哮喘气道上皮杯状细胞合成GM-CSF及其调控机制的研究

目的 观察哮喘小鼠气道上皮杯状细胞合成粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的能力,探讨钙激活Cl^-通道(CLCA)在合成中的调控作用。方法 取成年雄性BALB／c小鼠,采用卵蛋白致敏法制备哮喘模型。AB-PAS特染法检测哮喘小鼠小支气管杯状细胞的分布;同一解剖部位采用免疫组化染色法检测GM-CSF的表达。体外培养人气道黏液上皮细胞系NCI-H292,采用含人hCLCA1的重组质粒pIRKS2-EGFP／hcLCA1转染该细胞。筛选到稳定表达hCLCA1的细胞后,免疫组化法及RT-PCR法检测该细胞GM-CSF的表达、转录水平。设非转染细胞和CLCA阻断剂NFA干预的转染细胞为两个对照组。结果 哮喘小鼠气道杯状细胞GM-CSF免疫组化染色为阳性。转染hCLCA1细胞的GM-CSF表达与转录水平明显高于两个对照组;NFA能抑制转染细胞GM-CSF的表达和转录。结论 哮喘气道上皮杯状细胞能合成GM-CSF,特定CLCA表达升高是促进GM-CSF合成的机制之一。     

热打击对单层肠上皮Caco-2细胞屏障功能的影响

目的 研究热打击对肠黏膜屏障上皮细胞间紧密连接及凋亡的影响.方法 采用肠上皮细胞株Caco-2建立肠屏障模型,检测经37～43℃热打击后细胞的单层跨膜电阻抗(TEER)值及对大分子物质辣根过氧化物酶(HRP)的通透性,采用Western blotting检测occludin蛋白的表达水平,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果 随着热打击温度的升高,TEER值降低,HRP通透性增加,37℃热打击细胞的TEER值和HRP通透性与39、41、43℃热打击细胞差异均有统计学意义(P＜0.01).热打击温度从37℃到41℃,occludin蛋白的表达逐渐增加,于41℃达峰值,此后逐渐下降.43℃时随热打击时间延长,occludin蛋白表达逐渐降低.随热打击温度(37～43℃)升高,细胞凋亡逐渐增加(P＜0.05或P＜0.01).结论 热打击可造成肠上皮紧密连接的明显破坏,细胞凋亡增加,从而破坏肠屏障功能.     

MRE11参与炎症小体信号通路激活的初步研究

目的：探究减数分裂重组蛋白11同系物A（MRE11）在不同刺激物诱导下炎症小体激活中的作用和地位。方法利用不同刺激物,如Poly（I∶C）、Poly（dA∶dT）、E．coli gDNA、293T gDNA和CPPD以及生殖疱疹病毒（HSV）等处理单核巨噬细胞THP-1,通过IL-1β酶联免疫吸附试剂盒（ ELISA）筛选出诱导激活炎症小体的有效刺激物;合成siMRE11干扰小RNA,转染THP-1细胞,免疫印迹检测MRE11干扰下调效率;利用筛选到的阳性刺激物处理MRE11干扰下调的细胞,采用ELISA和免疫印迹方法检测MRE11对细胞分泌炎性因子IL-1β水平和前胱天蛋白酶（pro-caspase）-1切割的影响。结果在MRE11干扰下调的THP-1细胞中,Poly（I∶C）、Poly（dA∶dT）、E．coli gD-NA和293 T gDNA 刺激激活细胞分泌的IL-1β水平以及前胱天蛋白酶-1切割的水平均有不同程度降低。结论MRE11参与由DNA以及RNA刺激激活的炎症小体信号通路。     

