哺乳动物RNA干扰中小干扰RNA载体表达策略及其表达盒

RNA干扰是一种典型的转录后基因调控方法，也是体内抵御外在感染的保护机制之一。在哺乳动物功能基因组学及病毒感染性疾病和肿瘤治疗研究中具有很大的应用前景。构建在细胞内稳定表达小干扰RNA的载体因价廉、稳定、操作方便，被认为是一种较理想的产生RNA干扰的方法，目前广泛应用于哺乳动物RNA干扰研究中。本文对小干扰RNA载体的表达策略及其表达盒作一阐述。     

哺乳动物RNA干扰中的小干扰RNA表达载体

载体表达小干扰RNA的方法因便宜,稳定,操作方便的优点,在哺乳动物RNA干扰研究中有非常大的潜力和优势。本文对当前哺乳动物RNA干扰研究中的小干扰RNA表达用载体作一综述。小干扰RNA载体表达方法的广泛应用,将对功能基因组研究以及抗病毒和肿瘤的基因治疗产生深远的影响。     

哺乳动物RNA干扰中的小干扰RNA表达载体

载体表达小干扰RNA的方法因便宜，稳定，操作方便的优点，在哺乳动物RNA干扰研究中有非常大的潜力和优势。本文对当前哺乳动物RNA干扰研究中的小干扰RNA表达用载体作一综述。小干扰RNA载体表达方法的广泛应用，将对功能基因组研究以及抗病毒和肿瘤的基因治疗产生深远的影响。     

应用干扰RNA慢病毒技术抑制人脑胶质瘤细胞中红细胞生成素受体mRNA的表达

目的探讨重组红细胞生成素受体(EPOR)干扰RNA慢病毒抑制人脑胶质瘤细胞中EPOR mRNA的表达情况。 方法选择人脑胶质瘤U251细胞株和人胚肾293T细胞株为研究对象。利用RNA干扰技术构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,进行病毒包装、病毒收集、病毒滴度检测后,感染人脑胶质瘤U251细胞,选择最佳MOI值;采用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)检测U251细胞和感染重组EPOR干扰RNA慢病毒的U251细胞EPOR mRNA相对表达量,并计算重组EPOR干扰RNA慢病毒对于U251细胞EPOR mRNA表达的干扰效率。 结果①本研究成功构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,并测定其病毒滴度为1×10¹⁴TU/L。②MOI值为100的重组EPOR干扰RNA慢病毒感染U251细胞的荧光蛋白表达量最高,MOI值为1的荧光蛋白表达量最低。③重组EPOR干扰RNA慢病毒对于U251细胞的干扰效率为69%,并使EPOR mRNA表达明显受到抑制。 结论成功构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,使U251细胞的EPOR mRNA相对表达量明显降低,为后续EPOR转录水平变化的相关研究奠定实验基础。     

RNA干扰技术的研究进展

RNA干扰已经成为敲除特定基因表达的重要工具。将一段双链RNA序列导入机体或细胞中，使具有同源序列的基因表达受到抑制。由于这是一种在RNA水平上的基因表达抑制，也称之为RNA干扰，简称RNAi。该项技术的优点在于不仅可用于研究基因的功能，还可以研究药物干预的候选染色体或者筛选疫苗的靶基因。在哺乳动物细胞，RNAi技术已经成为研究基因功能的有利工具，并有望在今后对疾病的治疗中发挥重要作用。本文对RNAi技术的研究进展综述如下。     

RNA干扰在哺乳动物病毒感染中的作用

RNA干扰(RNAi)作为高效的基因阻断技术在抗病毒研究中已取得很大成果,内源性RNAi机制在低等生物中的病毒免疫作用已经明确,但在哺乳动物病毒感染中的研究仍处于探讨阶段,病毒编码小干扰RNA(siRNA)是否存在仍有争议,而由微小RNA(miRNA)介导的RNAi在调节病毒和宿主细胞相互关系中则发挥着重要作用.     

