β2GPⅠ）抗体诱导血液单核细胞表达组织因子（TF）活性的机制。方法：利用纯化的抗磷脂综合征（APS）患者血清IgG、单克隆抗β2GPⅠ抗体、抗Annexin A2抗体等刺激血液单核细胞及单核细胞株,通过凝血因子Xa的生成量,判断细胞TF活性的表达;利用Western杂交技术检测单核细胞膜表面Annexin A2的表达;采用免疫细胞化学染色判断单核细胞膜表面Annexin A2、β2GPⅠ、抗β2GPⅠ抗体的结合情况。结果：APS患者血清IgG和抗β2GPⅠ抗体显著增强单核细胞TF的表达;单核细胞膜表达的Annexin A2与β2GPⅠ／抗β2GPⅠ结合成复合物,引发细胞TF表达增强;抗Annexin A2抗体可抑制复合物的这种作用。结论：细胞表面Annexin A2介导β2GPⅠ／抗β2GPⅠ诱导单核细胞表达TF活性,是APS血栓形成的机理之一。     

真核表达质粒pIRES2-eGFP-Annexin A2的构建及其在293T细胞中的表达

目的:构建含有人Annexin A2基因的真核表达质粒plRES2-eGFP-Annexin A2,并在真核细胞293T中表达.方法:将质粒pCMV5.Annexin A2上Annexin A2基因酶切后与真核表达质粒plRES2-eGFP连接,酶切鉴定及测序正确后,脂质体介导法转染293T细胞,荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测其基因和蛋白的表达.结果:构建的质粒plRES2eGFP-Annexin A2转染293T细胞后,目的基因mRNA和蛋白表达均明显增高.结论:成功构建pIRES2-eGFP-Annexin A2质粒并表达蛋白,为研究Annexin A2的生物学功能奠定了基础.     

Annexin A2及相关性疾病

Annexin A2作为钙离子依赖的磷脂结合蛋白,是annexins家族的一个重要成员,可以与多种蛋白和非蛋白物质发生相互作用,在细胞增生、细胞分化、血管新生、胎儿免疫耐受、离子通道活化、细胞与细胞相互作用以及质膜的桥连方面等都起着非常重要的作用,在一些肿瘤与非肿瘤性疾病中也有越来越多有关其表达和/或分布异常的报道.该...     

Annexin I在胃癌中的表达及其临床意义

目的探讨膜联蛋白I（AnnexinI）在胃癌组织中的表达及临床意义。方法收集胃癌患者手术标本88例（研究组）,以相应癌旁组织作为正常对照（对照组）,运用免疫组化检测胃癌及癌旁组织中AnnexinI的表达,并分析其与胃癌临床病理参数之间的关系。结果研究组AnnexinI阳性表达率18．18％显著低于对照组86．36％,差异有统计学意义（P〈0．01）;AnnexinI的表达随着胃癌临床分期演进和浸润深度的增加而下调,各组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）;AnnexinI的表达与胃癌的分化程度相关,分化越差其表达越低,各组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）;且有淋巴结转移的AnnexinI的表达显著低于无淋巴结转移组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AnnexinI的表达下调可能是胃黏膜恶性转变以及胃癌发生浸润转移的重要生物学标志。     

Annexin B1:一种新的细胞凋亡检测用蛋白

目的：为细胞凋亡研究提供一种新的检测用蛋白。方法：在大肠杆菌中表达Annexin B1蛋白，经离子交换层析后得纯品，异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate,FITC)标记Annexin B1；选用Jarkat细胞，羟基喜树碱诱导该细胞凋亡；以FITC标记的Annexin B1检测凋亡细胞。结果：FITC标记的Annexin B1与凋亡细胞膜表面磷脂酰丝氨酸（phos-phatidylserine,PS)结合，使凋亡细胞呈阳性着色，能有效检测细胞凋亡。结论：开发得到了一种新的细胞凋亡检测用蛋白Annextin B1，为推广高效快捷的凋亡检测技术提供国产试剂奠定了基础。     

不同胃癌证型中Annexin V的表达差异研究

目的研究Annexin V在脾胃虚寒、痰食交阻、痰淤互结三种证型中的表达差异，为胃癌辨证提供实验支持。方法采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）免疫组化方法检测55例胃癌组织中Annexin V蛋白；并与慢性胃炎比较，确定其表达特点。结果在三种证型中，Annexin V表达有显著性差异；与慢性浅表性胃炎比较表达也有显著差异。结论Annexin V在不同证型及非肿瘤病变中表达有特异性，可以作为辨证论治的参考依据。