含NURR1基因腺病毒对神经干细胞分化的影响

目的含NURR1基因的重组腺病毒对神经干细胞分化的影响.方法免疫组化观察转染腺病毒后C17.2神经干细胞后分化效率.结果含NURR1基因的重组腺病毒可使C17.2神经干细胞分化后近76%细胞表现为神经元显型.结论含NURR1基因的腺病毒能明显的提高神经干细胞的分化效率.     

骨髓基质细胞源性神经干细胞体外分化及电生理特性的研究

目的探索骨髓基质细胞(BMSCs)诱导分化为神经干细胞(NSCs),比较血清、维甲酸(RA)、胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)及2-巯基乙醇(2-ME)等不同浓度诱导条件下BMSCs分化情况,以及分化细胞的电生理特性。方法以恒河猴骨髓中分离出的BMSCs为实验对象,利用神经干细胞培养基和RA、GDNF、BDNF、2-ME等生长因子在不同血清浓度下进行培养增殖和诱导分化。Nestin、CD133抗体免疫细胞化学染色鉴定NSCs,NSE、β-tublin鉴定神经元、GFAP鉴定神经胶质细胞。膜片钳检测细胞的电生理特性。结果低浓度血清(2.5%)+RA(0.3mg/L)+GDNF(20μg/L)诱导分化效果较好,且分化的神经元样细胞较未分化细胞的膜特性[静息膜电位(RMP)、膜电容(Cm)、串联电阻值(Rs)]有了显著改变(P﹤0.01)。部分形态成熟的神经元样细胞表现出TTX敏感的快速激活、快速失活的电压依赖性的Na+通道,而未分化细胞却未记录到内向电流;两类细胞均可记录到外向的K+电流,但神经元样细胞的电流峰值强度要显著高于未分化细胞,并且包括两种电流成分:瞬时外向K+电流和延迟整流型的K+电流。结论RA+GDNF及配合使用低浓度血清能够有效诱导骨髓源神经干细胞向成熟神经系细胞分化,且分化的神经元样细胞具有快速激活、快速失活的电压依赖性Na+通道,类似神经细胞的电生理特性。     

Wnt-1基因在神经干细胞向神经元分化过程中的表达

目的研究Wnt-1基因在全反式维甲酸(ATRA)诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元过程中的表达及其作用。方法用1μmol/L的维甲酸诱导人胚胎神经干细胞,诱导7d后,做NSE免疫荧光染色,计数分化为神经元的比例。于ATRA诱导前、诱导3d和诱导7d,提取细胞的总RNA。用半定量RT-PCR法检测Wnt-1基因的表达情况。结果与对照组相比,全反式维甲酸能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例(P<0.01)。Wnt-1基因在维甲酸诱导后明显上调(P<0.001)。结论Wnt-1基因在全反式维甲酸诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元的过程中起正调控作用,Wnt-1基因与神经元的分化关系密切。     

Mash1在室管膜前下区神经干细胞向神经元分化中的作用

目的研究Mashl在室管膜前下区(SVZa)神经干细胞向神经元分化中的作用。方法体外分离培养新生0 d昆明小鼠的SVZa神经干细胞,原位杂交检测Mashl在SVZa神经干细胞的表达;构建Mashl与绿色荧光蛋白(GFP)正义、反义融合蛋白表达质粒,转染SVZa神经干细胞,GFP活体荧光标记SVZa神经干细胞;采用细胞计数和流式细胞仪检测在Mashl作用下SVZa神经干细胞分化为神经元的比例。结果体外培养的新生0 d昆明小鼠的SVZa神经干细胞Mashl原位杂交检测阳性;Mashl-GFP 组SVZa神经干细胞分化为神经元的比例明显高于空白对照组;Mashl-GFP-组 SVZa神经干细胞分化为神经元的比例明显低于空白对照组。结论体外培养的新生0 d昆明小鼠的SVZa神经干细胞表达Mashl;Mashl可以促进SVZa神经干细胞向神经元方向分化。     

