神经嵴细胞和胰岛因子1阳性细胞与小鼠胚胎心流出道发育的关系

目的 探讨迁移中的细胞视黄酸结合蛋白1(CRABP1)阳性神经嵴细胞、胰岛因子1(ISL-1)、阳性心肌前体细胞与小鼠胚胎心流出道发育的关系.方法 36只胚龄8.5～13d小鼠胚胎心连续石蜡切片,选用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)、抗转录因子ISL-1、抗CRABP1和抗磷酸化组蛋白H3(PHH3)抗体,进行免疫组织化学及免疫荧光染色.结果 胚龄8.5～10d,ISL-1阳性心肌前体细胞相继出现在心背系膜、原始咽两侧、头面部、鳃弓核心间充质和心包腔背侧壁间充质,构成心管流出道发育的第二生心区.胚龄11～13d,ISL-1阳性细胞在咽前方聚集,形成特征性锥体形结构,并向升主动脉、肺动脉干及主肺动脉隔延伸.胚龄9d前,神经嵴细胞散在分布于ISL-1阳性细胞之间,流出道远侧端可见少量CRABP1和ISL-1双阳性细胞.胚龄10d,CRABP1阳性神经嵴细胞分布在ISL-1阳性鳃弓核心间充质周围.随着发育,弓动脉等处的神经嵴细胞逐渐失去CRABP1表达,开始表达α-SMA.结论 ISL-1阳性第二生心区是动态结构,胚龄8.5～10d时,在神经嵴细胞配合下,向心管动脉端添加心肌细胞;胚龄11d后,开始向平滑肌方向分化,参与升主动脉、肺动脉干和主肺动脉隔的发育.     

神经嵴细胞和胰岛因子-1阳性细胞与小鼠胚胎心动脉端的发育

目的:探讨神经嵴细胞和胰岛因子-1(ISL-1)阳性细胞与小鼠胚胎心动脉端发育的关系.方法:胚龄8～12 d小鼠胚胎心连续石蜡切片,进行免疫组织化学检测.结果:α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、心肌肌球蛋白重链(MHC)、转录因子ISL-1、激活蛋白-2α(AP-2α)的表达胚龄8d,AP-2α阳性神经嵴细胞主要表达于神经褶外胚层.胚龄9～11 d,AP-2α阳性神经嵴细胞在前肠两侧沿弓动脉逐渐迁移至流出道头端心内膜垫,并形成主肺动脉隔雏形.胚龄8～10 d,ISL-1阳性细胞分布于前肠及神经沟两侧中胚层,构成第2生心区,向流出道添加心肌细胞.胚龄10～11 d,ISL-1阳性细胞在前肠腹侧正中间充质中聚集、与AP-2α阳性细胞共同参与主肺动脉隔形成.心包腔背侧脏壁中胚层及鳃弓核心间充质的ISL-1阳性细胞与流出道α-SMA或MHC阳性心肌相延续.胚龄12d,主肺动脉隔及流出道心内膜垫失去AP-2α及ISL-1阳性表达,转变为α-SMA阳性表达结构.结论:AP-2α阳性心神经嵴细胞和第2生心区来源的ISL-1阳性心前体细胞共同参与了小鼠心动脉端的形态发生.胚龄8～10 d,ISL-1阳性细胞分化为流出道心肌细胞.胚龄10～12 d,ISL-1阳性心前体细胞与AP-2α阳性细胞共同参与了主肺动脉隔的形成和流出道的分隔.     

小鼠胚胎心脏流出道嵴的发育

目的探讨小鼠胚胎心脏流出道嵴内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性细胞的来源及流出道嵴融合时间充质细胞超微结构的变化。方法用抗α-SMA、抗α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)单克隆抗体、PlexinA2探针,对胚龄10～14d小鼠胚胎心脏切片进行免疫组织化学和原位杂交染色;透射电镜观察胚龄12.5d时小鼠心流出道嵴的融合过程。结果胚龄10～11d,小鼠神经管及其周围、动脉囊和弓动脉壁可见PlexinA2阳性细胞,并沿动脉囊壁迁入流出道嵴内,部分细胞同时表达α-SMA。胚龄12d,PlexinA2阳性细胞分布在脊神经节、咽前间充质、主肺动脉隔以及主、肺动脉壁。主肺动脉隔显α-SMA强阳性,但动脉壁仅见少量α-SMA阳性细胞。胚龄12.5d,流出道嵴内致密间充质细胞团形成并开始融合,PlexinA2表达较弱,α-SMA表达呈强阳性。在流出道嵴融合开始后,嵴表面的内皮细胞带形成继而断裂消失,由含微丝少、排列稀疏的间充质细胞取代。两侧致密细胞团逐渐靠拢、融合。有的间充质细胞内含较多线粒体和微丝,细胞之间形成细胞连接点;有的间充质细胞含微丝少,细胞膜间断融合。结论流出道心内膜垫内α-SMA阳性间充质细胞来自神经嵴;内皮细胞-间充质细胞转化可能参与了流出道嵴融合;致密细胞团内间充质细胞富含微丝束和细胞连接点或发生细胞膜融合有助于流出道嵴的融合。     

