HIV-1病毒Nef基因克隆、表达、纯化及其抗体的制备

目的:运用基因工程方法制备HIV-1 Nef重组蛋白及其抗体.方法:用PCR技术从HIV-1 H×B2质粒中扩增HIV-1 Nef基因,将测序鉴定过的HIT-1 Nef基因克隆到原核表达载体pET28a( )上,应用酶切鉴定、测序、SDS-PAGE及Western blot等方法鉴定基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.纯化的重组蛋白免疫兔3次后,ELISA法测定兔多克隆抗体滴度.用其制备的多克隆抗体通过免疫组织化学方法测定表达Nef基因的内皮细胞.结果:成功地构建了Nef基因的原核表达质粒,测序证明HIV-1 Nef基因全长为621 bp,编码206个氨基酸.在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白为包涵体的形式.HIV-1 Nef蛋白N端融合6×His标签便于纯化及鉴定.获得的高纯度HIT-1 Nef融合蛋白,免疫动物后,可产生特异的高滴度抗体(ELISA滴度达1∶10000).将转染Nef基因的内皮细胞,应用免疫组化的方法证明其抗体有高度的特异性.结论:构建了高表达HIT-1 Nef蛋白的原核表达系统,制备的Nef重组蛋白免疫动物,获得了特异、高效价的抗体,为研究Nef基因的生物学活性提供了实验材料和依据.     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

兔抗人Rig-I蛋白N端CARD结构域多克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备人维甲酸诱导基因I(hRig-I)N端CARD结构域(hRig-I-N)多克隆抗体.方法:从逆转录病毒载体MigRI-hRig-I中扩增hRig-I基因N端CARD结构域852 bp长度的基因片段,克隆入pGEX-4T3中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,表达GST-hRig-I-N融合蛋白,将表达的融合蛋白纯化,免疫家兔制备抗体,并以间接ELISA法测定抗体效价,以Western blot、细胞免疫荧光方法鉴定抗体的特异性.结果:在大肠杆菌中成功表达融合蛋白GST-hRig-I-N,ELISA法检测抗体的效价达到1:125 000,Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示抗体可与原核及真核表达的hRig-I-N蛋白特异结合.结论:制备了高效价、高特异性的hRig-I-N抗体,为进一步研究hRig-I-N的功能奠定了基础.     

细胞分选蛋白17多克隆抗体的制备和鉴定及在小鼠体内的表达 

目的 制备细胞分选蛋白家族成员细胞分选蛋白17（SNX17）的多克隆抗体,为深入研究SNX17奠定基础。方法 PCR扩增编码人SNX17C端270个氨基酸的cDNA片段,DNA重组入原核表达载体pGEX-4T-1和pMal-C2x,转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导分别表达GST-SNX17C端和MBP-SNX17C端融合蛋白。采用电泳纯化的GST-SNX17C端融合蛋白于第1天,第28天,第42天3次免疫新西兰白兔。采用亲和层析和分子筛纯化的MBP-SNX17C端融合蛋白,酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清中多克隆抗体的效价,于第56天取兔全血,析出血清,纯化IgG。免疫印迹法检测SNX17兔多克隆抗体的有效性和特异性, 免疫印迹法检测小鼠30种器官中SNX17的表达。结果 成功构建了pGEX-4T-1/SNX17C端     

人Polycomb家族成员NSPc1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的Polycomb家族成员NSPc1多克隆抗体的制备与检测。方法应用PCR技术扩增人NSPc1编码区全长序列并插入到pET-43.1a（＋）载体中,在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白HIS-NSPc1。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人NSPc1多克隆抗体。用Western blot检测抗体免疫反应的特异性。结果在大肠杆菌中表达并纯化了人NSPc1重组蛋白,纯度达95%,用其免疫新西兰大白兔,成功制备了相应兔源多克隆抗体,Western blot实验中该抗体可以特异识别内源及外源性NSPc1蛋白。结论原核表达的NSPc1融合蛋白可以被纯化,并具有足够的蛋白免疫原性,所制备的相应多克隆抗体具有良好的特异性,可以运用于NSPc1基因的功能研究。     