小干扰RNA抑制核因子-κB增强131I治疗甲状腺癌疗效的研究

目的 探讨小干扰RNA (siRNA)抑制核因子-κB (NF-κB)对131I致DTC细胞凋亡能否产生协同作用.方法 2×104 MBq/L 131I作用人甲状腺乳头状癌细胞株KTC-1 24 h后做DNA结合实验,48 h后做细胞存活分析.Western blot鉴定131I作用6h后细胞NF-κB p65的变化,24 h后凋亡抑制因子[X-染色体相关凋亡抑制蛋白(XIAP)、细胞凋亡抑制因子1(clAP1)、B细胞淋巴瘤因子大亚基(Bcl-xL)]、凋亡关键因子[半胱氨酸蛋白酶(caspase 3)和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)]的变化.p65和凋亡抑制因子的Western blot检测分4组:未转染(A)组、未转染+131I(B)组、转染对照siRNA+ 131I(C)组和转染p65 siRNA+131I(D)组;其余实验分为6组:未转染(1)组、转染对照siRNA(2)组、转染p65 siRNA(3)组、未转染+131I(4)组、转染对照siRNA+131I(5)组和转染p65 siRNA+131I(6)组.多组间均数比较采用单因素方差分析,均数两两比较采用q检验.结果 1至6组DNA结合率分别为(100.00±11.65)％、(96.00±17.98)％、(9.28±5.01)％、(322.72±50.81)％、(311.36±44.81)％和(36.96±15.66)％,差异有统计学意义(F=137.74,P＜0.01);131I作用后KTC-1细胞NF-κB活性均增强(q4∶1组=10.90,q5∶2组=11.38,均P＜0.01);p65 siRNA可抑制NF-κB功能(q1∶3组=18.25,q4∶6组=13.71,均P＜0.01).6组细胞存活率分别为(100.00±11.65)％、(96.32±9.44)％、(70.88±7.41)％、(64.16±9.50)％、(62.24±9.37)％和(28.64±6.74)％ (F=52.76,P＜0.01);3、4和6组比,q=10.76和7.79,均P＜0.01.Western blot结果显示A、B、C和D组p65相对表达水平分别为(56.60 ±7.37)％、(111.07±13.31)％、(113.16±15.04)％和(12.46±2.74)％,差异有统计学意义(F=60.17,P＜0.01);131I作用后p65浓度增高(qB∶A组=6.20,qc∶A组=5.85,均P＜0.01);p65 siRNA可抑制其浓度增高(qB∶D组=12.57,qc∶D组=11.41,均P＜0.01).4组XIAP、cIAP1和Bcl-xL分别为(17.59±1.96)％、(16.45±1.85)％和(19.92±2.22)％,(98.37±17.92)％、(109.81±19.16)％和(95.59±22.20)％,(98.43±18.71)％、(98.86±15.88)％和(100.99±21.70)％,(7.00±0.95)％、(5.86±0.35)％和(9.52±0.90)％,差异均有统计学意义(F =44.22、56.51和29.11,均P＜0.01);131I作用后三者表达增加(qB∶A组 =7.76、8.40和5.88,均P＜0.01);p65 siRNA可抑制三者表达(qB∶D组=8.82、9.40和6.71,均P＜0.01).6组caspase 3亚基p19和p17、PARP活性蛋白p116和失活产物p89差异均有统计学意义(F=39.03、48.45、32.56和52.20,均P＜0.01);3、4和6组比q =3.18 ～9.98,均P＜0.05.结论 131I通过活化NF-κB导致甲状腺癌细胞内凋亡抑制因子表达升高,p65 siRNA可抑制这种变化;联合使用p65 siRNA对131I致DTC细胞凋亡产生协同效应.     

腹部开放伤合并人工海水浸泡大鼠肠道免疫屏障功能的变化

目的 探讨腹部开放伤合并人工海水浸泡大鼠肠道免疫屏障功能的变化及意义.方法 建立腹部开放伤合并人工海水浸泡大鼠致伤模型.50只Wistar大鼠随机分为5组,每组10只.A组:腹部开放伤合并海水浸泡组;B组:单纯腹部开放伤组;C组:单纯海水浸泡组;D组:腹部开放伤合并生理盐水浸泡组;E组:正常对照组.观察腹腔海水浸泡后肠内容物sIsA及血浆IgA、内毒素(LPS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)含量变化及血、肝脏、肠系膜淋巴结细菌定量培养情况;观察HE染色小肠组织病理损伤评分.结果 与E组比较,A组肠内容物SIgA、血浆IgA含量显著下降;血浆LPS、TNF-α、IL-6含量显著升高;发生肠道细菌易位(P＜0.05或P＜0.01);HE染色显示小肠黏膜组织出现不同程度的损伤(P＜0.05或P＜0.01).结论 腹部开放伤合并海水浸泡后肠道免疫屏障功能显著下降,与内毒素血症和肠道细菌易位的发生密切相关,炎症因子释放及肠黏膜屏障功能损伤是肠道免疫屏障功能受损的重要机制之一.     

