变异链球菌F-ATPase亚基β基因多态性及表达研究

目的研究变异链球菌（Streptococcus燃，简称变链菌）临床分离株耐酸因子F-AT—Pase亚基B结构基因uncD的遗传多态性和mRNA表达水平差异，探讨其与细菌耐酸力的关系。方法实验株包括18株高耐酸和20株低耐酸变链菌临床株，以特异引物从细菌组DNA扩增uncD，行限制性内切酶长度多态性分析（RFLP）和测序比较；应用半定量RT-PCR两步法和凝胶成像系统定量软件，对20株不同基因型和不同耐酸力变链菌uncD基因的mRNA表达水平进行评价和比较。结果AluI—RFLP产生A、B基因型，测序证实导致多态出现的基因变异不在uncD的功能区和催化结构域；这两种基因型在不同耐酸力菌株的分布不同（P〈0．05），高耐酸性菌株中A型基因uncD的检出高于低耐酸力菌株。不同耐酸力菌株uncD的mRNA表达水平不同（P〈0．05），但A、B两基因型菌株uncD的mRNA表达差异没有统计学意义（P〉0．05）。结论F-ATPase的β亚基基因具有明显的遗传多态性，基因型和mRNA表达水平的多态性与菌株的耐酸力有一定的关系，虽然β亚基基因功能区高度保守，但在酸耐受适应中，仍表现为F—ATPase较活跃上调的亚基基因。     

差异显示技术对变异链球菌生物膜基因表达差异的分析

目的 对生物膜和浮游状态下的变异链球菌细胞进行比较研究,采用限制性酶切差异显示技术比较分析两者的基因表达谱.方法 分别收集变异链球菌浮游菌细胞与贴壁的生物膜细胞,分离纯化总RNA,对于逆转录获得的cDNA进行限制性酶切差异显示PCR技术（RFDD-PCR）比较分析两者的表达谱,对于获得的差异表达片段通过克隆测序并于BLAST比对获得这些片段的基因信息,进而推断其功能.结果 通过对差异片段的分析,确证其中4条片段分属结构基.fruA、SMU.438c、SMU.751与adhB/C.结论 限制性酶切差异显示技术可用于分析生物膜形成过程中基因表达的差异.     

变异链球菌表面蛋白抗原真核表达质粒的构建及免疫动物的研究

变异链球菌 (Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ,Ｓ .ｍｕｔａｎｓ)是龋病主要致病菌 ,Ｓ .ｍｕｔａｎｓ的表面蛋白质抗原ＰＡｃ是其主要毒力因子之一 ,参与了唾液介导的Ｓ .ｍｕ ｔａｎｓ在牙面的粘附。Ｓ .ｍｕｔａｎｓＰＡｃ分子的氨基端不仅富集免疫显性Ｔ、Ｂ细胞表位 ,而且含有唾液糖蛋白结合区 ,因此氨基端是理想的表位多肽防龋疫苗选择区。此外 ,Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓ(Ｓ .ｓｏｂｒｉｎｕｓ)的ＰＡｇ分子与Ｓ .ｍｕｔａｎｓＰＡｃ分子的氨基端具有保守的Ｂ细胞表位 ,以ＰＡｃ分子该区段制备的多肽疫苗…     

天疱疮患者外周血单个核细胞瘦素受体mRNA的表达研究

瘦素受体主要分为长型瘦素受体(OB-Rb)和短型瘦素受体(OB-Ra)。我们曾发现天疱疮患者血清瘦素水平增高及可溶性瘦素受体水平下降。为进一步探讨瘦素受体在转录水平上是否存在异常,采用RT-PCR方法对天疱疮患者外周血单个核细胞(PBMC)OB-Ra和OB-Rb mRNA表达进行了检测,现将结果报告如下。35例天疱疮患者为我科2002年至2005年门诊/病房住院患者,年龄22～70     

乙型肝炎病毒DNA的前C区1896位点变异与DNA水平变化的研究

目的　探讨HBVDNA前C区 1896位点变异与HBVDNA水平的变化。方法　采用等位基因特异引物PCR方法和荧光定量PCR方法对 95例乙型肝炎病毒感染者血清的HBVDNA1896位点变异 (野生型 /突变型 )和HBVDNA水平定量进行检测。结果　 1896位点变异不同 ,HBVDNA水平不同 ,野生型HBVDNA水平 (6 .0 1± 1.4 3)高于变异型 (4.85± 1.17)和混合感染型 (4.75± 1.11) (P <0 .0 1) ,后二组差异不明显 (P >0 .0 5 ) ,不同血清HBe系统乙肝患者和不同类型乙肝患者均可出现 1896位点变异 ,抗HBe阳性组的变异率显著高于HBeAg阳性组和HBe系统阴性组 (P <0 .0 5 ) ;而其HBVDNA水平 (4.5 0± 0 .72 )显著低于HBeAg阳性组 (6 .18± 1.30 ) ,不同临床类型的乙肝病毒感染者的野生型、变异型和混合感染型的1896位点变异检出率之间的比较无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,它们的HBVDNA水平之间比较也无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　HBVDNA前C区 1896位点变异不同 ,HBVDNA水平不同 ,变异病毒株复制减弱 ,DNA水平较野生型低 ,前C区变异相当常见 ,其与临床病变的关系有待进一步研究。     