RNA干扰技术及其在胰腺癌研究中的应用

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指一些小的双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）通过特异性降解与其同源的RNA而高效地阻断体内特定基因表达的现象。到目前为止，RNAi现象已经被发现广泛存在于植物、线虫、果蝇、哺乳动物等多种生物体细胞中，使这些生物能够抵御病毒的感染、阻断转座子的作用等。由于RNAi能特异性地抑制某一基因的表达，目前已经广泛应用于抗肿瘤、抗病毒等的治疗研究以及一些基础研究领域。现主要就近年来RNAi技术在胰腺癌研究中的应用进行综述。     

RNA干扰的基础研究和临床应用前景

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是在mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程.在哺乳动物中发现的21-23核苷酸的双链RNA(小干扰RNA)开启了siRNA的治疗应用可能.目前RNA干扰对于病毒感染、癌症和基因病等表现出广阔的应用前景.就RNA干扰的作用机制、临床应用及应用中存在的障碍等方面综述该领域的研究进展.     

RNA干扰的基础研究和临床应用前景

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是在mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。在哺乳动物中发现的21—23核苷酸的双链RNA（小干扰RNA）开肩了siRNA的治疗应用可能。目前RNA干扰对于病毒感染、癌症和基因病等表现出广阔的应用前景。就RNA干扰的作用机制、临床应用及应用中存在的障碍等方面综述该领域的研究进展。     

干扰性小RNA对HCV RNA复制的干扰作用

丙型肝炎因其较高的发病率和极其严重的后果日益受到人们的关注,但针对性治疗又相当有限。近年的研究表明,干扰性小RNA(siRNA)可以通过降解双链RNA起到抗病毒作用,从而为丙型肝炎的治疗提供了一种新的思路和方法。本文对RNA的干扰作用及siRNA干扰HCV RNA复制的研究状况作了综述。     

SARS冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶的原核和真核表达

目的:在大肠杆菌中表达和纯化重组RDRP蛋白,观察RDRP蛋白在293细胞中的表达及亚细胞定位.方法:构建原核表达质粒pGEX-4T-1-RDRP,实现插入基因的融合表达,经GST亲合层析纯化蛋白.构建真核表达载体pCMV-myc-RDRP瞬时转染293细胞,转染48 h后免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察蛋白表达及定位以及Western Blotting检测.结果:成功构建了表达RDRP融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌内高效表达,纯化后得到分子量约为121 kDa的融合蛋白.RDRP蛋白在293细胞中高效表达,主要分布在细胞质.结论:获得了重组GST-RDRP融合蛋白,为进一步探讨RDRP的功能奠定基础,在真核细胞中过表达的RDRP蛋白主要定位在细胞质.     

RNA expression as a prognostic tool in idiopathic nephrotic syndrome

Approximately 90% of children with nephrotic syndrome have idiopathic nephrotic syndrome. Idiopathic nephrotic syndrome includes three histologic types: minimal change disease, mesangial proliferation and focal segmental glomerulosclerosis. These diseases have similar clinical presentation but different prognosis. The aim of this review is to summarize the genetic knowledge related to idiopathic nephrotic syndrome, follow the progression of these diseases and to offer a survey of the gene expression pattern changes and their functional classification. Different types of RNA expression analysis methods, such as the northern-blot assay, the ribonuclease protection assay, the RNA in situ hybridization, the quantitative RT-PCR and the RNA expression microarray technology are discussed. Previous studies emphasize the importance of the following gene groups in the idiopathic nephrotic syndrome: genes involved the DNA synthesis and repair, growth factors, extracellular matrix proteins, extracellular ligand receptors, extracellular signal transduction, metabolic and transport process and immune regulation are frequently dys-expressed in idiopathic nephrotic syndrome. With the development and spread of the microarray technology these genes can be used as a compliment to the conventional diagnostic method.     

Viral and host determinants of RNA virus vector replication and expression

Positive-strand RNA viruses have proven to be valuable vectors for delivery and expression of antigens for direct vaccination of animals and vaccine production in plants. However, optimal use of these viruses as vectors for vaccine and other purposes is limited by incomplete understanding of their replication pathways and associated constraints on inserted foreign genes. Further insights into RNA virus vector design and optimization are emerging from recent advances on the function of viral RNA replication factors, the nature of the viral RNA replication complex as a membrane-bounded compartment sequestering replication components from competing processes and host defenses, and identification of surprisingly diverse host genes contributing to many virus replication steps.     

