重组腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因在培养大鼠心肌细胞中的表达

目的探讨2型腺相关病毒载体介导的人血管内皮生长因子165基因在离体心肌细胞中的表达及表达产物的生物活性。方法构建携带人血管内皮生长因子的2型腺相关病毒载体(rAAV-2/hVEGF165),感染大鼠原代心肌细胞,采用逆转录聚合酶链反应、免疫印迹法和酶联免疫吸附测定等方法检测心肌细胞人血管内皮生长因子165的表达,应用MTT法检测转染后细胞上清液中血管内皮生长因子165的生物学活性。结果逆转录聚合酶链反应检测结果发现感染的心肌细胞可表达人血管内皮生长因子165 mRNA;免疫印迹法检测结果表明感染的心肌细胞中有人血管内皮生长因子165,酶联免疫吸附测定法检测到血管内皮生长因子蛋白分泌水平为546.5±15.6pg/L,未转染组未检测到血管内皮生长因子蛋白的分泌;还发现感染的心肌细胞上清具有明显的促人内皮细胞增殖作用。结论2型腺相关病毒载体介导的人血管内皮生长因子165可有效转染大鼠心肌细胞,且表达产物具有促内皮细胞增殖作用。     

腺相关病毒介导的血管内皮生长因子基因与骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠肢体缺血的研究

目的 探讨腺相关病毒(rAAV)介导的人血管内皮生长因子(VEGF)165基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)移植对血管新生的影响.比较单纯干细胞移植与联合基因治疗的疗效.方法 全骨髓培养法提取培养MSC;rAAV-VEGF165转染MSC中,酶联免疫吸附试验(ELISA)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGF的表达;以近交系大鼠建立骨骼肌缺血模型,40只大鼠随机分为4组,每组10只.对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS);干细胞组移植等量MSC,转染术后7 d组和转染术后10 d组分别于结扎7 d和10 d后的缺血区移植转染VEGF基因的MSC,移植6周后做Ⅷ因子染色检测血管新生情况.结果成功培养出MSC,免疫组化CD44阳性表达,CD34阴性表达;流式细胞术CD90阳性表达.在转染rAAV-VEGF165后转染组1、3、5、7、9 d上清液中VEGF165分泌水平分别为(131.98±6.00)、(263.96±4.58)、(540.85±5.97)、(208.98±5.06)、(174.45±5.00)ng/L,明显高于未转染组的(68.72±1.99)、(76.47±4.98)、(89.86±1.99)、(84.93±8.97)、(68.71±5.98)ng/L[t值分别为14.14、51.16、79.28、27.56、26.07,(均P＜0.05)],且5 d时达到高峰,此后表达开始下降.琼脂糖凝胶电泳可见在579 bp处见到高亮度条带,证明rAAV-VEGF165成功转染进MSC细胞中.转染后的生长曲线及细胞形态较未转染组无明显变化.Ⅷ因子染色示转染术后10 d组动物缺血区毛细血管密度[(9.35±2.72)条/视野]明显高于对照组[(1.05±0.50)条/视野]和干细胞组[(3.10±1.43)条/视野](均P＜0.01),较转染术后7 d组[(6.95±1.69)条/视野]亦有一定程度的升高(P＜0.05).结论 MSC有利于VEGF基因的稳定表达,可作为VEGF基因的良好细胞载体,且联合应用效果高于单独移植MSC,移植最佳时间为术后10 d.     

腺病毒介导血管内皮生长因子基因_(165)在骨髓间充质干细胞中的表达及其影响

我们研究了体外培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)、编码血管内皮生长因子基因的腺病毒(AdVEGF165)在大鼠BMSCs的表达,以及AdVEGF165对大鼠BMSCs生长的影响.为联合基因治疗与细胞移植治疗缺血性心脏病的研究奠定基础.     

