膀胱癌化疗中纤维连接蛋白介导的药物耐受研究

纤维连接蛋白 (ＦＮ)与肿瘤的浸润、生长、转移有密切的关系。Ｄａｍｉａｎｏ等[1]发现 ,多发性骨髓瘤细胞粘附于包被ＦＮ的培养板后 ,对化疗药物的敏感性降低 ,将其称为细胞粘附介导的药物耐受(ＣＡＭ ＤＲ)。我们的实验检测了膀胱肿瘤细胞与ＦＮ粘附后对化疗药物敏感性的变化。一、材料与方法1 实验材料 :膀胱癌细胞株Ｔ2 4购自中科院上海细胞所 ;ＭＴＴ、丝裂霉素Ｃ(ＭＭＣ)均购自美国Ｓｉｇｍａ公司 ;ＦＮ与小牛血清 (ＢＳＡ)购自美国ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司 ;ＡＮＮＥＸＩＮⅤ试剂盒购自Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ公司。∑ 960型酶标仪、…     

膀胱癌患者测定尿纤维连接蛋白的临床意义

为了探讨尿液纤维连接蛋白（Ｆｎ）与膀胱癌生物学行为的关系，采用ＥＬＩＳＡ法检测５０例膀胱癌、３０例其他泌尿生殖系疾病患者及２０例正常人的尿液Ｆｎ含量。结果发现：膀胱癌病人尿液Ｆｎ含量为０．６８±０．４９μｇ／μｍｏｌＣｒ，明显高于正常人０．１０±０．０４μｇ／μｍｏｌＣｒ及其他泌尿生殖系疾病患者的０．２０±０．１０μｇ／μｍｏｌＣｒ。尿Ｆｎ与肿瘤分期分级也有关。膀胱癌病人术后尿液Ｆｎ为０．２１±０．１１μｇ／μｍｏｌＣｒ，明显下降。提示尿液Ｆｎ含量可作为膀胱癌的诊断、估计预后及疗效监测的指标。     

膀胱癌基底膜层粘蛋白,胶原蛋白Ⅳ与纤维连接蛋白分布表达的？…

目的 探讨膀胱癌基底膜中层粘蛋白，胶原蛋白Ⅳ与纤维连接蛋白分布表达的相关性。方法 用免疫组织化学方法测定３５例膀胱移行上皮癌和３例低分化鳞状上皮癌肿瘤组织基底膜层粘蛋白（ＬＮ），胶原蛋白Ⅳ（ＣｏｌⅣ）和纤维连接蛋白（ＦＮ）含量与分布，结果病理级别高，浸润性生长的膀胱移行上皮癌，基底膜ＬＮ，ＣｏｌⅣ和ＦＮ一样，阳性染色少，分布不连续，反之，病理级别低，非浸润性生长的肿瘤，基底膜ＬＮ，ＣｏｌⅣ也和Ｆ     

三种逆转剂对人膀胱癌多药耐受相关蛋白介导的多药耐受逆转的研究

目的：观察环孢霉素Ａ（ＣｓＡ）、维拉帕米（Ｖｅｒ）、黄体酮（Ｐｒｏｇ）对膀胱癌多药耐受相关蛋白（ＭＲＰ）介导的多药面受（ＭＤＲ）的塑转作用。方法：分别采用ＭＴＴ方法和流式细胞仪检测观察ＣｓＡ、Ｖｅｒ和Ｐｒｏｇ塑转化疗药物ＶＣＲ对ＭＲＰ高表达的膀胱癌细胞的细胞毒性作用的塑转效果。以及地细胞内柔红霉素（ＤＮＲ）聚集、外排的影响。结果：ＣｓＡ和Ｖｅｒ作为多药耐受糖蛋白（Ｐｇｐ）的良好剂同样可以显著逆转ＶＣＲ对Ｍ％ＲＰ高表达的ＥＪ／ＭＲＰ细胞毒性作用,具有增加ＥＪ／ＭＲＰ细胞内ＤＮＲ的聚集百的作用。剂量越大作用越强;而Ｐｒｏｇ则无类似作用。结论：ＣｓＡ和Ｖｅｒ对人膀胱癌ＭＲＰ介导的ＭＤＲ具有良好的逆转作用。可通过增加细胞内的药物聚集和减少外排已进入细胞内的药物起作用。这种作用存在剂量依从关系。     