小鼠胚胎呼吸内胚层形态发生与咽前间充质发育及流出道分隔的关系

目的 探讨呼吸内胚层与咽前间充质细胞发育的关系及对小鼠胚胎心流出道分隔的影响。方法 45只胚龄8~13d小鼠胚胎心连续石蜡切片,用抗胰岛因子1（ISL-1）、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗音猬因子（音速波状蛋白, Shh）、抗patched（Ptc1）、抗patched 2（Ptc2）、抗smoothened（Smo）及抗心肌肌球蛋白重链（MHC）抗体进行免疫组织化学及免疫荧光染色。 结果 胚龄8～9d,ISL-1阳性细胞分布在心包腔背侧壁及前肠两侧间充质,并延伸至原始心管动脉端,心管心肌显较强的Ptc1和Ptc2阳性表达。胚龄10~13d,呼吸内胚层向腹侧延伸,Ptc1和Ptc2呈较强表达,ISL-1阳性咽前间充质细胞围绕呼吸内胚层形成对称的特征性锥体形结构,经动脉囊背侧壁伸入动脉囊腔,形成主肺动脉隔。胚龄12d,主肺动脉隔ISL-1阳性表达基本消失,大部分细胞转变为α-SMA阳性细胞。 结论 呼吸内胚层的分化发育与咽前ISL-1阳性间充质细胞的发育聚集密切耦联。发育中的呼吸内胚层可能作为组织中心,通过Shh信号通路对ISL-1阳性细胞的聚集提供位置信息。呼吸内胚层的正常腹侧延伸不但可诱导ISL 1阳性细胞的正常迁移和流出道的正常分隔,对流出道的正常形态发生及有效的肺循环建立起重要作用。     

小鼠胚胎心脏房室管心内膜垫发育的形态学特征

目的 探讨小鼠胚胎心脏房室管心内膜垫的形成与融合过程中的形态学特征。方法 选用抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗磷酸化组蛋白H3（PHH3）抗体,对30只胚龄9～13d小鼠胚胎连续切片进行HE和免疫组织化学染色。另选15只胚龄12d、12.5d、13d小鼠胚胎心脏制作半薄切片和超薄切片进行观察。 结果 胚龄9d,心房与心室之间可见缩窄的房室管,房室管的心胶质较厚,但未见间充质细胞出现。胚龄10d,房室管心内膜垫开始形成,但连续切片观察显示背侧心内膜垫体积大于腹侧心内膜垫,且背侧心内膜垫对应的α-SMA、MHC阳性房室管心肌向心内膜垫内有明显延伸。心内膜垫内间充质细胞不表达α-SMA或PHH3。胚龄11～12d,背、腹侧心内膜垫变得对称,垫内间充质细胞增多,偶见α-SMA或PHH3阳性细胞。胚龄12～13d,两侧房室管心内膜垫彼此接近开始融合。透射电子显微镜下观察仅部分间充质细胞相邻细胞膜彼此相贴,局部形成细胞连接。胞质内可见粗面内质网、线粒体等细胞器,微丝较少。 结论 小鼠胚胎心脏房室管心内膜垫形成时首先表现为内皮细胞由扁平变为立方形;两侧房室管心内膜垫形成不同步;房室管心内膜垫融合时间充质细胞局部形成细胞连接,胞质内微丝少,与流出道嵴融合时的超微结构特点不同。     

小鼠胚胎心流出道心内膜垫的形成与融合

目的观察不同发育时期小鼠胚胎心流出道心内膜垫的发育过程。方法对胚龄9-12d小鼠胚胎心脏连续切片进行HE染色和免疫组化染色。结果胚龄10d,流出道远端心胶质内开始观察到间充质细胞。胚龄11d,两侧流出道心内膜垫形成,心内膜垫内部分间充质细胞染色呈α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性。胚龄12d,两侧流出道心内膜垫内部分间充质细胞聚集形成致密漩涡状结构,随着心内膜垫融合,两侧漩涡状结构融合。结论小鼠胚胎流出道心内膜垫形成于胚胎发育第11天,第12天融合,间充质细胞参与心内膜垫融合。     