4-苯基丁酸早期处理对脓毒症大鼠血管通透性的保护作用

目的探讨4-苯基丁酸(PBA)早期处理对脓毒症大鼠血管通透性的保护作用。方法 32只成年SPF级SD大鼠(雌雄各半)随机分为4组:假手术组、脓毒症组、常规治疗组[在盲肠结扎穿孔(CLP)12h后静脉给予乳酸林格氏液(LR)、抗生素头孢呋辛钠(100mg/kg)和血管活性药物多巴胺(输液速度为10μg/kg·min),输注3h,使MAP65mmHg]以及PBA早期处理组(5mg/kg PBA,在CLP手术完成后立即尾静脉给予PBA,在CLP12h后进行常规治疗3h),每组8只。通过荧光蛋白透过率的方法测定大鼠肺脏和肾脏的血管通透性,伊文思蓝染色透过率检测大鼠肠道通透性;离体取原代内皮细胞观察脂多糖(LPS)刺激及PBA早期处理后对内皮细胞闭锁小带蛋白1(ZO-1)的表达和细胞跨膜电阻(TER),以及单层内皮细胞异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)的影响。结果 (1)假手术组大鼠的平均动脉压为(112.0±5.3)mmHg,脓毒症组为(62.0±7.1)mmHg(P0.001);常规治疗可将平均动脉压维持在(80.0±10.2)mmHg;PBA早期处理后,大鼠的平均动脉压可恢复到正常的87.0%,与常规治疗组比较,差异有统计学意义(P=0.003);(2)脓毒症组的肠系膜微静脉对FITC-BSA的渗漏从1min后开始并随着FITC-BSA作用时间延长,渗漏到组织间隙越多,甚至整个视野都散布着FITC-BSA;PBA早期处理组渗漏到组织间隙的FITC-BSA显著少于脓毒症组。伊文思蓝结果发现:脓毒症后,大鼠的肠组织明显渗漏,与假手术组比较,差异有统计学意义(P0.001);常规治疗后肠道的通透性有部分改善(P=0.010);PBA早期处理可显著降低肠道的通透性,与常规治疗组比较,差异有统计学意义(P0.001);(3)脓毒症后,大鼠的肺脏和肾脏血管渗漏显著增加,与假手术组比较,差异均有统计学意义(P0.001);常规治疗后肺脏和肾脏血管通透性有部分改善(P=0.005);PBA早期处理可显著降低肺脏和肾脏血管的通透性,与常规治疗组比较,差异有统计学意义(P0.001);(4)与正常对照组比较,经LPS刺激后的组ZO-1表达显著降低,细胞结构排列紊乱,TER显著降低,FITC-BSA透过率增加;PBA早期处理可使ZO-1表达增加,细胞间连接紧密,TER显著增加,FITC-BSA透过率显著降低。结论 PBA早期处理对脓毒症大鼠的血管通透性有保护作用。     

高压氧对缺血再灌注肠黏膜上皮Caco-2细胞间紧密连接的影响CSCD

目的 观察高压氧（HBO）对缺血再灌注（I/R）人类肠黏膜上皮Caco-2细胞间紧密连接（TJ）的影响.方法 培养单层人类大肠黏膜上皮细胞Caco-2,应用0.5 mmol/L丁基过氧化氢（t-buooh）诱导离体肠黏膜上皮细胞I/R损伤.按数字表法随机分为5组（每组8个培养孔）：对照组（N组）、I/R组、HBO预处理（HBO-P）组、缺血期HBO干预（HBO-I）组、再灌注期HBO干预（HBO-R）组.采用跨膜电阻抗检测法（TEER）检测肠道黏膜上皮细胞间紧密连接的开放程度并评价其通透性.用Rt-PCR检测细胞间紧密连接蛋白ZO-1转录水平.结果 TEER阻值N组最高,其次为HBO-P组,再次为HBO-R组,最后为HBO-I组.N组与其他各组差异均有统计学意义（P＜0.01）;HBO-P组阻值与I/R组、HBO-I组及HBO-R组的阻值比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;HBO-R组与I/R组、HBO-I组阻值比较差异有统计学意义（P＜0.05）;L/R组高于HBO-I组,且差异有统计学意义（P＜0.05）.ZO-I mRNA的Rt-PCR结果显示：与N组相比,其他各组ZO-1 mRNA含量均明显下降,且差异有统计学意义（P＜0.01）;HBO-P组ZO-1 mRNA含量均高于L/R组、HBO-R组及HBO-I组（P＜0.01）;HBO-R组ZO-1 mRNA含量高于I/R组和HBO-I组（P＜0.05）;HBO-I组与I/R组ZO-1 mRNA含量接近,差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 HBO干预具有保护单层Caco-2细胞TJ功能作用,抑制TJ开放,机制可能与维持TJ的骨架蛋白ZO-1有关.缺血期前和再灌注期给予HBO干预治疗显示有益结果,HBO预处理疗效最佳,缺血期给予HBO无效.     