3-羟酰基辅酶A脱氢酶在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

目的：克隆并在大肠杆菌中表达3-羟酰基辅酶A脱氢酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HCDH）并制备其抗血清。方法：通过PCR方法扩增HCDH基因片段，经DNA测序证实后克隆到原核表达载体pMAL-P2X，重组质粒转化大肠杆菌DE3，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达结果，经麦芽糖树脂亲和纯化的蛋白皮下注射免疫獭兔，琼扩和ELISA检测抗血清的效价，Western blot检测其特异性。结果：PCR扩增得到786bp的目的片段，序列测定证实与GeneBank上登录的序列一致；成功构建了HCDH基因片段的原核表达载体；在详细探索表达条件的基础上，成功诱导HCDH的表达，并制备了相应的抗血清。结论：检测HCDH蛋白在表达水平上的变化及为HCDH基因表达调控的进一步研究奠定了基础。     

多粘菌素在VAP治疗中的临床效果评价及对患者TNF-α表达水平的影响研究

目的 分析讨论多粘菌素在VAP治疗中的临床效果评价,以及对患者TNF-α表达水平的影响.方法 研究选取本院呼吸机相关性肺炎患者104例进行分析.根据患者治疗情况分为观察组50例,对照组54例.综合判断比较临床疗效以及治疗前后的TNF-α水平变化等.研究使用SPSS 20.0行统计分析.结果 本研究中50例观察组患者以及54例对照组患者基本情况的组间差异无统计学意义,可比性良好.随访比较两组患者治疗后4d和14d的疗效情况,提示治疗4d随访观察组和对照组的显效率和无效率差别显著,观察组的显效率为78.00％,无效率仅为12.00％;对照组的显效率为53.70％,无效率为42.59％;差别有统计学意义,P＜0.05.治疗14d随访则见两组患者的痊愈率差别显著,观察组的痊愈率达到了20.00％,对照组仅为5.55％,P＜0.05;但是显效和无效率差别未见统计学意义.治疗后14d的TNF-α水平比较可见两组患者TNF-α水平均较治疗前有显著减低,P＜0.05;同时观察组治疗后的水平又显著低于对照组,两组治疗后的水平分别为133.87±12.08 pg/mL和165.87±11.24 pg/mL,P＜0.05.结论 多粘菌素治疗短期内可以提高显效率,治疗14d可显著提高患者的痊愈率.TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质之一,从这个角度来看治疗后观察组的TNF-α水平更低表明了炎症状态控制水平在观察组更优.     

不同剂量IFN-γ体内对小鼠H22肝癌发生发展的作用研究

目的 探讨不同剂量尤其是低剂量的γ干扰素(IFN-γ)体内表达对小鼠H22肝癌发生发展的影响。方法 利用小鼠H22肝癌体内发生和进展的模型，以不同剂量IFN-γ表达质粒(mIFNG)进行长期和短期直接肌肉转染，检测H22肝癌的发生率及生长速率；半定量RT-PCR、ELISA及实时定量PCR检测IFN-γ的表达情况；肌肉转染表达IFN-γ阻断剂，检测其对IFN-γ作用的影响。结果 注射低剂量(10μg)的mIFNG质粒局部持续表达IFN-γ可明显促进小鼠H22肝癌的发生和发展，然而短暂的表达则没有这种促进作用。IFN-γ拮抗剂则可对抗低剂量表达IFN-γ对肿瘤的促进作用。另一方面，注射高剂量(100μg)的mIFNG质粒局部持续表达IFN-γ则能够介导明显的抗肿瘤效应。结论 IFN-γ对小鼠H22肝癌具有双重作用，也可能是联系慢性炎症与肿瘤发生发展之间的一个十分重要的衔接者。     

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达.方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中.构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平.结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础.     