神经干细胞分化过程中bHLH基因表达

目的 通过检测神经干细胞分化过程中抑制型和激活型碱性螺旋（bHLH）转录调控因子mRNA的表达，探讨神经干细胞定向分化机制。方法 小鼠胎脑细胞原代培养并鉴定。用全反义维甲酸（RA）诱导神经干细胞分化，通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测神经干细胞分化前以及分化后1d、2d、3d、5d和10d时Hesl、Hess、Mashl、Mathl及NeumDmRNA的表达。结果 HeslmRNA在神经干细胞分化前后均表达，无显著差异；HessmRNA随分化时间延长表达下降；NeuroDmRNA和MashlmRNA仅在已分化神经元中表达；MathlmRNA在分化后期表达明显。结论 神经干细胞分化过程中bHLH转录因子mRNA的表达具有明显的时相性，这将为最终揭示神经干细胞分化调控机制提供实验基础。     

Role of brominated diphenly ether-209 in the differentiation of neural stem cells in vitro

Brominated diphenly ether-209 (BDE-209, decaBDE) is among the most common flame retardants. In a previous study, it was confirmed that exposure to BDE-209 can decrease learning and memory in mice. However, it is still unknown whether BDE-209 has an effect on cultured neural stem cells (NSCs). To analyse the role of BDE-209 in the differentiation of neural stem cells, NSCs obtained from neonatal rats were cultured as neurospheres in DMEM/F12 medium that contained different concentrations of BDE-209 for 7 days. BDE-209 was found to inhibit neurite outgrowth and the differentiation of NSCs into neurons in a concentration-dependent manner. BDE-209 also enhanced the ratio of differentiation of NSCs into glial cells.     

脊髓神经干细胞培养及体外诱导分化实验研究

目的探讨胚胎大鼠脊髓神经干细胞(SNSCs)的分离培养及体外诱导分化的特点和规律。方法利用无血清培养技术和细胞免疫化学方法。结果在表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的作用下,SNSCs快速增殖,形成多细胞组成的细胞球,将这些细胞球分离成单细胞重新培养,单个的细胞又很快变成细胞球。虽然白血病抑制因子(LIF)不是SNSCs培养所必需的,但是它可明显促进SNSCs增殖。诱导分化实验显示:SNSCs可分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞,而LIF组则分化很少。结论从胚鼠脊髓分离神经干细胞是可行的,这些细胞在体外经多次传代后仍具有较强的增殖能力和多向分化潜能;LIF可以促进SNSCs增殖并抑制其分化。     

外源性Ang Ⅱ诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究

目的在体外成功分离培养并扩增神经干细胞（NSCs）的基础上,研究外源性血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）对NSCs向多巴胺（DA）能神经元分化的影响。方法（1）分离培养新生1d SD大鼠脑组织NSCs,免疫细胞学方法测定NSCs特异性标志物神经上皮干细胞蛋白（Nestin）表达及其分化为神经元、神经胶质细胞的能力;（2）按培养液中Ang Ⅱ的浓度不同,分5个浓度（100、200、400、600、800nmol/L）对第二代NSCs进行诱导分化。10d后采用免疫细胞学方法检测DA能神经元标志物酪氨酸羟化酶（TH）和神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,半定量RT-PCR（SQ-PCR）测定分化细胞中TH mRNA的相对表达量。结果外源性Ang Ⅱ诱导提高NSCs向TH阳性细胞分化的比率,TH mRNA相对表达量亦增加,以Ang Ⅱ浓度为400nmol/L及600nmol/L的诱导效果最明显,TH阳性细胞率分别为10.77%和11.34%,TH mRNA相对表达量分别为（0.4023±0.0515）和（0.3971±0.0319）,两组间比较无统计学意义（P〉0.05）;其中400nmol/L Ang Ⅱ组分化细胞中GFAP阳性细胞率高于对照组,有统计学意义（P〈0.05）。结论外源性AngⅡ促进NSCs向DA能神经元分化,在400～600nmol/L浓度范围内AngⅡ的诱导效能更显著;AngⅡ促进NSCs向DA能神经元分化的机制可能与同时促进星型胶质细胞（AS）分化有关。     