血管外膜介导的炎症反应对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察血管外膜介导的炎症反应对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响,并探讨其机制.方法 采用兔颈动脉外膜组织与平滑肌细胞共培养方法,分以下6组,①单独培养组:培养的VSMC中不加外膜组织及药物;②单独培养 脂多糖(LPS,1μg/ml)组;③单独培养 LPS N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME,100mmol/L)组;④复合培养组:培养的VSMC中加入外膜组织块;⑤复合培养 LPS组;⑥复合培养 LPS L-NAME组.用氚-胸腺嘧啶(3H-TdR)检测各组VSMC增殖状态,试剂盒测定培养液中抗超氧阴离子自由基及亚硝酸盐(NO2-)含量,蛋白免疫印迹法检测血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白表达.结果 与单独培养组比较,LPS刺激前,复合培养组VSMC 3H-TdR掺入率、NO2-含量无明显差异,抗超氧阴离子活力单位增高(P＜0.05),HO-1蛋白表达显著增加(P＜0.01);LPS刺激后,复合培养 LPS组VSMC 3H-TdR掺入率显著降低(P＜0.01),抗超氧阴离子活力单位显著增高(P＜0.01),NO2-含量增高(P＜0.05),HO-1蛋白表达显著增加(P＜0.01);复合培养 LPS L-NAME组VSMC 3H-TdR掺入率、NO2-含量、HO-1蛋白表达无明显差异,抗超氧阴离子活力单位显著增高(P＜0.01).结论 血管外膜可通过一氧化氮(NO)及HO-1等途径抑制LPS刺激所致的VSMC增殖.     

异丙酚对脂多糖诱导人单核细胞释放细胞因子的影响

目的观察异丙酚对脂多糖(LPS)诱导人单核细胞(THP1)释放细胞因子的影响。方法将体外培养的THP1细胞分为3组:对照组,1μg/mlLPS刺激组(L组),1μg/mlLPS 50μmol/L异丙酚组(L P组)。采用LiquiChip液相蛋白芯片系统检测3组不同处理因素作用12h时对THP1细胞分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。用不同浓度的异丙酚(0,12.5,25,50,100μmol/L)同1μg/mlLPS联合刺激THP1细胞(分别为B、C、D、E、F组),以未加任何刺激的THP1细胞为对照(A组),分析异丙酚对THP1细胞分泌IL-6、IL-8、TNF-α影响的剂量效应关系。结果与对照组相比,L组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α均明显增高(P<0.01),而GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12的变化差异无统计学意义(P>0.05);与L组相比,L P组THP1细胞释放IL-6、IL-8和TNF-α均明显降低(P<0.01)。与单独LPS刺激组(B组)比较,添加不同浓度异丙酚的各组(C、D、E、F组)IL-6、IL-8和TNF-α释放明显降低(P<0.05或0.01),且随着异丙酚剂量的增加,三者的释放呈递减趋势。结论LPS可诱导THP1细胞释放多种炎性细胞因子,异丙酚可呈剂量依赖性地抑制IL-6、IL-8和TNF-α的释放,这可能是其在内毒素血症的发生和发展中发挥保护作用的分子机制之一。     

白芍配方颗粒对四氯化碳诱导的LO2细胞损伤的影响

目的 观察白芍配方颗粒对四氯化碳(CCl4)致人肝脏LO2细胞损伤的影响,并初步探讨其作用机制.方法 将LO2细胞分为正常对照组、CCl4模型组、白芍配方颗粒组(1、5、10mg/L)、维生素素E(Vit E)组(50mmol/L).除正常对照组外,其余各组细胞预先用相应药物处理24h后,建立CCl4诱导(终浓度10mmol/L,6h)的LO2细胞损伤模型,测定细胞培养上清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)含量,MTT法检测细胞存活率.随后将细胞分为正常对照组、CCl4模型组、白芍配方颗粒组(10mg/L)、Vit E组(50mmol/L),采用高内涵分析(HCA)技术同时观察药物对LO2细胞线粒体膜电位、细胞色素C含量、膜通透性、核DNA含量、核尺寸及形态、细胞数量的影响.结果 与CCl4模型组相比,白芍配方颗粒或Vit E预处理可明显降低ALT、AST水平(P＜0.05或P＜0.01),其中尤以10mg/L白芍配方颗粒组及Vit E组为明显,且白芍配方颗粒各浓度及Vit E可明显减缓CCl4导致的细胞活力下降(P＜0.05或P＜0.01),呈现出一定的浓度依赖性.HCA结果显示,10mg/L白芍配方颗粒及Vit E可明显升高线粒体膜电位(P＜0.01),阻止细胞色素C释放(P＜0.01),降低细胞膜通透性(P＜0.01),并可降低核荧光强度(P＜0.01),增加细胞核尺寸(P＜0.01)及细胞数量(P＜0.05).结论 白芍配方颗粒可明显减轻CCl4诱导的肝细胞损伤,其作用机制可能与保护线粒体膜完整性、降低细胞膜通透性、抑制肝细胞凋亡有关.     