呼吸内胚层相关第二生心区与小鼠胚胎流出道远端的形态发生

目的探讨小鼠胚胎呼吸内胚层相关第二生心区(PSHF)发育与流出道远端形态发生的关系。方法用免疫蛋白印迹法检测抗胰岛因子-1(ISL-1)在80例胚龄10~14 d小鼠胚胎心脏标本的表达。另用抗ISL-1、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及抗心肌肌球蛋白重链(MHC)抗体,对36例胚龄11~13 d小鼠胚胎心连续石蜡切片进行免疫组织化学或免疫荧光染色。结果胚龄11~12 d是ISL-1蛋白在小鼠胚胎心脏表达的高峰时段。胚龄11 d,来自鳃弓或心包腔背侧壁等处PSHF的ISL-1阳性细胞延伸进入流出道远端管壁,流出道远端管壁则失去MHC表达,呈α-SMA阳性表达;来自PSHF的ISL-1阳性细胞则围绕呼吸内胚层呈对称性锥体结构分布,锥体顶端突入动脉囊腔呈ISL-1阳性突起。胚龄11.5 d,PSHF锥体顶端进入动脉囊头侧和尾侧管壁,形成流出道远端管壁上对称的ISL-1阳性柱结构;而动脉囊腔尚未分隔,流出道远端仍为单一管道。胚龄12 d,PSHF锥体突起失去ISL-1表达,呈较强的α-SMA表达。在PSHF锥体突起与流出道嵴融合前,两者之间出现主-肺动脉孔;两者融合后则形成α-SMA阳性的暂时性主-肺动脉隔,将动脉囊分隔成MHC阴性的心包内的主动脉和肺动脉。胚龄13 d,主-肺动脉隔逐渐消失,心包内主动脉和肺动脉分离。在MHC阴性的心包内大动脉管壁上出现了α-SMA阳性的平滑肌层,仍可见少量PSHF的ISL-1阳性细胞延伸进入心包内大动脉管壁。结论在小鼠胚胎发育11~13 d,PSHF将动脉囊分隔成心包内的主动脉和肺动脉,并参与心包内大动脉的侧面管壁和对侧面管壁的分化形成。     

人胚胎早期心脏流出道的发育

目的探讨人胚早期心脏流出道的发育机制。方法29例C10~C16期[Carnegie分期法,受精后(22±1~37)d]人胚心脏连续切片,经抗α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、抗α横纹肌肌动蛋白(α-SCA)、抗肌球蛋白重链(MHC)和抗活性Caspase-3抗体免疫组织化学染色,探讨心包腔背侧脏壁中胚层上皮、咽前间充质及动脉囊与心肌性流出道发生的关系。结果人胚发育C10~C15期,由于流出道由颈部向胸部移位及心包腔向胚胎背侧扩展,动脉囊逐渐突向心包腔内,其表面的心包腔背侧脏壁中胚层上皮不断分化为α-SCA和MHC阳性流出道心肌细胞。迁移至流出道动脉端前后壁的咽前间充质在C15期发生凋亡,流出道心肌细胞迁入间充质细胞团内取代凋亡的间充质细胞。C12期始,α-SMA阳性细胞在流出道心内膜垫聚集,参与形成螺旋状流出道嵴。C15~C16期,动脉囊后壁的α-SMA阳性细胞增生,形成主肺动脉隔,将动脉囊分隔为心包内升主动脉和肺动脉干。结论心包腔背侧脏壁中胚层是人胚心脏第二生心区,可不断分化为心肌细胞,使胚胎心肌性流出道长度增加。细胞凋亡染色提示,并非所有迁入流出道的咽前间充质细胞都可分化为心肌细胞。流出道嵴和主肺动脉隔的α-SMA阳性细胞可能来自神经嵴,经不同路线迁移至流出道嵴和主肺动脉隔。     

小鼠胚胎心流出道心肌性隔的形成机制

目的:探讨小鼠胚胎心流出道近端心肌性隔的形成机制与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性细胞的功能。方法:免疫组织化学方法对12～16d小鼠胚胎心连续切片进行染色。用TUNEL染色对13～15d小鼠胚胎心切片进行染色。结果:胚龄12d,流出道嵴内观察到少量α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)阳性的心肌细胞。胚龄13～14d,流出道壁α-SCA阳性的心肌细胞向间充质隔内长入。隔中央可见α-SCA阳性细胞独立存在。胚龄15～16d,流出道近端心肌性隔形成。胚龄13～15d,间充质隔中央凋亡细胞逐渐增多。结论:流出道近端心肌性隔形成的机制包括心肌化、募集与间充质细胞的原位分化。在此过程中,部分α-SMA阳性细胞凋亡;未凋亡的mSMA阳性细胞可能原位转分化为心肌细胞。     