尿液纤维连接蛋白糖链结构在膀胱癌患者中的变化及意义

目的寻求诊断膀胱癌的检测新方法。方法收集8例膀胱癌患者术前和术后3个月（正常）尿液标本16份，提纯纤维连接蛋白（Fn），辣根过氧化物酶（HRP）标记的凝集素作探针，连接到已固定在膜上的Fn糖链，检测已结合的HRP代表Fn糖链与凝集素的结合力，增强化学发光法（ECL）检测已结合HRP的结合力。高效液相（HPLC）和荧光标记底物测定膀胱癌和癌旁正常组织N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（GnT）活力。结果用伴刀豆球蛋白凝集素（ConA）-HRP作探针时，膀胱癌尿液Fn结合力仅为正常膀胱尿液Fn的0．18，而用蔓陀罗凝集素（DSA）-HRP和麦胚凝集素（WGA）-HRP作探针时，膀胱癌组的结合力为正常组的3．34倍和3．26倍。膀胱癌患者尿液中FnN-糖链的天线数和平分型GlcNAc结构都升高。尿Fn与WGA的结合力与病理分期、分级相关。膀胱癌组织GnT-Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的酶活力比癌旁正常组织分别增加34．0、18．1和1．6倍。结论凝集素-HRP检测分析尿液Fn的N-糖链结构改变有可能是一种简单和精确诊断膀胱癌的方法。     

纤维连接蛋白在膀胱癌中的分布及BCG膀胱灌注后的变化

应用免疫组化技术对３２例膀胱癌１２便ＢＣＧ灌注前后及１０例正常人膀胱和癌组织中的纤维接蛋白（Ｆｎ）分布进行了观察，结果显示：正常膀胱组织中Ｆｎ分布于基底膜及粘膜下组织，上皮层无Ｆｎ；膀胱癌中基底膜Ｆｎ有不同程度丧失，分化差，浸润癌中基底Ｆｎ丧失明显；ＢＣＧ灌注后，膀胱粘膜中基底膜Ｆｎ裸露，基膜Ｆｎ增多。     

膀胱癌多药耐受相关蛋白和P53的表达及相关性分析

目的 :分析膀胱癌多药耐受相关蛋白 ( MRP)、突变型 P53( mt P53)的表达及两者的相关性。方法 :利用链霉亲和素生物素酶复合物法 ( SABC法 )检测了 93例膀胱癌和 1 0例正常膀胱粘膜的 MRP、mt P53表达 ,并分析了两者表达的相关性。结果 :膀胱癌与正常膀胱粘膜间的 MRP、mt P53表达差异分别有显著性意义 ( P <0 .0 5)和极显著性意义 ( P <0 .0 1 ) ;MRP和 mt P53表达具有较强的相关性 ( r=0 .682 ,P <0 .0 1 )。结论 :膀胱癌 MRP、mt P53的表达显著增强 ,两者表达具有密切的相关性。     

流式细胞仪在膀胱癌多药耐受研究中的应用

目的：探讨流式细胞仪（ＦＣＭ）在膀胱癌多药耐受研究中的应用。方法：利用蛋白质印迹,免疫细胞化学和ＦＣＭ检测并比较膀胱癌多药耐受细胞ＥＪ／ＭＲＰ的多药耐受糖蛋白（Ｐ－ｐｇ）和多药耐受相关蛋白（ＭＲＰ）的表达;利用ＦＣＭ检测了ＥＪ／ＭＲＰ药物耐受的功能水平。结果：ＥＪ／ＭＲＰ高表达ＭＲＰ,无明显Ｐ－ｇｐ表达,ＦＣＭ的检测结果与蛋白质印迹,免疫细胞化学的结果一致,但检测更简便,功能检测显示柔红霉素（ＤＮ     

