MDR1基因RNA干扰逆转喉癌细胞多药耐药性的研究

目的采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术通过敲减MDR1基因编码的P糖蛋白的表达,逆转人喉癌耐药细胞系（LSC-1,WⅨ）对于化疗药物的多药耐药性（multidrugresistance,MDR）。方法采用表达MDR1shRNA（smallhairpinRNA）的慢病毒载体转染LSC-1/TAX细胞,干扰MDR1mRNA。体外MTT实验观察其对各种化疗药物敏感性,裸鼠荷瘤试验在体检测其对TAX的敏感性,通过免疫组化方法在蛋白水平检测体内外细胞中MDR1基因的表达。结果体外逆转LSC-1／TAX喉癌细胞对多种化疗药物的MDR,裸鼠荷瘤试验显示细胞化疗药物的敏感性被成功回复。免疫组化方法证实MDR1shRNA可以在体内外有效地敲减MDRl基因的表达。结论表达MDR1shRNA的慢病毒载体可以在转录后明显降低MDR1基因的表达,从而提高喉癌细胞对常用化疗药物的敏感性。     

RNA干扰对喉癌细胞MMP-9基因表达的抑制效应及其与瘤细胞增殖活性和侵袭潜能的相关性

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对喉癌细胞基质金属蛋白酶-9基因(MMP-9)表达活性的抑制作用及其与瘤细胞增殖和侵袭潜能的相关性.方法 于MMP-9基因编码区选择1对目标序列(A组)及1对非特异性序列(B组)构建小分子干扰RNA(siRNA)表达元件,转染Hep-2喉癌细胞,以未转染的母代细胞作为对照组(C组),RT-PCR法检测MMP-9 mRNA转录活性,蛋白印迹法检测MMP-9蛋白表达活性,细胞侵袭重建基底膜实验检测细胞体外侵袭潜能.结果 A、B、C组细胞MMP-9mRNA相对表达水平分别为0.51±0.05、0.87±0.09、0.89±0.07,MMP-9蛋白相对表达水平分别为0.29±0.07、0.595±0.11、0.61±0.10,A组的相对表达水平均明显下降(P<0.05);A、B组细胞侵袭抑制率分别为48.0%和11.5%,组间差异有统计学意义(P<0.05),但细胞增值活性却无明显变化(P>0.05).结论 Hep-2喉癌细胞中存在RNAi现象,MMP-9 siRNA特异性抑制MMP-9基因表达,伴随以细胞侵袭潜能明显减弱.     

RNA干扰抑制c-Met表达对喉癌Hep-2细胞体内外生长的影响

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人喉癌Hep-2细胞c-Met基因表达,观察对其体外生物学活性和体内生长的影响.方法 构建能够表达针对c-Met的小干扰RNA的RNAi质粒和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒,采用阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂将其转染人喉癌细胞株Hep-2,通过RT-PCR及Western Blot方法检测转染效率,筛选出抑制效果最好的c-Met-siRNA序列;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、运动实验及侵袭实验比较转染前后细胞的生长、运动及侵袭能力.在裸鼠喉癌皮下荷瘤模型模拟c-Met-siRNA基因治疗实验中,采用Western Blot法检测重组质粒对c-Met基因及MMP-9、VEGF基因表达的影响.结果 pSilencer2.0/c-Met-shRNA转染人喉癌细胞株Hep-2后,c-Met的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P值分别为0.003和0.02),细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制(P值分别为0.001,0.004和0.004).肿瘤接种到裸鼠后第35天,重组质粒组肿瘤体积为(138±27)mm~3,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);重组质粒组瘤体内c-Met、MMP-9、VEGF基因表达率比对照组明显降低(P<0.05).结论 c-Met-siRNA能成功下调靶基因的表达,并能显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动、侵袭及移植裸鼠成瘤后的生长,siRNA表达质粒介导的基因治疗有希望成为喉癌靶向性c-Met治疗的新策略.     