α-平滑肌肌动蛋白在人胚心流出道早期发育中的表达

目的 探讨人胚早期心流出道心肌和流出道心内膜垫内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达规律及其意义. 方法 32例C10～C16期[Carnegie分期法,受精后(22±1～37)d]人胚心连续切片,经抗α-SMA、抗α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)、抗肌球蛋白重链(MHC)抗体免疫组织化学染色,观察流出道重塑过程中α-SMA在心肌与心内膜垫内的表达规律. 结果 人胚发育C10～C15期,心包腔背侧脏壁上皮不断分化为心肌细胞添加至流出道远端,这些心肌细胞α-SMA的表达早于α-SCA和MHC.C16期,流出道嵴近心肌处出现α-SMA强阳性细胞,相邻的心肌细胞伸出突起与其相连.C12～C15期,α-SMA阳性细胞逐渐迁入流出道心内膜垫内,同时可见流出道内皮转为α-SMA阳性,向间充质细胞分化.不同来源的间充质细胞共同参与形成螺旋状流出道嵴. 结论 α-SMA可作为心肌细胞早期分化的标志;流出道嵴内α-SMA阳性细胞可能部分来自神经嵴,部分为正在向间充质细胞分化的内皮细胞.     

音猬因子与胰岛素增强子结合蛋白在小鼠胚胎呼吸系统的早期表达

目的 探讨音猬因子信号通路成员与胰岛素增强子结合蛋白在呼吸系统的早期表达与其发育的联系。方法 胚龄9.0～13d小鼠胚胎呼吸系统各年龄段不小于3个,连续石蜡切片,用抗音猬因子(Shh)、抗patched1(Ptcl)、抗smoothened(Smo)、抗胰岛素增强子结合蛋白(ISL1)和抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体进行免疫组织化学染色。结果 胚龄10d,Shh表达在前肠内胚层腹侧壁。胚龄11～12d,Ptc1表达在气管、支气管和肺内分支上皮。胚龄13d,Ptc1只表达在肺内分支上皮。胚龄9d,ISL1表达在前肠内胚层腹侧壁。胚龄10～12d,ISL1表达在前肠（气管）腹侧壁和支气管侧壁上皮及邻近的间充质内。胚龄13d,ISL1表达减弱,始终未见在肺内有阳性表达。胎龄12～13d,与气管后壁、支气管内侧壁上皮Ptc1表达减弱处相邻的间充质出现α-SMA阳性平滑肌细胞,其与对侧间充质ISL1阳性细胞的分布呈背-腹侧或内-外侧模式。气管腹侧及肺芽外侧间充质中可见ISL1与Smo共表达细胞。 结论 ISL1在气管及肺芽的发育中可能与Shh信号系统协同发挥作用。     

小鼠胚胎呼吸内胚层相关第二生心区的发育

目的探讨小鼠胚胎心流出道分隔过程中,前肠呼吸内胚层与咽前第二生心区细胞发育的形态学关系及机制。方法胚龄9~13d小鼠胚胎标本各6例,连续石蜡切片,用抗转录因子叉头框蛋白A2(Foxa2)、抗胰岛因子1(ISL-1)、抗patched1(Ptc1)、抗patched 2(Ptc2)、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及抗心肌肌球蛋白重链(MHC)抗体进行免疫组织化学及免疫荧光染色。结果胚龄9~9.5d,前肠腹侧壁ISL-1阳性内胚层局部增厚,呼吸内胚层开始发育,ISL-1阳性间充质细胞紧随其后开始出现在呼吸内胚层周围的基质中。胚龄10~11.5d,呼吸内胚层向动脉囊方向生长延伸向喉-气管沟演变,ISL-1阳性咽前间充质细胞围绕呼吸内胚层呈对称的特征性锥体形结构分布,锥体顶端突入动脉囊腔向主-肺动脉隔发育。在喉-气管沟发育过程中,总能观察到1条实心内胚层细胞索位于其腹侧顶端,Ptc1和Ptc2主要局限于发育中的喉-气管沟及实心细胞索表达,喉-气管沟及实心细胞索的内胚层则位于锥体结构的中心。胚龄12~13d,在流出道水平前肠分隔形成气管,内胚层细胞索逐渐消失,气管上皮逐渐失去Ptc1和Ptc2表达,气管腹侧的ISL-1阳性间充质细胞密度明显减低,并逐渐停止向流出道添加,动脉囊分隔完成。结论呼吸内胚层的分化发育与咽前ISL-1阳性第二生心区细胞的发育聚集密切耦联。音猬因子(SHH)信号系统在呼吸内胚层发育过程中活跃程度较高,发育中的呼吸内胚层可能作为组织中心,通过SHH信号通路诱导ISL-1阳性细胞的聚集,并通过内胚层生长延伸造成的机械牵拉力驱动ISL-1阳性细胞迁移,参与流出道正常形态发生。     