尿纤维连接蛋白试纸诊断膀胱尿路上皮癌的价值

目的 研究尿纤维连接蛋白试纸（FN试纸）诊断膀胱尿路上皮癌的灵敏度和特异度,探讨其与膀胱尿路上皮癌各项临床指标之间的关系,为进一步无创性地诊断、随访膀胱尿路上皮癌提供依据.方法 运用自主研制的FN试纸测定膀胱尿路上皮癌患者、良性泌尿系疾病患者、正常体检人群尿液纤维连接蛋白.结果 FN试纸诊断膀胱尿路上皮癌的敏感度和特异度分别为72.94%和79.03%,其阳性预测值和阴性预测值分别为85.67%和68.06%;尿液细胞学诊断膀胱尿路上皮癌的特异度较高（100%）,但其敏感度仅为47.06%.结论 FN试纸检测对不同分化及浸润深度的膀胱尿路上皮癌有着较高的灵敏度与特异度,诊断价值高于尿液液基细胞学检查,但不能对膀胱肿瘤的分级以及病灶数量进行检测.     

反义核酸对膀胱癌细胞系多药耐药性的逆转效应

目的 探讨多药耐药性逆转的新方法。方法 应用基因重组方法构建能转录出ｍｄｒ１ ｍＲＮＡ反义ＲＮＡ的逆转录病毒质粒,然后将该质粒导入膀胱癌耐药细胞系中,测定转染细胞对不同药物的耐药性,观察反义核酸对ＭＤＲ的逆转效应。结果 耐药细胞经导入反义核酸逆转录病毒质粒后,对阿霉素（ＡＤＭ）、秋水仙素（ＣＯＬ）的ＩＣ５０显著降低（Ｐ〈０．０１）;细胞膜上Ｐ－糖蛋白（Ｐ－ＧＰ）染色信号显著减弱。结论 反义核酸是逆     

转染XIAP基因对丝裂霉素诱导膀胱癌细胞凋亡的影响

目的：探讨XIAP基因对低剂量丝裂霉素C(MMC)诱导膀胱癌细胞凋亡的影响。方法：脂质体介导XIAP基因转染膀胱癌T24细胞3天后．用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测XIAP基因的表达．用低剂量MMC诱导细胞凋亡启动,用MTT比色法分析检测癌细胞生长活性．用3末端脱氧核苷酰转移酶介导生物素标记法检测细胞凋亡率。结果：各组癌细胞在低剂量MMC的诱导下发生凋亡、与单用MMC组比较．转染XIAP基因的癌细胞组的凋亡率显著降低。结论：XIAP基因在癌细胞中的过度表达可以明显降低化疗药物诱导的膀胱癌细胞凋亡,其可能在膀胱癌多药耐药中起一定作用。     

Cell adhesion to fibronectin induces mitomycin C resistance in bladder cancer cells

OBJECTIVE

To investigate whether cell adhesion to fibronectin induces drug resistance in human bladder cancer cells, and to study the survival signalling pathway in cell adhesion to fibronectin‐mediated chemotherapy resistance in vitro.

MATERIALS AND METHODS

T24 cells (human bladder cancer cell lines) were pre‐coated with fibronectin, and treated with mitomycin C (MMC) and the specific phosphoinositide‐3 kinase (PI3‐K) inhibitor LY294002. The apoptosis and cell cycles were analysed. The activity of the caspase‐8, ‐9 and apoptosis‐inducing factor (AIF) apoptosis pathways were assessed using colorimetric assay, immunofluorescence, Western blot and flow cytometry. The expression of glycogen synthase kinase‐3β (GSK‐3β) and cyclin D1, as the key regulator of G1/S phase transition, were determined by Western blot. The expression of PI3‐K, Akt, phospho‐Akt and β1‐integrin were also examined by Western blot.

RESULTS

Apoptosis induced by MMC was significantly resisted by fibronectin adhesion in T24 cells, and this effect was through inhibition of the caspase‐9 and AIF apoptosis pathways, but not the caspase‐8 pathway. Fibronectin antagonized MMC‐induced G0/G1‐phase arrest by inactivating GSK‐3β to stabilize cyclin D1 expression in T24 cells. Furthermore, fibronectin‐mediated protection of T24 cells was dependent on the activity of the PI3‐K/Akt signalling pathway, and the protection could be abolished by the PI3‐K inhibitor LY294002.