重组腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子165基因对缺血心肌血管新生的影响

为了研究重组 2型腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子 16 5 (hVEGF16 5 )基因对兔缺血心肌血管新生的影响 ,选取了 4 0只新西兰兔 ,建立心肌缺血模型后随机分为血管内皮生长因子高、中、低剂量组及对照组等 4组 ,分别向缺血区域心肌注射不同剂量的腺相关病毒载体 人血管内皮生长因子 16 5或磷酸盐缓冲液。 4周后取心肌组织和血液标本 ,采用逆转录聚合酶链反应和酶联免疫吸附法检测人血管内皮生长因子 16 5基因的表达 ;制作组织学切片以观察心肌组织的病理改变 ,于高倍镜下计数缺血区域毛细血管数目。结果发现 ,血管内皮生长因子低、中、高剂量组的人血管内皮生长因子 16 5 GAPDHmRNA比值依次为 0 .14± 0 .0 3、0 .4 0± 0 .0 4和 0 .6 4± 0 .0 4 ,血清人血管内皮生长因子 16 5含量分别为 6 4 .6± 8.0ng L、32 7.1± 9.9ng L和 4 71.6± 6 .9ng L ,各组间的差异均具有显著性 (P <0 .0 1)。低、中、高剂量组单个高倍视野内的毛细血管数分别为 4 .6± 1.3、11.6± 1.8和 2 1.8± 3.1条 ,而对照组为 4 .5± 1.5条。高、中剂量组的毛细血管数显著高于对照组 (P <0 .0 1) ,而低剂量组与对照组相比差异无显著性 (P >0 .0 5 )。相关分析发现毛细血管数与腺相关病毒载体 人血管内皮生长因子 16 5剂量呈     

重组血管内皮生长因子_(165)腺相关病毒对心肌梗死大鼠心功能的影响

目的探讨直接心肌注射基因重组内皮生长因子_(165)腺相关病毒(rAAV-hVEGF_(165))对急性心肌梗死大鼠心功能的影响。方法选择雄性SD大鼠81只,将0.1 ml生理盐水或rAAV-hVEGF_(165)分3点注射于梗死交界处心肌内。根据注射药物的不同随机分为4组:假手术组(15只),心肌梗死组(25只),生理盐水组(25只),血管内皮生长因子(VEGF)组(16只)。注射4周后测定心肌组织VEGF含量、超声心动图参数、梗死面积、微血管数量、心钠素水平。结果 VEGF组大鼠心肌梗死面积较心肌梗死组和生理盐水组明显减小(P<0.05),左心室射血分数明显高于心肌梗死组和生理盐水组(P<0.01),心肌组织VEGF含量较心肌梗死组和生理盐水组有所增加。血管计数显示,VEGF组大鼠较其他3组有更多的新生血管形成(P<0.01)。结论直接心肌注射rAAV-hVEGF_(165)能够明显改善急性心肌梗死大鼠的心功能,缩小梗死面积,促进心肌内新血管的形成。     

转染人血管内皮生长因子165基因的骨髓间充质干细胞移植改善兔心肌梗死后心功能

目的探讨将骨髓间充质干细胞移植和血管内皮生长因子基因治疗相结合治疗兔心肌梗死的疗效及其机制。方法将48只新西兰大白兔随机分为心肌梗死组、骨髓间充质干细胞移植组、血管内皮生长因子组和骨髓间充质干细胞 血管内皮生长因子组。建立兔心肌梗死模型,在心肌梗死后2周取107个骨髓间充质干细胞移植至梗死区。移植后4周测定心功能,梗死区骨髓间充质干细胞进行鉴定及计数,进行Ⅷ因子免疫组织化学染色。结果血流动力学比较发现,骨髓间充质干细胞 血管内皮生长因子组各项参数明显优于骨髓间充质干细胞组;心肌梗死区BrdU阳性细胞数骨髓间充质干细胞 血管内皮生长因子组明显多于骨髓间充质干细胞组(61.24±8.51个/视野比44.21±7.68个/视野,P<0.01);梗死区血管的数量骨髓间充质干细胞 血管内皮生长因子组(48.75±7.96个/视野)明显多于骨髓间充质干细胞组(33.08±6.12个/视野,P<0.01)、血管内皮生长因子组(29.98±8.04个/视野,P<0.01)和心肌梗死组(18.32±3.88个/视野,P<0.01)。结论转染血管内皮生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植可改善兔心肌梗死后的心功能,其疗效明显优于单纯骨髓间充质干细胞移植及血管内皮生长因子基因治疗,可能是通过增加骨髓间充质干细胞的存活及改善梗死区的血供而起作用的。     

血管内皮生长因子转染人骨髓间质干细胞

目的观察pcDNA3．1（-）VECF真核表达载体转染骨髓间质干细胞后VEGF mRNA表达及VEGF蛋白质水平的变化。方法脂质体介导pcDNA3．1（-）VEGF质粒转染体外培养的人骨髓间质干细胞,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR方法检测转染后骨髓间质干细胞VEGF mRNA表达水平,免疫印迹法半定量检测转染后骨髓间质干细胞VEGF蛋白质水平。结果荧光显微镜提示脂质体介导质粒转染体外培养的骨髓间质干细胞成功,且效率较高;与对照组相比,VEGF mRNA及蛋白质表达水平在pcDNA3．1（-）VEGF转染组显著增高,空载体转染组元明显变化。结论pcDNA3．1（-）VEGF质粒转染骨髓间质干细胞,可提高骨髓间质干细胞VEGF mRNA表达水平,上调其VEGF蛋白质水平。     