喉癌中微小RNA研究进展

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性、非编码RNA,可以通过抑制靶基因信使RNA(mRNA)的翻译,实现对基因表达的转录后调控作用.近年来发现许多肿瘤的发生与miRNA水平异常有关,miRNA在肿瘤的发生发展中起重要的调控作用.本文对目前有关喉癌中miRNA表达与功能的研究进行总结,希望能为喉癌的进一...     

靶向人端粒酶小干扰RNA对人喉癌Hep-2细胞系形态学影响

目的 探讨靶向人端粒酶基因siRNA对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞形态学的影响。方法 根据人端粒酶基因设计和合成人端粒酶siRNA和随机的siN.C作为阴性对照,通过转染载体Lipofectamine 2000脂质体转染Hep 2细胞,观察形态学结构。结果 转染siRNA 48?h后细胞皱缩、变圆并开始脱落。HE染色显示细胞呈明显的良性转化。透射电镜下可见细胞凋亡、胀亡的形态改变。结论 靶向人端粒酶基因的siRNA能促使Hep-2细胞形态呈良性转化,并能促进肿瘤细胞凋亡。     

喉癌细胞DNA倍体和超微结构研究

本文对48例喉癌标本进行了流式细胞术（flow cytometry,FCM)DNA含量观察并对22全镖 本进行了超微结构研究。探讨了其与预后的关系。结果显示，本组喉癌DNA指数范围在1.0-2.08，异倍体率为77.1%(37/48例），二倍体肿瘤分化好，全部为BroderI级或Ⅱ级，异倍体肿瘤大多为Ⅱ级或Ⅲ级，在电镜下，二倍体肿瘤和异倍体肿瘤细胞亦有不同超微结构改变，二倍体和近二倍体肿瘤的预后好，生存期长，异倍体肿瘤的预后差，生存期短，认为应用FCM分析癌细胞核的DNA含量，对癌的诊断及预后提供了重要的信息。     

RNA编辑酶1 mRNA在喉癌及其癌旁组织的表达及意义

目的:探讨RNA编辑酶1(RNA-dependent adenosine deam inasel,ADAR1)mRNA在喉癌及癌旁组织的表达及意义.方法:采用半定量RT-PCR分别检测51例喉癌患者的癌及癌旁组织ADAR1 mRNA的表达.结果:51例喉癌及其癌旁组织ADAR1 mRNA均有表达,相对表达量分别为2.963±0.912、0.791±0.197,两者间差异有统计学意义(P＜0.01);对照组27例ADAR1 mRNA的相对表达量为0.910±0.311,与喉癌组织比较差异有统计学意义(P＜0.01),与癌旁组织比较差异无统计学意义(P＞0.05).将喉癌组织和癌旁组织A-DAR1 mRNA表达量进行配对t检验,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:ADAR1 mRNA在喉癌组织中表达增高,可能在喉癌的发生机制中起一定的作用.     

长链非编码RNA与喉癌的相关性

长链非编码RNA (lncRNA)属于非编码RNA中的一种,通过影响染色体的重塑、转录和转录后基因表达水平来调节机体功能.近年研究发现,lncRNA与肿瘤的发生、发展有关,并有多种lncRNA在喉癌中表达异常,其可能在喉癌的发病过程中发挥重要作用.本文就lncRNA在喉癌的发生、进展中的作用及机制研究现状进行综述,对其在喉癌的诊断、治疗以及预后方面的应用前景做一展望.     

喉癌血清DBP异质性和癌组织PCNA表达检测及临床意义

应用环关免疫单扩散法及免疫组化技术对４４例喉癌病人血清及３２例癌组织进行血清ＤＢＰ异质性和组织ＰＣＮＡ表达检测，发现各期喉癌病人血清中均存在ＤＢＰ异常表达，并与化疗及复发有关；而与分型，淋巴细胞转移及病理分化无关；且血清ＤＢＰ阳性喉癌组织中ＰＣＮＡ的表达率较高。提示它有较刘的增殖活性，血清ＤＢＰ异质性与喉癌的发生发展有密切关系。     