大鼠雪旺氏细胞支持人胚胎神经干细胞的生长并诱导其分化

目的 探讨大鼠雪旺氏细胞对人胚胎神经干细胞生长和分化的作用。方法 实验分为三组：组一：干细胞生长于培养雪旺氏细胞1天后的培养液中；组二：干细胞与雪旺氏细胞共培养；组三：干细胞生长于DMEM／F12培养液中，观察干细胞的形态学变化和免疫荧光的.组一的神经球分化生长，绝大多数细胞tubulin-β阳性，少数为GalC或GFAP阳性；组二中，在雪旺氏细胞生长密集和稀少的地方，干细胞分别表明为不分化和明显分化两种状态；组三的神经干细胞无法正常生长。结论 大鼠雪旺氏细胞分泌物支持人胚胎神经干细胞的生长并诱导其分化。     

神经干细胞转染酪氨酸羟化酶基因后的分化

目的 探讨神经干细胞（NSCs）转梁酪氨酸羟化酶（TH）基因后的分化。方法 从胚胎16天Wistar大鼠室管膜前下周围区分离、增殖、鉴定NSCs；将TH基因和缺陷性逆转录病毒载体N2A构建成真核表达质粒，以电穿孔将其转入PA317包装细胞内；收集PA317包装产生的逆转录病毒颗粒，感染体外培养的NSCs，经G418筛选，获得成功转染TH基因的NSCs克隆；分别以0.4ng/ml bFGF和5％胎牛血清诱导转染及未转染TH基因的NSCs分化，比较TH基因转染及不同诱导方式对NSCs分化的影响，同时在分化细胞内检测TH的表达。结果 以0.4ng/ml bFGF诱导可使95％以上的NSCs分化为神经元，而5％FBS诱导则大多分化为神经胶质细胞，无论是否转染TH基因，神经元及神经胶质细胞的分化比例不成生改变；TH基因转染后能在神经干细胞的子代细胞内高效、稳定表达。结论 TH基因转染不影响NSCs的分化潜能，TH能在神经干细胞的子代细胞中有效表达0.4ng/ml bFGF诱导可以促使NSCs分化为神经元。     

脂肪干细胞诱导神经干细胞分化的体外实验研究

目的研究脂肪干细胞（ADSCs）体外诱导神经干细胞（NSCs）分化的作用。方法从新生BALB／c小鼠中分别分离获得ADSCs及NSCs,进行体外培养和传代。构建ADSCs与NSCs共培养体系,以单纯NSCs组为对照,进行ADSCs诱导分化研究。共培养4、8、12d后行神经元特异性神经丝200免疫组化鉴定,统计NSCs分化为神经元的百分率。结果共培养后8—12d,可见大量成熟神经元,大多为多极神经元,少部分为双极神经元或假单极神经元,带有较长的轴突。共培养组NSCs分化为神经元的百分率大约为21％,而单纯NSCs培养组约为4％。共培养组神经元的转化率与单纯NSCs培养组神经元的转化率之间有显著性差异（P〈0．05）。结论ADSCs在体外能够促进NSCs向神经元转化。     

Time-sensitive effects of hypoxia on differentiation of neural stem cells derived from mouse embryonic stem cells in vitro

Abstract

Objectives:

Oxygen tension is an important component of microenvironment for the differentiation of embryonic stem cells including neural lineage. However, the comprehensive influence of hypoxia on neural differentiation during embryonic neural development has not yet been examined.

Methods:

In this study, we investigated the effect of low oxygen levels (5% O₂), or hypoxia, in two stages of neural differentiation in vitro: (1) inducing mouse embryonic stem cells into neural stem cells (NSCs); and then (2) inducing NSCs into neural progenitor cells in neurospheres.

Results:

In the first stage, NSCs generation was reduced under hypoxia. Less mature morphological changes (including neural marker) of NSCs were observed, suggesting the prevention of early differentiation under hypoxic conditions. Thus undifferentiated stem cells were maintained in this stage. However, in the second stage, hypoxia induced neural differentiation in neurospheres. Nevertheless, non-neural progenitor cell formation, such as mesoderm progenitor cell lines or epithelial cell lines, was restricted by low oxygen tension.

Discussions:

Our results demonstrate that hypoxia is essential for regulating neural differentiation and show the different effects on NSC differentiation dependent on the time-course of NSC development. In the early stage of NSCs induction, hypoxia inhibits neural differentiation and maintains the undifferentiated state; in the later stage of NSCs induction, hypoxia induces neural differentiation. Our study may contribute to the development of new insights for expansion and control of neural differentiation.