卡巴胆碱对脂多糖刺激人血单核细胞释放炎症介质的影响及其机制研究

目的 探讨卡巴胆碱对脂多糖(LPS)刺激后人外周血单核细胞释放炎症介质的影响及其受体机制.方法 取正常献血者外周血,密度梯度离心法分离单个核细胞,再利用单核细胞的贴壁性,分离获得单核细胞.用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬,调整细胞浓度为2×105/ml后,加入包被了特异性捕获抗体(TNF-α、IL-6、IL,10)的96孔板,观察不同浓度卡巴胆碱(0.01～100 μmol/L)对LPS刺激下单核细胞产生 TNF-α、IL-6、IL-10的影响,并取最佳浓度进行受体机制探讨研究.实验分6组:空白对照(C)组仅加RPMI 1640培养液;LPS单独刺激(L)组仅加100ng/ml LPS刺激;烟碱预处理(N)组及卡巴胆碱预处理(K)组先用卡巴胆碱或烟碱(100μmol/L)预处理单核细胞5min,再加入100ng/ml LPS 刺激;阿托品+卡巴胆碱预处理(A+K)组和α-银环蛇毒素(α-Bgt)+卡巴胆碱预处理(α-Bgt+K)组先在单核细胞悬液中加入胆碱能M受体拮抗剂阿托品或胆碱能N受体α7亚基特异性拮抗剂α-Bgt,5min后给予卡巴胆碱,5min后再给予LPS刺激.孵育12h(TNF-α、IL-6)或24h(IL-10)后,洗去细胞,加入生物素标记的检测抗体,经链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶催化底物显色后,全自动免疫斑点图像分析仪检测TNF-α、IL-6、IL-10含量.结果 LPS单独刺激时,TNF-α、IL-6、IL-10含量较对照组明显升高(P<0.01).用卡巴胆碱或烟碱预处理细胞后,TNF-α、IL-6含量明显下降,与LPS单独刺激组比较差异显著(P<0.01),但IL-10含量则无明显变化.在0.01～100μmol/L浓度范围内,随着卡巴胆碱浓度增加,其对LPS刺激下单核细胞产生TNF-α、IL-6的抑制作用也更加明显.阿托品预处理细胞后,卡巴胆碱对LPS刺激下单核细胞释放TNA-α、IL-6的抑制作用无明显变化,而α-Bgt预处理细胞后,卡巴胆碱对TNF-α、IL-6释放的抑制作用明显减弱.结论 卡巴胆碱同烟碱一样具有强大的抗炎作用,该作用在单核细胞是通过N样胆碱能受体α7亚基实现的.     