Bmi-1基因RNAi对喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响

目的:构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,观察其对喉癌细胞Hep-2增殖、侵袭能力的影响。方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL2GFP,构建Bmi-1基因的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1。实时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测稳定转染vshRNA-Bmi-1后喉癌细胞中Bmi-1mRNA及蛋白的表达;克隆形成实验及小室侵袭实验检测喉癌细胞增殖和侵袭能力的变化。结果:稳定转染vshRNA-Bmi-1后Hep-2细胞Bmi-1mRNA表达均明显下降,Hep-2细胞中Bmi-1蛋白表达明显下降。抑制率分别为79%及88%。Bmi-1干扰后Hep-2细胞增殖减慢、侵袭能力减弱。结论:成功构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1mRNA和蛋白在喉癌细胞Hep-2中的表达。Bmi-1基因的RNAi能抑制喉癌细胞Hep-2的增殖和侵袭能力。     

紫外激光诱导组织自体荧光光谱技术诊断喉癌的研究

采用３０８ｎｍＸｅｌｌ准分子激光和４４００ Ｂｏｘｃａｒ信号处理系统，对下沉和癌变和喉组织各２７份样品，在３１０－５５０ｎｍ范围内紫外激光诱导的自体荧光光谱进行分析。结果显示，癌组织与正常组织的荧光光谱的主要区别是４６０ｎｍ欠峰强度的不同，从而导致３４０ｎｍ和４４０ｎｍ两处相对荧光强度比差异。     

pSilencer2.0-c-Met-siRNA基因在裸鼠体内对人喉癌Hep2细胞生长的影响

目的探讨pSilencer2.0 c Met siRNA重组质粒对人喉癌Hep 2细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法采用裸鼠喉癌皮下荷瘤模型模拟c Met siRNA基因治疗实验,观察c MetsiRNA重组质粒的抗瘤疗效,Western blot法检测重组质粒对c Met基因及MMP 2、MMP 9、VEGF基因表达的影响。结果肿瘤接种后第35?d,重组质粒组肿瘤体积为13?827?mm3,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）;重组质粒组瘤体内c Met、MMP 2、MMP 9、VEGF基因表达率比对照组明显降低（P＜0.05）。结论pSilencer2.0 c Met siRNA重组质粒能明显抑制人喉癌Hep 2细胞移植裸鼠成瘤后的生长,siRNA表达质粒介导的基因治疗有希望成为喉癌靶向性c Met治疗的新策略     

RNA干扰技术沉默上皮型钙黏蛋白表达对体外培养的喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的　通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术沉默喉癌He p - 2 细胞上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）的表达,探讨E-cadherin对Hep-2细胞增殖能力的影响。方法　设计、合成特异性小干扰RNA（siRNA）和无基因沉默功能的阴性siRNA转染Hep-2细胞,获得下调E-cadherin基因表达的体外培养的Hep-2细胞;荧光定量PCR检测E-cadherin基因的沉默效果;体外细胞增殖实验（MTT）检测Hep-2细胞体外增殖能力的变化。结果　①重组质粒和脂质体质量体积按1：1转染时,转染效率最高组siRNA-3达65%。②荧光定量PCR：重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-siRNA1、pRNAT-U6.1/Neo-siRNA2、pRNAT-U6.1/Neo-siRNA3使E-cadherin mRNA的表达下调。以空白对照组为基准（设为1）,E-cadherin相对于β-actin的改变倍数siRNA-1组=0.00092,siRNA-2组=0.00143,siRNA-3组=0.00045,阴性对照组=3.44898,差异有统计学意义。③MTT：经特异性siRNA处理的Hep-2细胞生长速度较对照组增快,差异有统计学意义。结论　有效抑制Hep-2细胞E-cadherin mRNA的表达使Hep-2细胞的增殖能力增强。     