血管内皮生长因子对骨髓间充质干细胞分离培养的诱导分化作用

目的　结合骨髓间充质干细胞与血管内皮生长因子（VEGF）的优点,探讨VEGF对其体外诱导分化的作用。为缺血性疾病的治疗提供新思路。方法　成人新鲜骨髓,Percoll梯度分离法培养,单克隆培养法分离传代扩增骨髓基质细胞（MSCs）。在大肠杆菌DH5α中扩增和提取,纯化、克隆pcDNA3.0-VEGF165质粒。脂质体法转染MSCs。流式细胞术检测诱导前后MSCs免疫表型变化。一抗VEGF和CD31（1∶50）,FITC标记的VEGF二抗和cy3标记的CD31二抗与细胞共同孵育,甘油封片,在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞染色情况。结果　转染前表达CD44（75.86%）、CD31（5.63%）。转染后CD44表达明显下调（40.18%）,CD31则明显上调（56.20%）。FITC标记后VEGF抗体使细胞显现绿色荧光,cy3标记的CD31抗体使细胞显红色荧光。结论　转染VEGF后骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化且有分泌VEGF的功能,为干细胞植入及血管再生起到指导作用。     

剪应力和血管内皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化

目的 研究血管内皮生长因子与剪应力对骨髓间充质干细胞分化的作用.方法 分离成人骨髓单个核细胞,经贴壁法获取骨髓间充质干细胞.所获细胞用血管内皮生长因子、剪应力(8和15 dyn/cm2)、血管内皮生长因子联合剪应力分别作用7天、24 h、24 h,观察细胞形态变化,并进行内皮细胞标记物假性血友病因子定性间接免疫荧光染色,进行Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白摄取实验以鉴定内皮细胞功能.结果 在剪应力(8 dyn/cm2)、血管内皮生长因子分别作用24 h、7天后,骨髓间充质干细胞形态变得偏圆、呈多角形,血管内皮生长因子联合剪应力诱导组细胞平行于流体方向排列,假性血友病因子染色阳性,提示内皮细胞表型特征,同时Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白摄取实验阳性,提示具有内皮细胞功能.血管内皮生长因子诱导组、15 dyn/cm2剪应力组作用24 h的骨髓间充质干细胞,假性血友病因子染色与Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白摄取实验均阴性,提示未出现向内皮细胞分化.血管内皮生长因子和15 dyn/cm2剪应力共同作用24 h后,骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化.结论 剪应力可诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,且与力的大小有关.血管内皮生长因子可联合剪应力诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化.且诱导效果优于单独使用剪应力.     

骨髓间充质干细胞联合血管内皮生长因子对大鼠创伤性脑损伤细胞凋亡的抑制作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)联合血管内皮生长因子(VEGF)对大鼠创伤性脑损伤细胞凋亡的抑制作用.方法 Wistar大鼠40只,随机分为对照组、单独使用BMSC治疗组、单独使用VEGF治疗组、联合治疗组4组均采用Feeney自由落体撞击方法造成中度创伤性脑损伤模型.于脑损伤1周后,在立体定向仪下用微量注射器在脑损伤周边部位;单独使用BMSC治疗组注入BMSC,单独使用VEGF治疗组注入VEGF;且联合治疗组同时注入BMSC和VEGF;对照组注射PBS溶液.分别于治疗前后进行NSS评分,于治疗1周后猝死取脑,并进行HE染色,免疫组化Sp法测定bcl -2与bax蛋白的表达,TUNEL法测定细胞凋亡情况.结果 在BMSC与VEGF联合治疗组中,bcl -2的表达明显多于单独治疗组及对照组,而bax的表达低于其余各组,联合治疗组中抑制细胞凋亡的蛋白高度表达,而促进细胞凋亡的蛋白低度表达.TUNEL法测定,在联合治疗组中,免疫组化呈棕色的凋亡细胞明显少于单独治疗组及对照组.结论 骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子对大鼠中度创伤性脑损伤细胞凋亡具有明显的抑制作用,联合运用的效果优于单独干细胞移植.     