急性早幼粒细胞白血病TNF-α基因多态性和蛋白表达水平的相关研究

目的 探讨北方地区汉族人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因型别的多态性和TNF-α蛋白表达与急性早幼粒细胞白血病(APL)的相关性.方法 对21例APL患者采用酶联免疫分析法(ELISA)测定TNF-α含量,应用顺序特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法检测TNF-α基因型别的多态性变化,并与31名健康献血者对照.结果 APL组血中TNF-α蛋白含量(1.810±0.116)显著高于对照组(1.107±0.095),P＜0.05;APL组和正常对照组TNF-α(308A)等位基因频率分别是(9.524%)和(9.68%)组间差异无统计学意义(P＞0.05),提示该等位基因频率与APL不相关,血中TNF-α蛋白表达增高与APL相关.结论 中国北方地区汉族人TNF-α基因308位点基因多态性与APL的易感性、临床以及预后可能不起重要作用;而TNF-α蛋白表达与APL的易感性相关联.     

变异链球菌葡聚糖结合蛋白D基因失活菌株的构建和鉴定

目的利用基因打靶技术构建变异链球菌葡聚糖结合蛋白D基因（gbpD）失活株,用于葡聚糖结合蛋白D基因功能的研究.方法体外培养变异链球菌UA159菌株并以其基因组为模板,对gbpD基因内部序列进行PCR扩增,连接自杀载体pVA8912,分别用酶切及PCR鉴定;转化变异链球菌UA159株,用PCR及Western blot鉴定.结果经鉴定PCR产物及插入片段大小与预期值相符,且为所需目的基因片段,成功构建了自杀质粒pVA8912-gbpD;经PCR鉴定及Western blot鉴定,gbpD基因失活株基因组中gbpD基因内部成功插入目的片段,且该菌株不表达GbpD蛋白.结论成功构建了用于变异链球菌gbpD基因打靶的自杀质粒和gbpD基因失活株,为该基因功能的研究奠定了基础.     

变异链球菌生物膜结构观察

目的　建立变异链球菌生物膜模型 ,用激光共聚焦扫描显微镜 (CLSM)观察变异链球菌生物膜结构。方法　在盖玻片上分别形成 6、12、18、2 4、4 8、72h变异链球菌生物膜 ,将得到的各时段生物膜荧光染色后 ,用CLSM观察生物膜的断层扫描图像、生物膜厚度、每层红光绿光的面积 ,计算生物膜中细菌密度和活菌百分比 ,用软件处理扫描数据 ,得到生物膜的三维重建图像。结果　变异链球菌生物膜具有空间立体结构 ,形态多样 ,其中细菌密集 ,由死细菌和活细菌组成 ,还有丰富的基质和管道系统。 2 4h生物膜平均厚度最大 ,生物膜内层、中间层的细菌密度相对较大 ,而外层较低 ,72h内各时间段生物膜中活菌百分比由内往外逐渐增加。结论　变异链球菌生物膜有一定的厚度 ,具有三维立体空间结构 ,结构形态具有多样、不均质、开放的特点。     

Growth rate and biofilm thickness of Streptococcus sobrinus and Streptococcus mutans on hydroxapatite

Bacteria in biofilm and planktonic bacteria exhibit different properties. The objective of the present study was to compare the growth rates of Streptococcus sobrinus and Streptococcus mutans on different types of biofilm with their planktonic growth rate. Our experimental model consisted of hydroxyapatite beads coated with human saliva (sHA). Glucans or fructans were synthesized in situ on sHA by immobilized cell-free glucosyltransferase or fructosyltransferase isolated from oral bacteria. S. sobrinus or S. mutans was then adsorbed onto the glucan- or fructan-coated sHA and incubated for different time intervals. The depth of the developing biofilm was measured. Our results show that growth rates of S. sobrinus and S. mutans on both fructan- and glucan-coated sHA were similar during a 23 h period. In addition, the profile was similar to the growth profile of the same planktonic bacteria. The resemblance in growth rates between planktonic and biofilm bacteria may be attributed to the thin and non-dense biofilm formed in the initial stages of the biofilm formation. The thin biofilm coat, reaching a maximal depth of 11 microm, has only imposed limited diffusion restrictions, thus not affecting the growth of the bacteria in the biofilm. Our study shows that growth of bacteria on surfaces may resemble their growth in suspension if the bacteria are not embedded in a thick dense biofilm.     

变异链球菌luxS基因缺陷突变株生物学性状的初步观察

目的 为研究口腔主要致龋菌变异链球菌的种属间密度感应(quorum sensing)相关基因luxS对口腔生态的影响,构建此菌的luxS基因缺失突变株.方法 采用同源重组的方法,利用红霉素耐药基因erm置换变异链球菌基因组中的luxS基因,并在含抗性标记的选择性培养基上筛选出阳性克隆.初步研究该基因的缺失突变对变异链球菌在生长与生物被膜成熟分化中的作用.结果经PCR鉴定,luxS基因的置换突变位置正确,并能在体外稳定传代,突变株与野生株相比在达静止期后总菌数量上有明显差别,但在生物被膜的形成与分化上并未发现显著差异.结论 通过此研究建立了可稳定传代的变异链球菌luxS基因的缺失突变株,生长表型和生物被膜的形成与野生株无显著差异,为进一步研究此基因功能与调控机制提供了技术平台.     