修复基因hMTH1反义RNA真核表达载体的构建

目的 构建人修复基因hMTH1反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T.方法 提取人胚肺成纤维细胞(HLF)总RNA，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hMTHI基因cDNA保守序列，经pGEMT载体克隆后双酶切，将cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-Cl，构建hMTH1基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T，并转染细胞。用Western-blot法检验载体抑制hMTH1蛋白表达的效率。结果 经RT-PCR获得423bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为hMTH1基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T，测序后确证。该载体转染细胞后，可使hMTH1蛋白水平下降约46％。结论 成功构建hMTH1基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T.     

子痫前期患者胎盘中Lnc RNA表达谱的差异分析

目的 分析子痫前期患者(PE)和正常妊娠者胎盘组织中长链非编码RNA( lncRNA)表达谱的差异.方法 选取在广西壮族自治区人民医院产科就诊的12 例PE患者和12例正常妊娠者.利用 Affymetrix lncRNA 芯片检测其中3 例PE患者 和3 例正常妊娠者胎盘中lncRNA 和mRNA 表达,GO 及Pathway 分析差异表达的lncRNA 功能分布,构建lncRNA-mRNA 的共表达网络,筛选可能与PE相关lncRNA,并应用qPCR进行芯片结果验证.结果 PE患者胎盘中差异表达大于1.5倍的 lncRNA 共有26 个,其中上调有 9个,表达下调有 17个,其中GSTT1上调最显著,ENST00000384564下调最显著;差异表达超过1.2倍的mRNA有 208 个,其中上调 87个,下调121 个,其中TREML2上调最显著,而CYTL1下调最显著.GO分析显示,差异表达的mRNA主要参与先天免疫反应、炎症响应、免疫响应、凝血等生物学过程;pathway分析显示,差异表达的mRNA主要参与吞噬体形成通路、Fc受体介导的吞噬通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等信号通路.lncRNA-mRNA共表达网络分析找到了NR_038877、NR_002794等可能与PE发病相关的lncRNAs.qRT-PCR 验证了ARPC3、PIK3CG、CLEC4M、FCGR1A、CYBB、NCF4在PE组显著下调;n340778、n342887、n345093、n346352、NR_002794、NR_038877、NR_039741在PE组显著上调,与芯片结果相一致.结论 子痫前期患者胎盘中lnc RNA表达谱发生显著变化,其可能参与了PE的发病过程.     

环境胁迫下细菌非编码小RNA对基因表达的调控

细菌非编码小RNA(sRNA)是长度约为50~500个核苷酸的RNA分子,其编码基因位于基因间区域,在细菌基因组中可被转录但不被翻译为蛋白质。随着生物信息学和RNA测序技术的发展,sRNA功能受到广泛关注。在不断变化的环境中,细菌遇到各种各样的生存压力,sRNA通过感应环境变化调节相应基因的表达,在细菌适应环境的过程中发挥了重要作用。本文对环境胁迫下细菌sRNA的表达变化和其对基因的表达调控进行综述,揭示sRNA对细菌基因转录后调控、生物适应性进化等生命过程的重要意义。     

长链非编码RNA MALAT1在子宫内膜癌中的表达及临床意义

目的探讨子宫内膜癌组织中长链非编码RNA MALAT1的表达及临床意义。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测榆林市神木县医院2009年9月至2010年9月确诊的104例子宫内膜癌患者新鲜子宫内膜癌组织标本及其对应的癌旁2 cm组织标本中MALAT1的表达,分析其与子宫内膜癌的临床病理特征关系以及诊断价值和预后关系。结果 MALAT1在子宫内膜癌组织中的表达明显高于子宫内膜癌旁组织(P0.05);MALAT1在子宫内膜癌高、中分化组和低分化组中的阳性表达差异无统计学意义(P0.05);MALAT1在子宫内膜癌组织中的表达与淋巴结转移、肿瘤浸润深度以及血管侵袭相关,差异均有统计学意义(P0.05);ROC曲线AUC=0.7314(95%CI,0.6141~0.8487;P0.05);MALAT1高表达和低表达组在总生存时间OS(χ2=7.269,P0.05)及无进展生存时间PFS(χ2=5.182,P0.05)上的差异有统计学意义。结论长链非编码RNA MALAT1在子宫内膜癌中是高表达的,可以作为子宫内膜癌的新型生物标记物和诊断靶标。