高原缺氧致大鼠肠黏膜屏障功能损伤及谷氨酰胺的保护作用观察

目的观察模拟高原环境暴露下大鼠肠黏膜屏障的损伤及谷氨酰胺(Gln)的保护作用,探讨高原肠黏膜屏障损伤与多器官功能障碍综合征(MODS)的关系。方法 30只SD大鼠按随机数字表法分为平原对照组(C组)、高原缺氧组(H组)和Gln保护组(HG组),每组10只。H和HG组动物在模拟海拔7000m的低压舱内生存72h,C组在平原环境下生存72h。观察各组大鼠小肠黏膜组织病理改变、肠上皮细胞凋亡、肠道细菌移位情况,并应用邻联二回香胺显色剂法检测血清和小肠黏膜二胺氧化酶(DAO)的活性,硫代巴比妥酸(TBA)法测定血清丙二醛(MDA)的含量,酶法测定血清超氧化物歧化酶(SOD)的活性和一氧化氮(NO)、Gln的含量。结果 H、HG组大鼠肠黏膜损伤严重,紧密连接间隙增宽,硝酸镧示踪法可见镧颗粒进入上皮细胞紧密连接间隙内以及基底膜外侧周围组织间隙或细胞内。H组肠系膜淋巴结和脾脏有细菌移位,移位细菌数为0.47±0.83CFU/g;HG组各器官移位细菌明显减少,细菌移位数为0.22±0.42CFU/g(P<0.05)。原位末端标记切口平移双标记法(TUNEL法)检测显示,H组肠上皮细胞凋亡细胞数增多,凋亡指数为16.2%±2.2%;与H组比较,HG组肠黏膜损伤明显减轻,肠上皮细胞凋亡细胞数明显减少,凋亡指数为13.3%±4.6%(P<0.05)。与C组血清内毒素(0.032±0.003kEU/L)、血清DAO(0.861±0.359kU/L)、血清Gln(3.083±0.186mmol/L),小肠DAO(0.516±0.062kU/L)、小肠Gln(0.573±0.032mmol/L)比较,H组血清内毒素(0.277±0.053kEU/L)和DAO(3.533±0.584kU/L)水平显著增高,血清Gln(1.472±0.079mmol/L)及小肠DAO(0.325±0.0533kU/L)、Gln(0.377±0.010mmol/L)水平显著降低(P<0.05或P<0.01);与H组比较,HG组血清内毒素(0.113±0.015kEU/L)和DAO(1.810±0.450kU/L)水平显著降低,血清Gln(1.951±0.070mmol/L)及小肠DAO(0.431±0.049kU/L)、Gln(0.448±0.021mmol/L)水平均显著增高(P<0.05)。结论高原缺氧能引起严重的肠黏膜屏障功能损伤,促进细菌和内毒素移位,引发全身炎症反应,是高原MODS发病的重要原因之一。Gln对高原肠黏膜损伤具有一定的保护作用,可降低肠黏膜通透性,减少细菌移位,减轻全身炎症反应。     

脂多糖联合三磷酸腺苷对肺上皮细胞来源A549细胞IL-1β分泌的影响及其机制研究

目的 探讨白细胞介素1β(IL-1β)在脂多糖(LPS)联合三磷酸腺苷(ATP)诱导的人肺上皮细胞来源A549细胞中的表达变化及其机制.方法 以肺上皮细胞来源的A549细胞作为研究对象,采用Western blotting法确认A549细胞中是否存在NLRP3炎症体各组件蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1)的表达.检测不同浓度LPS(0、1、5、10、50、100μg/ml)对A549细胞NLRP3炎症体通路蛋白表达(Western blotting检测)及IL-1β分泌(ELISA法)的影响,选择最佳LPS浓度.采用LPS联合ATP(LPS+ATP)刺激A549细胞,并检测其对NLRP3炎症体通路蛋白表达和IL-1β分泌的影响.采用siRNA干扰A549细胞NLRP3基因,观察LPS+ATP诱导的A549细胞中IL-1β的分泌情况.结果 Western blotting检测结果显示,A549细胞中存在NLRP3炎症体组件蛋白NLRP3、ASC、caspase-1的表达.与对照组比较,LPS单独处理细胞后,NLRP3、pro-IL-1β、caspase-lp45蛋白表达增加(P＜0.05),且呈剂量依赖关系,但未检测到活化形式caspase-lp20蛋白的表达及细胞因子IL-1β的分泌.与LPS单独刺激组相比,LPS+ATP刺激组可检测到活化形式的caspase-lp20蛋白表达及细胞因子IL-lβ分泌(P＜0.05).采用siRNA干扰NLRP3基因表达可显著抑制LPS+ATP诱导的IL-1β表达(P＜0.05).结论 A549细胞中存在NLRP3炎症体通路,LPS+ATP诱导A549细胞分泌的细胞因子IL-lβ在下调NLRP3基因后显著减少,初步提示IL-1β的释放受NLRP3炎症体途径调控.     

谷氨酰胺对正加速度暴露后大鼠肠道屏障损伤的修复作用

目的 观察正加速度(+Gz)暴露对大鼠肠黏膜机械屏障及免疫屏障的损伤,探讨谷氨酰胺(Glutamine,Gln)对损伤的修复作用。方法 24只雄性SD大鼠随机分成3组,每组8只,分别标记为A组(对照组)、B组(+10 Gz组)、C组(+10 Gz+Gln组)。采用动物离心机模拟+Gz暴露,B组大鼠以+10Gz值旋转5 min,每日暴露1次,持续5 d,C组训练方法同B组,训练前灌服用生理盐水配置的Gln溶液。实验结束后次日麻醉大鼠,取大鼠肠黏膜标本及外周血清,镜下观察大鼠肠道组织形态特点,并检测各组大鼠血清D-乳酸、二胺氧化酶(DAO)水平以及用酶联免疫吸附测定肠黏膜分泌型免疫球蛋白A(s Ig A)含量。结果 A组大鼠小肠组织无明显损伤;B组+Gz暴露后的小肠组织损伤最严重;C组小肠组织损伤程度不及B组。与A组相比,B组大鼠血清D-乳酸、DAO水平明显升高(P0.01),s Ig A水平明显降低(P0.01);C组大鼠血清D-乳酸、DAO水平高于A组(P0.05),但s Ig A水平与A组相比差异无统计学意义。B组大鼠血清D-乳酸、DAO水平高于C组(P0.05),s Ig A水平明显低于C组(P0.01)。结论 +Gz暴露可增加大鼠肠道黏膜通透性,破坏大鼠肠道屏障。加速度暴露过程中补充Gln,对屏障损伤有较好的修复作用。     