Characterization of preparations enriched for Streptococcus mutans fimbriae: salivary immunoglobulin A antibodies in caries-free and caries-active subjects.

The ability of bacteria to adhere to salivary pellicle-coated enamel tooth surfaces is a critical step in oral bacterial colonization. Oral bacteria adhere to receptors of host origin in salivary pellicle. Streptococcus mutans has been identified as the major etiological agent of human dental caries and composes a significant proportion of the oral streptococci in carious lesions. Bacterial fimbriae are small (100 to 300 nm) hairlike appendages emanating from the cell surface. Preparations enriched for S. mutans fimbriae were isolated by a shearing technique and alternating high- and low-speed centrifugations. A representative fimbrial preparation had two distinct double bands comprising four proteins of approximately 100 to 200 kDa and one faint band at 40 kDa on reducing sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis/immunoblots and had demonstrable glucosyltransferase activity. Rabbit antisera raised against the preparation specifically stained the fuzzy coat of S. mutans, demonstrating short fimbria-like structures protruding 100 to 200 nm from the cell surface. Controls without antifimbria antibody did not exhibit this staining. There were significantly higher (P < or = 0.05) levels of salivary immunoglobulin A, but not serum immunoglobulin G, antibodies to the enriched S. mutans fimbria preparation by enzyme-linked immunosorbent assay from caries-free subjects than from caries-active subjects. The results suggest that S. mutans fimbriae may be an important adherence factor to which caries-free subjects mount a protective salivary immune response.     

变形链球菌表面蛋白可变区真核载体质粒pEGFP-N1一SrV+的构建及在293T细胞的表达

目的 构建变形链球菌(变链菌)表面蛋白可变区(extended-v)真核表达质粒pEGFP-NI-SrV+,并转染哺乳动物细胞293T,为进一步研究该区功能奠定基础.方法 根据已报道变链菌OMZ175的sry+基因序列,化学合成srV+的编码基因srv+,将真核载体质粒pEGFP-N1和srv+基因片段分别用Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切,连接获取重组质粒pEGFP-NI-SrV+,并对其进行PCR、酶切和测序鉴定.通过脂质体法瞬时转染哺乳动物细胞293T.运用荧光显微镜观察、Western blot及real-time PCR法检目的 蛋白在293T细胞中的表达情况.结果 通过基凶化学合成技术,获得1136 bp的目的 基因srv+,经测序鉴定与模板目的 基因序列一致;成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-SrV+;PCR扩增榆测可获得1.33 kb目的 基因片段;Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切可见4.7 kb和1.1 kb两条电泳条带,证实重组质粒pEGFP-N1-SrV+携带目的 基因;通过荧光显微镜观察到重组质粒pEGFP-N1-SrV+融合GFP后的表达,目的 细胞的转染效率达到80%以上;Western blot检测到相对分子质量(M1)为72 × 103处有特征条带,其大小和Srv+融合蛋白(42 × 103+28 × 103=70 × 103)相吻合;real-time PCR 数值分析显示:在293T细胞中,srv+基因的过表达效果显著.结论 成功构建了真核表达载体质粒pEGFP-N1-SrV+,并能够在哺乳动物细胞293T中表达.

Abstract：

Objective To construct the recombinant plasmid pEGFP-N1-SrV+ and evaluate the expression of SrV+in mammalian 293T cells.nethods srv+.a gene encoding the vailable region of the surface protein of the Streptococcus mutans OMZ175.was cloned chemically based on its reported nucleotide sequence.The eukaryotic expression plasmid,pEGFP-N1-SrV+,was constructed by introducing the srv+ gene into the Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ site of pEGFP-NI.The recombinant plasmid pEGFP-N1-SrV+was transfected into 293T cells with lipofectamine and the expression level of SrV+was evaluated.Results The eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1-SrV+was constructed successfully.GFP was observed by green fluorescent microscope.and a 72 × 1 03 protein was detected bv Westem blot.Real-time RT-PCR analysis revealed that the expression of the pEGFP-N1-SrV+in 293T was excellent and significant compared the control group. Conclusion The recombinant plasmid pEGFP-N1-SrV+was successfully constructed.which could encode the expression of SrV+after transfected into the mammalian 293T Cells.