喉癌DNA倍体分析的临床意义

本文应用图像分析技术，研究３８例喉鳞癌和２９例喉部良性病变组织中，细胞ＤＮＡ倍体分布状况，分析了其临床意义，结果显示；（１）喉癌组２Ｃ细胞比良性病变组织明业减少，而３Ｃ－４Ｃ细胞，５Ｃ及５Ｃ以上，（以下简称ＤＮＡ５Ｃ－）细胞比后者明显增加，表明喉癌组织中细胞有较强的增殖活性；（２）以ＤＮＡ３Ｃ及３Ｃ以上（以下简称ＤＮＡ３Ｃ－）细胞百分率为指标，在喉癌的诊断和鉴别诊断中有较好的诊断性能，以ＤＮＡ３Ｃ     

小RNA干扰细胞周期蛋白Y基因表达对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的 利用RNA干扰技术下调细胞周期蛋白Y(Cyclin Y,CCNY)基因的表达,观察其对喉癌Hep-2细胞增殖的影响.方法 构建针对CCNY基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,包装慢病毒感染喉癌Hep-2细胞.将细胞分为2组,对照组和实验组(感染CCNY shRNA慢病毒组).运用Real-time PCR检测CCNY在RNA水平的变化;四甲基偶氮唑蓝法和平板克隆形成实验检测CCNY表达下调对细胞增殖的影响.结果 成功包装表达CCNYshRNA的慢病毒并感染Hep-2细胞,shRNA下调CCNY的表达后,与对照组相比CCNY在mRNA水平的表达显著下降,抑制率为75.3％ (P ＜0.05).表达CCNY shRNA的慢病毒感染5d后,继续培养6d,细胞的生长明显受到抑制(P ＜0.001).细胞在体外培养10 d后形成克隆的潜力降低了60％.结论 靶向CCNY基因RNA干扰能够阻抑喉癌Hep-2细胞的CCNY表达,抑制细胞增殖,CCNY基因有望成为喉癌基因治疗靶点.     

喉癌总RNA转染的树突状细胞诱导抗肿瘤免疫的实验研究

目的:探讨转染喉癌总RNA的树突状细胞(DCs)诱导抗喉癌反应的免疫效应.方法:用喉癌细胞总RNA转染从健康人外周血诱导的DCs以制备DCs疫苗,MTT法检测其激活的细胞毒T淋巴细胞(CTLs)在体外对喉癌的特异性杀伤作用.将此特异性CTLs预防性接种于裸鼠皮下,7 d后接种喉癌细胞,观察其移植瘤的发生率;再将此CTLs治疗性接种于已荷瘤裸鼠皮下(治疗组1次,加强治疗组2次),观察移植瘤的生长情况.结果:喉癌细胞总RNA转染的DCs能在体外激活CTLs,该CTLs能在体外诱导针对喉癌细胞的肿瘤特异性免疫杀伤及抑制作用.在CTLs预防性接种裸鼠后,其移植瘤的发生率明显低于对照组(预防组为33%,对照组为100%,P＜0.01);当给荷瘤鼠皮下注射CTLs后,治疗组与加强治疗组移植瘤体积明显小于对照组(P＜0.05或P＜0.01),且加强治疗组移植瘤体积明显小于治疗组(P＜0.05).结论:转染喉癌总RNA的DCs能在体外活化CTLs,此CTLs不仅在体外能诱导特异性抗喉癌免疫反应,而且能在裸鼠体内抑制移植瘤的发生与生长.     

喉癌局部的细胞免疫反应

为更全面地了解喉癌局部细胞免疫状况,收集１４例喉高分化浸润性鳞状细胞癌病例,用箕冰冻切片进行了免疫组织化学染色,以ＣＤ３（Ｔ３／Ｔ总淋巴细胞）,ＣＤ４（Ｔ４／辅助性Ｔ淋巴细胞）、ＣＤ８（Ｔ８／抑制性Ｔ淋巴细胞）、ＣＤ２２（Ｂ淋巴细胞）及ＣＤ６８（吞噬细胞）抗体,标记了五种免疫细胞。结果喉癌局部浸润物免疫细胞主要为Ｔ淋巴细胞,其中以ＣＤ３为最多,其次为ＣＤ８和ＣＤ４细胞,两者中ＣＤ８较ＣＤ４为多,Ｃ