乳果糖对白细胞介素-18介导肠黏膜屏障的影响

 目的探讨乳果糖对烫伤大鼠肠道组织中白细胞介素-18 mRNA(IL-18 mRNA)表达的影响.方法将大鼠致30%体表面积Ⅲ度烫伤,随机分成烫伤对照组(C组)及乳果糖预防组(L组).采用逆转录PCR技术检测肠组织中IL-18 mRNA水平;以分光光度法检测小肠组织二胺氧化酶(DAO)活性;取回盲部肠系膜淋巴结(MLN)及全血检测细菌含量.结果伤后C组肠组织中IL-18 mRNA表达较伤前增强(P＜0.01),并显著高于L组(P＜0.05);L组在伤后8、16、24 h小肠DAO活性高于C组(P＜0.05),但L组伤后24 h内血培养的细菌阳性率及MLN细菌数量均低于C组(P＜0.05).结论烧伤早期肠道IL-18 mRNA表达明显过度,致肠黏膜屏障遭受损害,细菌/内毒素移位增加,而预先应用乳果糖可在一定程度上保护肠黏膜屏障,减少细菌/内毒素移位.     

正加速度暴露下大鼠肠黏膜屏障损伤及sIgA水平的变化

目的 探讨模拟正加速度(+Gz)暴露对大鼠肠黏膜免疫屏障的影响.方法 32只雄性SD大鼠随机分成4组(n=8),通过动物离心机模拟+Gz暴露.A组大鼠不做处理,B组大鼠以+5Gz值旋转5min,C组大鼠以+10Gz值旋转5min,D组大鼠连续暴露于+5Gz值1.5min、+10Gz值2.0min、+5Gz值1.5min.每日暴露1次,持续5d.实验结束后观察大鼠肠黏膜大体损伤情况及镜下表现,ELISA法检测肠黏膜内分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的含量.结果 +Gz暴露后,与A组相比,其他各组大鼠肠黏膜均有损伤,损伤程度D组＞C组＞B组;ELISA检测显示其他各组大鼠肠黏膜sIgA含量均明显下降(P＜0.05),且sIgA含量D组＜C组＜B组(P＜0.05).结论 +Gz暴露可损伤大鼠肠黏膜,并削弱肠黏膜的免疫屏障功能.     

IFN-γ预处理骨髓间充质干细胞及其抑制小胶质细胞 活化作用的影响

 目的 探讨干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)预处理大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)及其抑制脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS)诱发的小胶质细胞(microglia,MG)活化作用的影响。方法 采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMMSCs,利用含100 ng/ml 的IFN-γ完全培养液对BMMSCs进行预处理;利用LPS(10μg/ml)诱导大鼠小胶质细胞活化。小胶质细胞分离纯化后,以1×10⁵/孔种植于6孔板中,按以下分组将小胶质细胞和BMMSCs以直接接触的方式进行共培养24h:B组(单纯BMMSCs组)、L+B组(LPS+ BMMSCs组)、I+B组(IFN-γ预处理BMMSCs组)、L+I+B组(LPS+IFN-γ预处理BMMSCs组)、M组(单纯MG组)、L+M组(LPS+MG组)、B+L+M组(BMMSCs+LPS+MG组)、I+B+L+M组(IFN-γ预处理BMMSCs+LPS+MG组)。采用ELISA技术检测培养液上清TNF-α、IL-1β水平,免疫荧光法检测小胶质细胞表面标记物CD68表达。结果 L+M组小胶质细胞CD68表达增高,分泌TNF-α、IL-1β含量明显增多;B+L+M组以及I+B+L+M组的小胶质细胞CD68表达水平、TNF-α、IL-1β分泌量低于L+M组,且B+L+M组与I+B+L+M组相比有统计学差异(P＜0.05)。结论 BMMSCs和IFN-γ预处理的BMMSCs均可以直接接触的方式抑制LPS诱发的小胶质细胞的活化且经IFN-γ预处理后的BMMSCs对小胶质细胞活性抑制作用更强。     