neurturin基因转染c17.2神经干细胞移植治疗帕金森病模型大鼠的实验研究

目的探讨neurturin(NTN)基因转染c17.2神经干细胞脑内移植后对帕金森病(PD)大鼠模型的治疗作用,并探讨神经干细胞介导的基因治疗方法的有效性。方法在构建成功高表达NTN蛋白NTN-c17.2细胞克隆的基础上,分别在6-羟多巴胺单侧模型大鼠的纹状体区移植入NTN-c17.2、Mock-c17.2和磷酸缓冲液(PBS),通过免疫组化、旋转行为变化和高效液相色谱监测观察c17.2神经干细胞的分化,NTN基因的表达和NTN蛋白的治疗作用。结果NTN-c17.2细胞移植后,标记抗原巢蛋白(nestin)逐渐消失,细胞分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,但仍持续分泌NTN蛋白。动物模型旋转行为动态观测和高效液相色谱法(HPLC)检测都提示NTN-c17.2和Mock-c17.2好于PBS组,两组之间差异无统计学意义(P>0.05),RT-PCR和免疫组织化学检测提示c1 7.2神经干细胞能产生多种神经营养因子,移植后部分细胞可分化成酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经细胞。结论用带有NTN基因的神经干细胞移植治疗PD,显示出一定的治疗效果,然而,这种治疗作用主要和神经干细胞分泌的多种神经营养因子和移植后的细胞分化有关,NTN蛋白可以增强这种作用。     

细胞间接触诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为平滑肌细胞

目的体外诱导骨髓间质干细胞分化为平滑肌细胞,探讨已分化成熟的平滑肌细胞及细胞因子对骨髓间质干细胞分化的影响。方法分别用骨髓间质干细胞加平滑肌细胞条件培养液;骨髓间质干细胞与平滑肌细胞分层培养;骨髓间质干细胞EGFP标记后,与平滑肌细胞混合培养。用平滑肌细胞抗体SM-a-Actin、Calponin免疫荧光染色,检测骨髓间质干细胞的分化情况。结果骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养7d后免疫荧光染色,可见EGFP(绿色)和抗SM-a-Actin、Calponin(红色)的双标细胞存在。而加平滑肌细胞条件培养液与分层培养组,骨髓间质干细胞均不表达Calponin。结论细胞间直接接触对诱导骨髓间质干细胞定向分化为平滑肌细胞起决定作用。     

大鼠脂肪间充质干细胞在部分肝切除模型中向肝细胞分化的研究

目的探讨脂肪间充质干细胞（ADMSCs）在部分肝切除模型中向肝细胞的分化。方法从大鼠脂肪组织中分离出干细胞，并进行体外扩增、传代，取第2代ADMSCs用PKH26标记，制作部分肝切除模型，将标记细胞经门静脉自体植入体内。2周后切下肝脏制成冰冻切片，荧光显微镜下观察标记细胞在肝脏的定位，进行免疫荧光染色检测标记细胞白蛋白的表达。结果从脂肪组织中分离出的ADMSCs能在体外大量扩增，PKH26标记后细胞在荧光显微镜下发红色荧光，细胞标记率约95％；荧光显微镜下可见肝脏冰冻切片中散在分布红色标记细胞，免疫荧光染色显示大多数标记细胞白蛋白染色阳性。结论 大鼠脂肪间充质干细胞在肝再生环境中能向肝细胞分化，有可能在肝部分切除后参与肝再生。     

自体骨髓间充质干细胞在大鼠移植肝中的多向分化

我们将自体全骨髓细胞及骨髓间充质干细胞(MSCs)输入移植肝中,观察移植物存活时间、肝功能、病理变化及自体骨髓细胞的分化情况,探索自体骨髓细胞减少排斥反应、诱导移植物长期存活的可能机制.     

血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植促进缺血心肌血管生成的研究

目的研究血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)基因转染骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)移植对缺血心肌的血管生成作用。方法于2004年5月至2005年8月取第四军医大学西京医院分离、培养Wistar大鼠的MSCs,用真核表达载体pcDNA3.1(-)/hVEGF165转染MSCs。45只近交系Wistar大鼠随机均分为转染组(MSCs/VEGF组)、对照组(MSCs组)、无血清培养基组(DMEM组),结扎前降支建立急性心肌梗死模型后在梗死区边缘区行5×106细胞移植,DMEM组行等量培养基注射。细胞移植前行CM-DiI标记。移植1个月后行心脏B超测量射血分数值,组织化学染色评价新生血管密度。结果培养的MSCs呈典型贴壁生长成纤维样外观,pcDNA3.1(-)/hVEGF165能有效转染大鼠MSCs,移植1个月后MSCs/VEGF组较其余各组左室射血分数(LVEF),再生血管密度明显增加,差异均有显著性(P<0.01)。结论VEGF基因转染MSCs移植能显著促进缺血心肌血管再生,进而改善心脏功能。     

