体外培养的人眼小梁细胞的观察

自1986年来，我们共培养99只人眼的小梁组织，原代培养成活率为18.2％，其中供体年龄小于2岁者成活率22.5％；在24h内取材者为27.3％。共传14～16代，细胞生长呈有限性。成活的小梁细胞在第3～7代生长最快，细胞形态与活体小梁细胞相似。研究这些细胞将有助于我们了解小梁细胞形态和功能变化的特点。     

体外培养的人眼小梁细胞的观察

自１９８６年，我们共培养９９只人眼的小梁组织，原代培养成活率为１８．２％，其中供体年龄小于２岁者成活率２２．５％；在２４ｈ内取材者为２７．３％。共传１４～１６代，细胞生长呈有限性。成活的小梁细胞在第３～７代生长最快，细胞形态与活体小梁细胞相似。研究这些细胞将有助于我们了解小梁细胞形态和功能变化的特点。     

人眼组织小梁网细胞的体外培养及鉴定的新方法

目的探讨人原代小梁网细胞的体外培养,以及利用其特性建立一种鉴定小梁网细胞的新方法。方法从眼球破裂伤病人的眼球以及角膜移植后剩余的角膜环分离出小梁网组织,利用组织块贴壁法以及消化法对人原代小梁网细胞进行体外培养。倒置显微镜下观察细胞生长状态并利用CCK8法检测其生长速率。利用细胞免疫荧光技术对所培养的细胞进行纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、层黏连蛋白、水通道蛋白-1等蛋白的染色鉴定。并利用100 nmol/L地塞米松对所培养的细胞诱导10 d,通过荧光定量PCR和western blotting方法检测myocilin的表达水平以确定所培养的细胞是否为小梁网细胞。结果小梁网组织块贴壁培养1~2周后,开始有细胞从组织块旁向外长出,并逐渐增多。传代后小梁网细胞在第1~4天生长较快,第5~7天生长速度有所减慢,但依然显著高于第4天（P < 0.01）。所培养的细胞纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、层黏连蛋白、水通道蛋白-1的免疫荧光染色均呈阳性。地塞米松诱导后,与对照组相比,小梁网细胞中myocilin mRNA和蛋白表达水平均明显上升（P < 0.01）。结论本实验中所培养的细胞通过对其特点进行检测,确定所培养的细胞为人原代小梁网细胞。     

体外培养人眼小梁细胞吞噬乳胶微粒观察

应用体外培养的人小梁细胞,观察其吞噬乳胶微粒的能力。结果显示吞噬过程开始４小时内,吞噬功能随时间延长而增强;但吞噬过久细胞则出现变性或死亡。电镜示吞噬微粒后的细胞呈“激惹”状态。结合小梁细胞功能,对吞噬过程的重要性进行了讨论。     

牛眼前房小梁细胞体外培养的建立

牛眼前房小梁细胞体外培养的建立杨新光，李美玉，张东杲（唐都医院眼科西安７１００３８北京医科大学北大医院眼科）关键词细胞培养；小梁网；牛眼中图号Ｒ７７５．２前房角小梁网是房水排出的主要途径，也是目前认为原发性开角型青光眼的主要病变所在．房水流出通道的大...     

人眼小梁组织及体外培养的人眼小梁细胞SPARC mRNA及其蛋白表达

目的:研究人眼小梁组织(TM)及体外培养的人眼小梁细胞(TMCs)是否可以表达酸性富含胱氨酸分泌型蛋白(SPARC) mRNA及SPARC蛋白. 探讨SPARC蛋白在原发性开角型青光眼(POAG)发病机制中的作用. 方法:分别采用RT-PCR和Western-Blot方法,对小梁组织和细胞进行检测,用抗SPARC蛋白免疫荧光染色方法对细胞进行染色. 结果:组织和细胞RT-PCR均在300 bp处出现预期的电泳条带,组织和细胞Western-Blot在Mr为43×103处出现蛋白条带. TMCs抗SPARC免疫荧光染色表现为胞质均匀着色. 结论:TM组织及体外培养的人眼TMCs均可表达SPARC mRNA及其相关蛋白,并起着调节细胞外基质(ECM)的生成和降解作用.     