人Polycomb家族成员NSPc1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的 Polycomb家族成员NSPc1多克隆抗体的制备与检测。方法 应用PCR技术扩增人NSPc1编码区全长序列并插入到pET-43.1a(+)载体中，在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白HIS-NSPc1。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His 标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔，获得兔抗人NSPc1多克隆抗体。用Western blot检测抗体免疫反应的特异性。结果 在大肠杆菌中表达并纯化了人NSPc1重组蛋白，纯度达95％，用其免疫新西兰大白兔，成功制备了相应兔源多克隆抗体，Western blot实验中该抗体可以特异识别内源及外源性NSPc1蛋白。结论 原核表达的NSPc1融合蛋白可以被纯化，并具有足够的蛋白免疫原性，所制备的相应多克隆抗体具有良好的特异性，可以运用于NSPc1基因的功能研究。     

果蝇jumeaux蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的原核表达及纯化重组果蝇jumeaux(jumu)蛋白,制备大鼠抗果蝇jumu多克隆抗体。方法用RT-PCR方法扩增jumu基因,并将其克隆到原核表达载体pRSETA中,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导His-jumu融合蛋白的表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot方法鉴定基因片段的正确性及蛋白表达的特异性后,用Ni-NTA亲和层析柱纯化带有6×His标签的融合蛋白,用纯化后的蛋白免疫SD大鼠制备多克隆抗体。以Western blot、免疫荧光染色法鉴定抗体的特异性,并用制备的抗体检测jumu在果蝇不同器官中的表达情况。结果成功构建了pRSETA-jumu原核表达质粒,jumu融合蛋白在大肠杆菌内高表达并纯化,免疫SD大鼠得到抗jumu多克隆抗体。用Western blot和免疫荧光染色检测发现制备的抗体有较强的特异性,并能检测内源性蛋白。通过免疫荧光染色发现jumu的表达存在组织特异性,且在唾液腺中的表达量最高。结论成功获得了抗jumu蛋白的特异性抗体,为进一步研究jumu蛋白的功能和作用机制奠定了基础。     

果蝇polycomblike蛋白多克隆抗体的制备及纯化

目的构建、表达并纯化polycomblike(Pcl)6×His融合蛋白,制备该融合蛋白的大鼠多克隆抗体,纯化并鉴定该多克隆抗体。方法通过PCR反应从野生型果蝇W1118成虫cDNA中扩增Pcl基因部分片段,构建pRSETA-Pcl重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,Ni-NTA superflow层析柱纯化该融合蛋白,Western-blotting分析检测。用纯化的融合蛋白免疫SD大鼠,制备抗Pcl的多克隆抗体,溴化氰活化琼脂糖凝胶4B偶联法纯化多克隆抗体,Western-blotting检测该抗体的效率及特异性。结果成功构建原核表达质粒pRSETA-Pcl,大量表达并纯化Pcl融合蛋白。免疫大鼠获得多克隆抗体并纯化,Western-blotting及免疫组织化学染色结果表明该抗体可以检测Pcl全长蛋白及内源性蛋白。结论本研究获得了纯化的Pcl融合蛋白,成功制备并纯化了特异性较高的抗Pcl多克隆抗体,为进一步研究Pcl基因的功能奠定了基础。     

SARS冠状病毒N蛋白的克隆与表达

目的　克隆和表达SARS冠状病毒N蛋白 ,并分析其免疫学活性。方法　采用RT PCR从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码N蛋白的基因 ;经克隆和测序分析后 ,亚克隆至表达载体pGEX 4T 2 ,转化大肠杆菌JM10 9,PCR和双酶切鉴定 ;阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS PAGE分析 ;大量诱导表达N蛋白 ,亲和层析予以纯化 ;免疫印迹分析纯化蛋白对SARS的诊断效果 ;用纯化的融合蛋白免疫小鼠观察其诱导的抗体应答。结果　RT PCR扩增出N蛋白基因的特异片段 ,获得的阳性克隆序列与Gen Bank中登录的SARS冠状病毒的N蛋白基因序列同源性为 99.8% ;N蛋白基因被亚克隆到表达载体pGEX 4T 2 ,在JM10 9中表达了N蛋白 ,表达的蛋白经亲和层析获得纯化 ;纯化蛋白能被SARS病人血清识别 ;免疫小鼠诱导产生了高滴度的抗体。结论　成功构建了SARS冠状病毒N蛋白的重组表达质粒 ,在大肠杆菌中表达的N蛋白融合蛋白具有良好的免疫学活性。     