神经导向因子Netrin-1促进骨髓间充质干细胞的血管生成作用

将携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因标记的Netrin-1基因重组腺病毒(Ad5-EGFP-Netrin-1)或空载体的腺病毒(Ad5-EGFP)转染到大鼠骨髓间充质干细胞后与Matrigel胶混匀共同移植到大鼠皮下,分别在移植后14d和28d观察Netrin-1和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的蛋白表达以及微血管形成数量的情况.结果显示,Netrin-1能促进VEGF的表达和血管形成,移植的细胞数量越多而作用越强(均P＜0.05)     

骨髓间质干细胞在缺血性心脏病中的应用

骨髓间质干细胞(MSCs)是一种多能造血于细胞,在一定诱导条件下,可分化为多种造血外组织细胞,如骨细胞、软骨细胞、 心肌细胞等,因此,在组织工程方面具有广泛的应用前景。近年来,MSCs在缺血性心脏病中的应用价值已得到证实和肯定,从而为 缺血性心脏病的治疗带来了新的契机。本文就骨髓间质干细胞在缺血性心脏病中的应用进行了回顾和展望。     

大鼠骨髓基质干细胞起搏电流基因的表达及转染人HCN2的表达及鉴定

目的研究骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)起搏电流基因的表达及转染人超极化激活的环化核苷酸门控通道(hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide gated,HCN)亚型2后起搏电流的特点。方法通过实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chainreaction,real-time PCR)的方法,检测 MSCs 本身起搏电流基因的表达。用脂质体转染的方法,将重组有编码起搏电流基因的质粒 pcDNA3-hHCN2导入 MSCs 中,用全细胞膜片钳技术记录起搏电流(Ⅰ_(hHCN2));用 real-time PCR 和 Western blot 印迹检测目的基因 hHCN2的 mRNA 和蛋白表达。结果MSCs 起搏电流基因 mHCN1、mHCN2、mHCN3、mHCN4在总 HCN 的表达中所占比例分别为(0.08±0.01)%、(77.16±0.03)%、(0.24±0.01)%、(22.53±0.02)%。全细胞膜片钳技术记录到Ⅰ_(hHCN2)得到电流密度一电压曲线,其激活电压约为-80 mV,此电流可以被4 mmol/L的 Cs~+阻断。real-timePCR 检测有 hHCN2 mRNA 的高表达,Western blot 印迹检测有其蛋白的表达。结论 (1)MSCs 起搏电流基因表达以 mHCN2和 mHCN4为主;(2)通过脂质体转染法使 MSCs 成功表达Ⅰ_(hNCN2)起搏电流,为抗心律失常基因治疗的研究奠定了基础。     

糖尿病小鼠缺血诱导的骨髓内皮祖细胞动员障碍

目的 观察糖尿病动物缺血诱导的骨髓内皮祖细胞（EPC）动员是否存在障碍,以及这种障碍是否和缺血诱导的血管内皮生长因子（VEGF）释放降低有关。方法 链脲霉素40mg／kg诱导C5781／6雄鼠糖尿病,非糖尿病组给予等量缓冲液。饲养2个月后,进行左侧股动脉高位结扎离断术造成后肢缺血模型,通过红四氮唑染色法与后肢血管造影确定造模成功。于术前及术后不同时间点采血（1天,3天,n：8;5天,7天及14天,n=5）,三色流式细胞术检测两组动物外周血单个核细胞中c-Ki^＋／Sea-1^＋／flk-1^＋早期EPC比例。ELISA法测定相应时间点血浆VEGF水平。结果 基础状态下,糖尿病组循环EPC数量较非糖尿病组明显减少[（0．60±0．03）％比（0．95±0．09）％,P〈0．001],血浆VEGF水平低于试剂盒检测灵敏度。两组动物缺血诱导的骨髓早期EPC释放曲线相似,即术后1天显著增加,术后3天达峰,动员持续至2周以上。但是在EPC早期快速动员阶段（术后前3天）,糖尿病组外周血早期EPC数量较非糖尿病组明显减少[1天,（1．16±0．29）％比（1．80±0．32）％,P〈0．05;3天,（1．38±0．34）％比（2．37±0．52）％,P〈0．05]。同时组织缺血也伴随着血浆VEGF浓度的显著增高：非糖尿病组血浆VEGF水平在术后一天快速增加并达到峰值,此后渐降至相对较低水平持续两周以上;而糖尿病组术后1天血浆VEGF快速释放明显降低[（73．1±18．6）pg／ml比（128．5±44．2）Pg／ml,P〈0．05]。结论 糖尿病动物基础状态下外周血早期EPC数量减少,组织缺血诱导的骨髓EPC动员障碍,这种障碍可能与缺血诱导的VEGF释放减少有关。