The distribution and characterization of HNK-1 antigens in the developing avian heart

The heart originates from splanchnic mesoderm and to a lesser extent from neural crest cells. The HNK-1 monoclonal antibody is a marker for early migrating neural crest cells, but reacts also with structures which are not derived from the neural crest. We investigated whether heart structures are HNK-1 positive before neural crest cells colonize these target tissues. To that end, we determined the HNK-1 antigen expression in the developing avian heart on immunohistochemical sections and on Western blots. The HNK-1 immunoreactivity in the developing chick heart is compared with data from literature cm the localization of neural crest cells in chick/quail chimeras. Structures with neural crest contribution, including parts of the early outflow tract and the related endocardial cushions, the primordia of the semilunar valve leaflets and the aorticopulmonary septum were HNK-1 positive. Furthermore, other structures were HNK-1 positive, such as the atrioventricular cushions, the wall of the sinus venosus at stage HH 15 through 21, parts of the endocardium at E3, parts of the myocardium at E6, and the extracellular matrix in the myocardial base of the semilunar valves at E14. HNK-1 expression was particularly observed in morphologically dynamic regions such as the developing valves, the outflow tract cushion, the developing conduction system and the autonomie nervous system of the heart. We observed that atrioventricular endocardial cushions are HNK-1 positive. We conclude that: a HNK-1 immunoreactivity does not always coincide with the presence of neural crest cells or their derivatives; (2) the outflow tract cushions and atrioventricular endocardial cushions are HNK-1 positive before neural crest cells are expected (stage HH 19) to enter the endocardial cushions of the outflow tract; (3) the observed spatio-temporal HNK-1 patterns observed in the developing heart correspond with various HNK-1 antigens. Apart from a constant pattern of HNK-1 antigens during development, stage-dependent HNK-1 antigens were also found.     

Fgfr1 regulates patterning of the pharyngeal region

Development of the pharyngeal region depends on the interaction and integration of different cell populations, including surface ectoderm, foregut endoderm, paraxial mesoderm, and neural crest. Mice homozygous for a hypomorphic allele of Fgfr1 have craniofacial defects, some of which appeared to result from a failure in the early development of the second branchial arch. A stream of neural crest cells was found to originate from the rhombomere 4 region and migrate toward the second branchial arch in the mutants. Neural crest cells mostly failed to enter the second arch, however, but accumulated in a region proximal to it. Both rescue of the hypomorphic Fgfr1 allele and inactivation of a conditional Fgfr1 allele specifically in neural crest cells indicated that Fgfr1 regulates the entry of neural crest cells into the second branchial arch non-cell-autonomously. Gene expression in the pharyngeal ectoderm overlying the developing second branchial arch was affected in the hypomorphic Fgfr1 mutants at a stage prior to neural crest entry. Our results indicate that Fgfr1 patterns the pharyngeal region to create a permissive environment for neural crest cell migration.     

An in vitro model for characterizing the post-migratory cranial neural crest cells of the first branchial arch.

The cranial neural crest (CNC) is a transient cell population that originates at the crest of the neural fold and gives rise to multiple cell types during craniofacial development. Traditionally, researchers have used tissue explants, such as the neural tube, to obtain primary neural crest cells for their studies. However, this approach has inevitably resulted in simultaneous isolation of neural and non-neural crest cells as both of these cells migrate away from tissue explants. Using the Wnt1-Cre/R26R mouse model, we have obtained a pure population of neural crest cells and established a primary CNC cell culture system in which the cell culture medium best supports the proliferation of E10.5 first branchial arch CNC cells and maintains these cells in their undifferentiated state. Differentiation of CNC cells can be initiated by switching to a differentiation medium. In this model, cultured CNC cells can give rise to neurons, glial cells, osteoblasts, and other cell types, faithfully mimicking the differentiation process of the post-migratory CNC cells in vivo. Taken together, our study shows that the Wnt1-Cre/R26R mouse first branchial arch provides an excellent model for obtaining post-migratory neural crest cells free of any mesodermal contaminants. The cultured neural crest cells are under sustained proliferative, undifferentiated, or lineage-enhanced conditions, hence, serving as a tool for the investigation of the regulatory mechanism of CNC cell fate determination in normal and abnormal craniofacial development.