CML66基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的:获得原核表达的新的肿瘤抗原CML66蛋白,并制备兔多克隆抗体。方法:采用RT-PCR技术从睾丸中获得cML66的cDNA,亚克隆至pGEMT载体中,经测序确证后,将该基因插入原核表达载体pET32b( )中,通过电穿孔技术转化E.coli表达菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2 亲和柱层析纯化。通过SDS-PAGE、Westernblot鉴定后,应用纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。结果:获得的CML cDNA序列与GenBank登录的cDNA序列 一致。用纯化的目的蛋白免疫家兔后,获得高滴度的特异性兔抗血清。结论:成功地克隆CML66基因,建立了原核表达、纯化体系。制备纯化的CML66蛋白和高滴度、特异的兔抗血清。     

GST-snail融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的制备snail多克隆抗体,为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具。方法PCR扩增编码人snail 264个氨基酸的cDNA全长片段,DNA重组入原核表达质粒pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基-β—D-硫代半糖苷（IPTG）诱导表达GST／Snail融合蛋白。经电泳纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备抗血清。通过ELISA、免疫荧光和免疫印迹法鉴定血清特异性和效价。结果成功构建了pGEX-4T-1／snail原核表达载体,转化BL21后可高效表达融合蛋白GST—snail,免疫产生的snail多抗可特异检测snail真核表达载体转染COS-7细胞后snail的表达及定位情况。结论获得了效价和特异性都良好的snail抗体,适合对snail的检测应用。     

人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础。方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4。构建好的质粒在E.coli BL21(DE3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定。结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95%以上。ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Westernblot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白。结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体。     

兔抗人唾液酸转运蛋白抗体的制备及特性鉴定

目的：制备兔抗人唾液酸转运蛋白（sialin）的抗体，并进行特性鉴定。方法：应用RT—PCR从培养的人颌下腺细胞系HSG中扩增编码sialin N端1～38氨基酸的DNA序列，构建重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin，测序鉴定后，转化大肠杆菌JM109，在0．1 mmol／L IPTG的诱导下表达GST—sialin融合蛋白。经SDS-PAGE鉴定后，利用GSTrap FF^TM柱纯化融合蛋白，并以其免疫家兔制备抗人sialin抗体。用ELISA法测定兔抗sialin血清的效价；用Western blot及免疫细胞化学等方法鉴定抗血清的特异性。结果：构建了重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin；以其转化大肠杆菌在IPTG诱导下，获得以可溶性形式表达的GST-sialin融合蛋白；表达的GST—sialin经GSTrap FF^TM柱纯化后，免疫家兔制备出抗sialin抗血清，ELISA法测定抗血清的效价为1：32000。Western blot鉴定表明，制备的抗sialin抗体可特异地识别HSG细胞中相对分子质量（Mr）约55000的sialin蛋白。免疫细胞化学检测表明，sialin抗血清识别的抗原定位于HSG细胞的细胞质和胞核。结论：成功地制备出兔抗人sialin抗血清，为进一步研究sialin在涎腺组织的功能奠定了基础。     

人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建人β防御素4(human β defensin 4,HBD4)基因的原核融合表达载体PGEX-4T-2/mHBD4,诱导GST-HBD4融合蛋白在大肠杆菌中表达,并制备其多克隆抗体.方法:从重组克隆载体PMD18-T/HBD4中扩增HBD4成熟肽编码基因,并克隆入PGEX-4T-2中,在IPTG诱导下,表达GST-HBD4融合蛋白.以表达的融合蛋白GST-HBD4作为免疫原免疫家兔制备抗GST-HBD4的抗血清,抗体效价及特异性分别用ELISA和Western blot法鉴定.结果:在大肠杆菌中成功表达Mr约为32 000的融合蛋白GST-HBD4.ELISA法检测抗血清的效价可达到1:128 000,Western blot分析抗血清可与原核表达的融合蛋白GST-HBD4特异结合.结论:在大肠杆菌中成功表达了GST-HBD4融合蛋白,并制备了GST-HBD4的抗血清,为进一步研究HBD4蛋白的结构和功能奠定了基础.     