谷氨酰胺对热打击下单层肠上皮Caco-2细胞屏障功能的影响

目的 探讨谷氨酰胺(Gln)对热打击后肠黏膜单层上皮细胞屏障通透性改变的影响及可能机制.方法 应用Caco-2细胞株建立肠上皮机械屏障模型,加入Gln培养24h,43℃持续1h热打击.以CCK-8法检测不同浓度Gln(0.4、0.7、1.4、2.1、2.8mmol/L)对细胞增殖的影响,为后续实验选择最适合浓度;Transwell法测定单层跨膜电阻抗(TEER)值和对辣根过氧化物酶(HRP)的通透性;Western blotting检测紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达;采用考马斯亮蓝对细胞骨架进行染色观察.结果 0.7mmol/L的Gln促进细胞增殖的效果最强,与其他浓度相比,差异均有统计学意义(P<0.05).相较于单纯43℃热打击组,0.7mmol/L的Gln可抑制单层上皮细胞TEER的下降和HRP通过率的升高(P<0.01),增加occludin和ZO-1的表达,有益于维持细胞骨架的正常结构.结论 0.7mmol/L的Gln可减轻热打击对单层肠上皮细胞结构的破坏,保护屏障功能.     

NF-κB在电刺激引起C2C12肌管线粒体功能低下时的作用

目的:探讨NF-κB在不同电刺激状态下C2C12肌管粒体功能低下时的作用.方法:采用TY-C型电刺激器(强度为45 V、20 ms、5 Hz)刺激分化6天的C2C12肌管来建立耐力运动时的神经冲动模型,对照组无任何电刺激,实验组分为刺激即刻组、孵育组和对照组,刺激即刻组的刺激时间分别为60分钟、75分钟、90分钟、120分钟、150分钟和180分钟,孵育组刺激120分钟后放入培养箱中继续培养,时间分别为30分钟、60分钟、120分钟和180分钟.测定各组细胞pIKK-α、NF-κB及MnSOD活性变化.结果:与对照组相比,电刺激即刻组C2C12细胞NF-κB活性显著升高(P＜0.O1),且刺激120分钟和150分钟增加明显(P＜0.05),到180分钟时,略有下降.孵育组中孵育120分钟时NF-κB活性较孵育组其它细胞显著增加(P＜0.01);与对照组相比,刺激即刻各组细胞内pIKK-α表达显著增加(P＜0.05),但不同时间电刺激各组之间无显著差别.孵育组中,孵育120分钟细胞pIKK-α蛋白表达与孵育组其他细胞相比显著升高(P＜0.01);与对照组相比,刺激即刻组刺激150分钟时细胞线粒体MnSOD活性显著增加(P＜0.01),孵育组孵育120分钟时C2C12细胞线粒体MnSOD活性显著增加(P＜0.01).结论:(1)在电刺激引起C2C12细胞产生氧化应激,导致细胞线粒体功能的下降中,内源性ROS的产生会激活NF-κB的表达,同时激活IKK-α的磷酸化,且在电刺激强度一定时,NF-κB的活性对电刺激的应答有一定的时相性.(2)随着刺激时间的不同,细胞线粒体MnSOD的活性变化有差异,且线粒体MnSOD活性的变化与刺激时间有关,推测NF-κB的表达上调了细胞内抗氧化物酶MnSOD的表达,这在一定程度上对细胞起到保护作用.     

束缚应激诱导大鼠肠黏膜屏障变化的实验研究

目的建立冷-束缚应激(CRS)诱导肠黏膜屏障破坏大鼠模型,探讨肠黏膜屏障变化在应激发病机制中的作用。方法选取W istar大鼠40只,随机分成模型组和正常对照组。模型组采用寒冷加束缚为应激源实施干预,对照组不予任何干预。实验期间通过直结肠扩张(CRD)实验测定内脏敏感性,取大鼠远端结肠及回肠黏膜行病理组织学检查。采用气相色谱法(GC)测定两组大鼠5h尿液中乳果糖(L)与甘露醇(M)排泄率(L/M)比值,反映肠黏膜屏障的变化情况。8结果模型组初始感觉阈值、疼痛感觉阈值、最大耐受阈值分别较对照组显著降低(P<0.05);两组肠黏膜病理检查均未见明显异常;模型组大鼠5 h尿液中L/M比值较对照组显著增大(P<0.05)。结论应激损伤导致大鼠肠黏膜通透性增大,肠黏膜屏障受损可能与应激发病机制有关。