CONCLUSIONS

Fibronectin‐mediated PI3‐K/Akt activation protects T24 cells from MMC‐induced cell death through inhibition of both caspase‐9 and AIF‐mediated apoptosis and GSK‐3β/cyclin D1 involved G0/G1‐phase arrest.     

蛋白激酶C-α在调节人膀胱癌T24细胞多药耐药中的作用

目的探讨蛋白激酶C-α(PKCα)对人膀胱癌T24细胞多药耐药的调节作用。方法将载有PKCα基因的表达质粒GFP-PKCα导入人膀胱癌细胞系T24。应用噻唑蓝(MTT)比色法,检测T24/PKCα及亲本细胞对阿霉素的敏感性,以及在激活(10nmol/LPMA2h)和抑制(10nmol/LCalphostinC2h)PKCα的情况下,T24/PKCα细胞对阿霉素敏感性的变化。同时用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药基因-1(MDR-1)、多药耐药相关蛋白(MRP)和肺耐药相关蛋白(LRP)基因的表达。结果转染了PKCα基因后,T24细胞对阿霉素的耐药性增强(耐药指数7.52,P<0.05)。PKCα的激活显著提高了T24细胞的耐药性(耐药指数153.78,P<0.01),而抑制PKCα活性则使耐药指数降至1.20(P>0.05)。T24/PKCα的MDR-1表达水平是亲本细胞的2.28倍(P<0.01)。激活PKCα可使MDR-1基因表达水平较亲本细胞升高12.80倍(P<0.01),抑制PKCα则MDR-1表达下降(P>0.05),而MRP和LRP基因表达水平并无明显变化(P>0.05)。结论PKCα可能通过上调MDR-1表达,在人膀胱癌的化疗耐药中起到了重要的作用。     

体外膀胱灌注噻替哌和丝裂霉素C的药效学研究

目的　探讨体外膀胱灌注噻替哌和丝裂霉素Ｃ 药物浓度和作用时间对膀胱癌细胞杀伤作用的影响。　方法　用不同浓度的抗肿瘤药物与人膀胱移行细胞癌细胞系ＢＩＵ８７ 共同培养至一定时间，采用ＭＴＴ 比色法测定细胞存活率。　结果　细胞存活率与二药的药物浓度和作用时间均呈明显的线性相关（ Ｐ＜ ０ ．０１） ，而且主要与浓度有关；当超过一定作用时间后，存活率仅与药物浓度呈负相关（ Ｐ＜ ０ ．０１） 。　结论　只有保证有效的作用时间，尽量增加药物剂量和有效浓度，才能显著提高膀胱腔内化疗效果，减少复发。     

膀胱肿瘤抗药机制的实验研究

应用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的基因转移技术，将人ＭＤＲ１－ｃＤＮＡ导入ＥＪ膀胱癌细胞，经６０、１２０和２４０μｇ／Ｌ秋水仙素的逐级筛选，挑出两个耐药的克隆细胞系，分别培养在２４０μｇ／Ｌ或４８０μｇ／Ｌ秋水仙素的培养基中，命名为ＥＪ－Ｒ２４０或ＥＪ－Ｒ４８０。对照组ＥＪ膀胱癌细胞在６０μｇ／Ｌ秋水仙素的培养基中不能生存。Ｓｏｕｔｈｅｎ、ＲＮＡ斑点杂交分析和免疫组化分析显示，人ＭＤＲ＿１－ｃＤＮＡ已整合在转染细胞的基因组中，并有相应的ｍＲＮＡ和蛋白产物Ｐ－糖蛋白的表达。药敏试验结果显示ＥＪ－Ｒ２４０和ＥＪ－Ｒ４８０对秋水仙素的耐受性分别是对照组的７３．６和８４．２倍。资料表明，ＭＤＲ＿１基因及其产物Ｐ－糖蛋白的过度表达可赋予转染细胞的抗药表型。因此，本研究不仅从基因水平上证实ＭＤＲ＿１基因及Ｐ－糖蛋白的异常表达可能是膀胱癌耐药性产生的一个重要途径或机制，同时也为研究ＭＤＲ＿１基因介导的多项耐药以及寻找有效的逆转途径提供了一个理想的实验模型。     