Preparation and characterization of the polyclonal antibody against pig integrin beta6 subunit LBD as FMDV receptor

AIM: To induce the expression of FMDV receptor integrin beta6 subunit ligand-binding domain in E.coli and prepare the rabbit polyclonal antibody against it. METHODS: The fragment coding beta6 ligand-binding domain was amplified by PCR and doubly digested with BamH Iand Xho I. Then it was cloned into expression vector pGEX-4T-1 to obtain recombinant plasmid pGEX-4T-1-beta6LBD. After pGEX-4T-1-beta6LBD was transformed into E.coli BL21(DE3) and induced by IPTG, the expression of fusion proteins was identified by SDS-PAGE, with inclusion body prepared and fusion protein purified. Then new Zealand rabbits were immunized to prepare polyclonal antibody against beta6LBD. GST-beta6LBD antiserum was obtained and the specificity of polyclonal antibody was detected by Western blot. RESULTS: SDS-PAGE demonstrated that the fusion protein GST-beta6LBD was expressed with the expected molecular weight at 42 000. A single clear band of GST-beta6LBD fusion protein appeared in SDS-PAGE gel after purification. The titer of the polyclonal antibody was above 1:12 800 and it is of high specificity. CONCLUSION: The successful preparation of rabbit anti pig beta6LBD polyclonal antibody with high affinity and specificity will lay a foundation for further research into the function of integrin beta6 in FMDV infection.     

RKIP蛋白在多个人肺癌细胞系中的表达下调

目的检测肺癌细胞系中RKIP的表达情况,探讨其与肺癌细胞侵袭、转移的关系。方法RT-PCR法检测多个人肺癌细胞系中RKIP的表达情况,构建表达人RKIP的融合蛋白,纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。ELISA鉴定血清特异抗体效价,Western blot鉴定血清特异抗体并检测肺癌细胞系中RKIP表达。结果成功构建表达人RKIP的融合蛋白,制备的多抗效价达到106,可特异检测细胞内RKIP表达;有转移性的3个肺癌细胞系中RKIP表达明显下调,且在转移性较高的A549细胞中下调更明显。结论获得了效价和特异性都良好的RKIP多抗,适合应用于RKIP的检测。RKIP表达下调与肺癌细胞侵袭、转移有关,有可能成为肺癌治疗的靶点。     

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：表达F10蛋白，并制备兔抗F10多克隆抗体。方法：利用PCR方法扩增F10基因片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后连接人pET-GST原核表达载体，构建的pET-GST／F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌B121，经IPTG诱导表达蛋白，并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS—PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗F10的多克隆抗体，并以ELISA法检测抗体效价。结果：经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS—PAGE电泳分析显示pET—GST／F10诱导后表达一相对分子质量（Mr）约为61000的融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90％以上，Western blot证实该蛋白是GST／F10的融合蛋白。将纯化的GST／F10融合蛋白免疫家兔，得到的兔抗F10抗体效价达1：20000。结论：成功构建了人F10基因原核表达载体，并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体，为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。     

抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人木糖基转移酶（XT-I）蛋白的多克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位，从中选择优势抗原表位，通过引物优化设计，PCR拼接并扩增相应区域DNA片段，将其插入原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌ER2566，获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体，ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体，采用Westem blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果：确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG（175-205）为抗原表位，成功构建了重组表达载体，表达融合蛋白GST-XT，并以其为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1：640000：Western blot结果显示：该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论：获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体，为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。     

Preparation and application of polyclonal antibodiesagainst KSHV v-cyclin

We prepared rabbit polyclonal antibodies against Kaposi''s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-encoded v-cyclin (ORF 72) and detected the natural viral protein using these polyclonal antibodies. Three antigenic polypeptides of v-cyclin were designed and synthesized. A fragment of the v-cyclin gene was cloned into a eukaryotic expression vector pEF-MCS-Flag-IRES/Puro to construct a recombinant vector, pEF v-cyclin. Then, pEF v-cyclin was transfected into 293T and EA.hy926 cells to obtain v-cyclin-Flag fusion proteins. Six New Zealand white rabbits were immunized with KLH-conjugated peptides to generate polyclonal antibodies against v-cyclin. The polyclonal antibodies were then characterized by ELISA and Western blotting assays. Finally, the polyclonal antibodies against v-cyclin were used to detect natural viral protein expressed in BCBL-1, BC-3, and JSC-1 cells. The results showed that using the Flag antibody, v-cyclin-Flag fusion protein was detected in 293T and EA.hy926 cells transfected with pEF-v-cyclin. Furthermore, ELISA showed that the titer of the induced polyclonal rabbit anti-v-cyclin antibodies was higher than 1:8,000. In Western blotting assays, the antibodies reacted specifically with the v-cyclin-Flag fusion protein as well as the natural viral protein. The recombinant expression vector pEF-v-cyclin was constructed successfully, and the polyclonal antibodies prepared can be used for various biological tests including ELISA and Western blotting assays.