人眼小梁细胞组织培养及超微结构观察

以体外组织块培养的方法成功地建立了三个人眼小梁细胞系标本。在倒置显微镜下观察了三代小梁细胞的生长过程，用透射和扫描电子显微镜观察了第三代融合的小梁细胞的超微结构。小梁细胞的生长潜伏期约为１周，原代和传代融合的小梁细胞呈单层细胞生长，单个细胞呈长而扁平状，核位于中央为椭圆形，细胞表面大部分平滑，偶有微绒毛突出，在某些部位可见邻近细胞和其胞突间紧密连在一起。另外，这些细胞还具有高代谢细胞的超微结构特征包括大量的线粒体，发达的Ｇｏｌｇｉ器，丰富的粗面内质网和明显的溶酶体。人小梁细胞体外培养为进一步研究小梁细胞的功能提供了非常有价值的实验物质基础，还可作为青光眼发病学和药物筛选等方面实验研究的基础。     

体外培养人眼小梁细胞黏附分子CD44s的表达

目的 探讨黏附分子CD44s在体外培养人眼小梁细胞（HTC）的表达及其与小梁细胞结构和功能的关系。方法 对体外培养的HTC应用流式细胞术和RT-PCR法检测CD44s的表达。结果 HTC高表达CD44s黏附分子，阳性细胞数达92％以上，而且均表达CD44s mRNA。结论 体外培养的HTC表达CD44s黏附分子。CD44s与其配体透明质酸（HA）的协同性调节HTC的内环境并在维持其结构和功能方面起重要作用。     

Apoptosis of Human Trabecular Meshwork Cells Induced by Transforming Growth Factor-p2 in vitro

Summary: Whether transforming growth factor-β2 (TGF-β2) induces apoptosis of human trabecular meshwork cells was investigated in vitro. Cultured 3-5 passage human trabecular meshwork cells were treated with 0 (control), 0.32, 1, 3.2 ng/ml TGF-β2 for 48 h and divided into control group and experimental group. The apoptosis of human trabecular meshwork cells was examined by transmisson electron microscopy, TUNEL technique and flow cytometry. The results showed characteristic morphologic changes of apoptotic cells were observed under transmission electron microscopy.DNA fragmentation of human trabecular meshwork cells was found by TUNEL technique. Quantitative analysis of flow cytometry showed that percentages of apoptotic human trabecular meshwork cells were (2.79±0.44) %, (4.43±1.17) % and (9. 60±2.05) % respectively with different concentrations [1 ng/ml (P＜0. 05), 3.2 ng/ml (P＜0.01)] of TGF-β2 with the difference being significant between experimental group and control group[(1. 41±0.34) %]. It was concluded that TGF-β2 can induce apoptosis of human trabecular meshwork cells in vitro and may be involved in the decrease of trabecular meshwork cells in the patients with primary open angle glaucoma and aging of normal people.     

开放式压力控制培养系统对人眼小梁细胞超微结构及纤维连接蛋白合成的影响

目的采用开放式压力控制培养系统，研究压力对人眼小梁细胞（HTMCs）超微结构及纤维连接蛋白（FN）合成的影响。方法组织块法体外培养HTMCs，选取第5代细胞分为实验组和对照组。对照组不施加压力，实验组采用开放式压力控制培养系统分别施加20、40、608、0 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）的压力，压力作用时间分别为12、24、36 h。在光学显微镜、透射电镜下观察HTMCs形态及超微结构的变化。采用免疫组化方法和图像分析法检测FN的表达变化。结果透射电镜显示：20 mmHg压力作用12、24、36 h后与对照组比较，HTMCs超微结构未见明显改变；40mmHg压力作用12、24、36 h后HTMCs胞质内出现大小不等的空泡；60、80 mmHg压力作用12、24、36 h后，HTMCs出现线粒体嵴变得短而少或者丧失、溶酶体髓样结构增多等不可逆性改变。免疫组化结果显示体外培养的HTMCs均阳性表达FN；图像分析显示：20 mmHg压力作用12、24、36 h后HTMCs合成FN与对照组比较差异均无显著性意义（均P〉0.05）；40 mmHg压力作用12、24、36 h后HTMCs合成FN明显增加，差异均有显著性意义（均P〈0.01）；而60、80 mmHg压力作用12、243、6 h后HTMCs合成FN则逐渐下降（均P〈0.01），但与对照组比较仍有不同程度增高（均P〈0.01）。结论环境压力升高可以引起小梁细胞形态、超微结构以及FN的表达发生变化，从而可能在原发性开角型青光眼的发生和发展过程中发挥重要作用。     