AP-1反义寡聚脱氧核苷酸逆转人膀胱癌耐药细胞多药耐药的实验研究

目的 观察以激活剂蛋白-1(AP-1)位点为靶序列的特异性反义寡聚脱氧核苷酸(a-sODNs)对人膀胱癌耐药细胞株多药耐药性的逆转作用。方法 设计针对谷胱甘肽(GSH)生物合成的限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因启动子区域AP-1序列的特异性asODNs，用阳离子脂质体包被后转染人膀胱癌细胞株BIU87及其多药耐药(MDR)亚株BIU87／A，然后分别用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法[以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照]、荧光分光光度法、MTT法等检测AP-1-asODNs对两株细胞γ-GCSmRNA表达、细胞内GSH水平及其对6种抗癌药物肿瘤细胞抑制率的变化。结果 AP-1-asODNs转染72h后，BIU87和BIU87／A细胞的γ-GCS mRNA的表达和细胞内GSH的水平均出现下降。同时6种抗癌药物对反义转染后的两株细胞的抑制率大部分都有所提高。结论 γ-GCS特异的AP-1-asODNs可通过降低细胞内的GSH水平增强膀胱癌细胞对化疗的敏感性，逆转肿瘤细胞的耐药。     

丝裂霉素C与C2-神经酰胺联合应用治疗膀胱癌

目的 观察丝裂霉素C（MMC）与C2-神经酰胺（C2-cer）联合应用对人膀胱癌细胞的作用效果，并探讨其机制。方法 不同浓度MMC与C2-cer单独及联合作用于人膀胱癌BIU-87细胞后，应用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞生长抑制率，计算合用指数（CI），流式细胞仪（FCM）检测BIU-87细胞凋亡率，吖啶橙（AO）荧光染色观察凋亡形态学变化，Western blot检测细胞色素C在细胞内分布变化，并检测Caspase-3活性改变。结果 单独应用时MMC与C2-cer的中效浓度分别是159和28μmol／L，联合用药时下降为55和11μmol／L，CI=0．74。MMC与C2-cer单独及联合应用均可导致BIU-87细胞出现凋亡的形态学变化。两种药物联合应用时的凋亡率高于各自单用（P＜0．05）。线粒体细胞色素C含量在MMC与C2-cer单独及联合应用时均较对照组减少，联合用药时减少最为明显，细胞质内细胞色素C含量在联合用药时增加也最为明显（P＜0．05）。Caspase-3活性在MMC与C2-cer单独及联合应用时均较对照组升高，联合用药时升高最为明显（P＜0．05）。结论 MMC与C2-cer联合应用可以通过共同诱导细胞凋亡，协同抑制膀胱癌细胞生长。线粒体细胞色素C释放和Caspase-3活性变化可能发挥重要作用。     

浸润性膀胱癌术前动脉化疗的疗效分析

目的　评价术前动脉化疗对浸润性膀胱癌预后的影响。　方法　回顾性总结经手术、病理证实并获随访的 6 0例浸润性膀胱癌患者资料。 6 0例分为术前动脉化疗组 (30例 )和单纯手术组(30例 )。术前动脉化疗组经髂内动脉灌注化疗药物后 1～ 2周内接受手术。分析比较两组膀胱保留率、术后复发率、转移率和生存率的差异。　结果　术前动脉化疗组膀胱保留率达 80 % ,单纯手术组4 3% ;动脉化疗组术后肿瘤复发率 2 5 % (6 / 2 4 ) ,单纯手术组 6 1% (8/ 13) ,差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。术前动脉化疗组 1、2、3、4和 5年生存率分别为 93%、82 %、6 7%、5 8%、4 8% ,高于单纯手术组的86 %、6 8%、5 6 %、4 6 %、35 % ,差异均有显著性意义 (P <0 .0 5 )。但两组间术后转移率差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。　结论　术前动脉化疗安全有效 ,可以显著提高浸润性膀胱癌的治疗效果。