Antagonistic Effects of Tranilast on Proliferation and Collagen Synthesis Induced by TGF-β2 in Cultured Human Trabecular Meshwork Cells

Whether tranilast had antagonistic effect on proliferation inhibition and collagen synthesis promotion induced by TGF-β2 in cultured human trabecular meshwork cells was investigated. Suspension of 1 × 104 cultured human trabecular meshwork cells of 3-5 passage was distributed in each well of a 96-well disk and divided into control group and experimental group. After 24 h, 0 μg/ml (control), 12.5 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml tranilast with 3.2 ng/ml TGF-β2 were added into the incubation medium. Another 24 h later, proliferation and collagen synthesis in cultured human trabecular meshwork cells were examined respectively by using tetrazolium-based semiautomated colormetric (MTT) assay and 3 H-proline incorporation with liquid scintillation technique. The results showed absorbance (A) values of the experimental groups were 0. 9036 ± 0. 3017, 1.1361 ±0.1352, 1.2457 ±0.1524 according to the different concentrations of tranilast, and 0. 8956 ±0. 1903 of the control group. In comparison with the control group, 25 μg/ml (q′= 3. 23, P＜0.05), 50 μg/ml (q=4.70, P＜0.01) tranilast significantly antagonized the decrease of the A values induced by TGF-β2 in the cultured human trabecular meshwork cells. In comparison with the control group [817.37±124.21 cpm/104 cells], 12.5 μg/ml (620.33±80.46 cpm/104 cells, q′=4.26, P＜0.05),25 μg/ml (594. 58±88.13 cpm/104 cells, q′=4. 81, P＜0.01), 50 μg/ml (418. 64±67.90 cpm/104 cells, q′=8.62, P＜0.01) tranilast significantly inhibited the incorporation of 3 H-proline into the cultured human trabecular meshwork cells promoted by TGF-β2 in a dose-dependent manner. It was concluded that tranilast had the antagonistic effect on the proliferation inhibition and collagen synthesis promotion induced by TGF-β2 in the cultured human trabecular meshwork cells.     

Existence of Heme Oxygenase-carbon Monoxide-cyclic Guanosine Monophosphate Pathway in Human Trabecular Meshwork Cells In Vitro

To confirm the existence of heme oxygenase (HO)-carbon monoxide (CO)- cyclic guanosine monophosphate (cGMP) pathway in the cultured human trabecular meshwork cells (HT-MCs) in vitro, and to evaluate the inductive role of heroin on this pathway, HTMCs of the third to fourth generation were cultured in vitro. Reverse transcripase-polymerase chain reaction (RT-PCR) was employed for detection of HO-1 and HO-2 mRNA. Immunohistochemical staining was used to detect HO-1 and HO-2 proteins. Hemin was added into the culture solution. The HO-1 mRNA levels were quantified by RT-PCR. The relative amount of carbon monoxide released into the media was measured with the quantifying carbon monoxide hemoglobin (HbCO) by spectrophotometry.Radioimmunoassay was used to determine changes of cGMP in HTMCs. The results showed that cultured cells had the specific characteristics of HTMCs. Both HO-1 and HO-2 genes were expressed in HTMCs, as well as HO-1 and HO-2 proteins in HTMCs. Hemin induced HO-1 mRNA,HbCO and cGMP in a dose-dependent manner. In conclusion, HO-CO-cGMP pathway exists in the cultured HTMCs and can be induced by hemin. Pharmacological stimulation of HO-CO-cGMP pathway may constitute a novel therapeutic approach to rescuing glaucoma.     

Transforming Growth Factor-β_2 Gene Cloning and Protein Expression in Human Trabecular Meshwork Cells

Primary open- angle glaucoma (POAG) is aleading cause of blindness,which involves optic neu-ropathy accompanied by characteristic visual field de-fects and is often associated with elevated intraocularpressure due to disturbance ofaqueoushumor outflowthrough the trabecularmeshwork (TM) .The patho-physiology of the TM in POAG has been character-ized by an increasein extracellularmatrix componentsand a decrease in the number of TM cells[1,2 ] .It hasbeen found that,compared with the non- P…     

地塞米松抑制培养牛眼小梁细胞AQP1表达

目的测定地塞米松对体外培养牛眼小梁细胞水通道蛋白-1(aquaporin1,AQP1)表达的影响,探讨糖皮质激素性青光眼房水引流阻力的形成机制。方法将传3代的牛眼小梁细胞用数字表法随机分为对照和地塞米松处理组。将不同浓度的地塞米松(10-5、10-6、10-7mol/L)分别加入培养液持续培养14 d,免疫细胞化学方法检测小梁细胞AQP1表达水平,计算机图像分析软件测量细胞表面积。结果经不同浓度地塞米松处理后的小梁细胞AQP1表达量吸光度值A显著低于对照组(均P=0.000)。10-7mol/L地塞米松作用下细胞表面积显著大于对照组,而10-6mol/L和10-5mol/L地塞米松作用下细胞表面积显著低于对照组(均P=0.000)。结论地塞米松抑制牛眼小梁细胞AQP1表达,可能参与了糖皮质激素性青光眼的发生。     

体外培养人眼小梁细胞血红素氧合酶-1的表达及其抗氧化损伤作用

目的探讨体外培养人眼小梁细胞是否存在血红素氧合酶-1（HO-1）的表达及其抗氧化损伤作用。方法体外培养人眼小梁细胞，应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测小梁细胞中HO-1 mRNA的表达，免疫组织化学和Western blot方法对HO-1蛋白进行检测。向细胞培养液中加入H2O2，RT—PCR和Western blot检测小梁细胞HO-1 mRNA和蛋白的变化。分别预先加入HO-1诱导剂氯化血红素（Hemin）和抑制剂锌原卟啉Ⅸ（ZnPP—Ⅸ）1h后，通过MTT法检测小粱细胞在400μmol／L H2O2作用时的存活率。结果人眼小梁细胞存在HO-1 mRNA和蛋白。H2O2对小梁细胞HO-1 mRNA和蛋白的诱导呈浓度依赖性。Hemin可浓度依赖性地提高小梁细胞在H2O2作用时的存活率，HO-1抑制剂ZnPP—Ⅸ则浓度依赖性地降低小梁细胞在H2O2作用时的存活率。结论人眼小梁细胞存在HO—1，并可被H2O2所诱导。HO-1表达升高可提高小梁细胞抗氧化损伤的能力。     

压力对人眼小梁细胞自分泌TGF-β2的影响

目的 采用开放式压力控制培养系统研究压力对体外培养的人眼小粱细胞自分泌转化生长因子-β2（TGF-β2）的影响，探讨TGF-β2在原发开角型青光眼发病机制中的作用。方法 体外培养人眼小梁细胞并传至第5代。对照组不施加压力（0mmHg，1mmHg=0．133kPa），实验组施加20、40、60及80mmHg压力，分别持续0、12、24、36h。采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法测定细胞上清液中TGF-β2浓度。结果 小梁细胞自分泌TGF-β2随压力增高而增加，与对照组比较，差异有显著性意义（P〈0．05）；在20～60mmHg范围内，加压时间越长，TGF-β2增高越明显；虽然80mmHg压力水平下TGF-β2增高幅度下降，但加压12和24h组TGF-β2水平仍明显高于对照组（P〈0．05）。结论随压力增高，小梁细胞自分泌TGF-β2增多，其水平与压力大小及作用时问相关，推测TGP-β2分泌异常可能是原发开角型青光眼病理进程中的重要机制之一。     

脂质体介导的CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞粘附功能的影响

目的：观察脂质体介导的CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞粘附功能的影响，探讨CD44分子在原发性开角型青光眼(POAG)发病过程中可能的作用。方法：采用硫代修饰的CD44反义寡核苷酸，通过脂质体导人体外培养的人眼小梁细胞，RT—PCR、Western印迹及MTT法观察CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞CD44基因表达及粘附功能的影响。结果：RT—PCR及Western印迹结果提示：CD44反义寡核苷酸抑制人眼小梁细胞CD44表达。MTT法检测显示：CD44反义寡核苷酸对人眼小梁细胞与细胞外基质透明质酸的粘附起抑制作用且呈浓度依赖性。结论：CD44反义寡核苷酸抑制人眼小梁细胞与细胞外基质透明质酸的粘附，粘附分子CD44可能参与了POAG发病过程。