氢醌HQ对K562细胞WRN基因甲基化水平及DNMT1表达的影响

目的：探讨氢醌（hydroquinone,HQ）对K562细胞中WRN基因甲基化水平及DNMT1表达的影响。方法：K562细胞生长至对数期后,设置空白对照组,低（15 μmol/L）、中（30 μmol/L）、高（60 μmol/L）剂量HQ组,重复间隔染毒72 h,空白对照组加入等量的PBS培养。MTT比色法检测细胞存活率;重亚硫酸盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测细胞WRN基因甲基化水平;FQ-PCR法检测DNMT1基因的mRNA表达情况;免疫印迹法检测DNMT1基因的蛋白表达情况。结果：①MTT结果显示,细胞存活率随着HQ染毒浓度增加而下降（P=0.000）。②BSP检测结果显示,低、中、高剂量HQ组甲基化率与对照组比较,差异有统计学意义（χ2=7.50,P=0.048）。③与对照组比较,低、中、高剂量HQ组DNMT1基因mRNA及蛋白表达量呈下降趋势（P=0.000）。结论：HQ染毒K562细胞可引起WRN基因甲基化水平增高,同时下调DNMT1基因的表达。     

氢醌对 K562细胞着色性干皮病基因 D转录及表达的影响

目的：探讨苯代谢物氢醌（ HQ）对人白血病细胞株K562细胞中着色性干皮病基因D（ XPD）mRNA转录及蛋白表达的影响。方法：分别用终浓度为0、15、30、60μmol/L HQ溶液处理K562细胞48 h后,单细胞凝胶电泳实验检测细胞DNA损伤效应,Taqman探针实时荧光定量PCR法检测XPD基因mRNA转录水平,蛋白印迹法分析XPD基因蛋白表达水平,观察荧光显微镜下细胞的尾矩,计算mRNA及蛋白的相对表达量。结果：不同浓度HQ处理后,各组细胞尾矩与0μmol/L HQ组比较,差异有统计学意义（ P＜0.05）;不同浓度HQ处理后, K562细胞中XPD基因mRNA和蛋白相对表达量与0μmol/L HQ组比较,差异无统计学意义（ P＞0.05）。结论：HQ处理K562细胞48 h后,细胞中DNA有明显的损伤效应,但XPD基因mRNA及蛋白无变化。     

bcr/abl基因特异性小干扰RNA对K562细胞增殖凋亡和SH2肌醇磷脂酶基因表达的影响研究

目的 通过小干扰RNA（siRNA）沉默K562细胞bcr/abl基因使SH2肌醇磷脂酶（SHIP）基因表达增加,探讨SHIP基因缺失对K562细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 构建bcr/abl基因的化学合成siRNA,并转染到K562细胞,分为转染特异性siRNA实验组、转染非特异性siRNA对照组、空白对照组。Western blotting法检测转染后K562细胞p210表达量,实时荧光定量PCR（FQ-RT-PCR）检测各组细胞中SHIP mRNA表达量;Western blotting法检测SHIP、磷酸化蛋白激酶B 308（p-Akt308）和磷酸化蛋白激酶B 473（p-Akt473）的表达量;MTT比色法检测K562细胞增殖率;流式细胞仪检测K562细胞凋亡率;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测核因子（NF）-κB活性。结果 转染特异性siRNA实验组K562细胞p210表达量、p-Akt308表达量、p-Akt473表达量较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低,SHIP mRNA表达量、SHIP表达量、细胞凋亡率较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组升高（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组K562细胞p210表达量、SHIP mRNA表达量、SHIP表达量、p-Akt308表达量、p-Akt473表达量、细胞凋亡率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。第1天、第3天、第5天转染特异性siRNA实验组K562细胞增殖率较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组K562细胞增殖率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。第3天、第5天转染特异性siRNA实验组NF-κB活性较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组NF-κB活性比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 SHIP基因表达受bcr/abl基因的调控,SHIP表达缺失可能是K562细胞过度增殖和凋亡减少的重要因素。     

真核起始因子4E反义寡核苷酸对人食管癌EC-1细胞中真核起始因子4E表达的影响

目的:探讨真核起始因子4E(eIF4E)反义寡核酸(ASODN)对人食管癌EC-1细胞中eIF4E表达的影响.方法:将针对eIF4E不同基因位点的2条反义寡核苷酸(ASODN1、2)和1条无义寡核苷酸(N-ODN)转染EC-1细胞(设5、10、15 μmol/L 3个转染浓度),分别培养24、48、72 h,并设空脂质体转染作为空白对照,采用免疫细胞化学和原位杂交方法检测转染后细胞中eIF4E蛋白和mRNA表达的变化.结果:ASODN 1、2转染EC-1细胞培养24、48、72 h后,各组中eIF4E蛋白和mRNA的表达均降低,2者分别与空白对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05);ASODN1、2组每个时间段内随浓度增加ASODN抑制效应增强,差异具有统计学意义(F=9.423、10.284、10.496、7.621、8.420和9.089,P＜0.05),组间相同时间点、相同浓度的抑制效应比较差异无统计学意义(P＞0.05);N-ODN组和空白对照组对eIF4E的表达均无抑制效应.结论:特异性的ASODN能有效抑制人食管癌EC-1细胞中eIF4E的表达.     

组织蛋白酶B特异性siRNA对食管癌EC9706细胞组织蛋白酶B基因表达的影响

目的:探讨小分子干扰RNA(siRNA)对食管癌EC9706细胞组织蛋白酶B(CB)基因表达的影响.方法:设计并用体外转录方法合成针对CB基因的siRNA,转染EC9706细胞(设10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L 3个转染浓度),分别培养24 h、48 h、72 h(实验组),采用免疫细胞化学及原位杂交方法检测转染细胞中CB蛋白和mRNA表达的变化,并设正常对照、空白对照、无关对照.结果:不同浓度siRNA转染24 h、48 h、72 h EC9706细胞CB蛋白表达量均较正常、空白及无关对照降低(P＜0.05),以转染72 h的抑制效应最为明显,但3者相比差异无统计学意义(P＞0.05).3个时间段内随浓度增加siRNA抑制效应增强,3者相比差异有统计学意义(P＜0.05),正常对照、空白对照、无关对照均未表现出对CB蛋白表达的抑制效应.转染siRNA后部分细胞形态发生改变.结论:特异性siRNA能有效抑制EC9706细胞中CB蛋白和mRNA表达.     

黄芪多糖诱导K562细胞γ-珠蛋白基因表达

目的 探讨黄芪多糖(APS)对K562细胞γ-珠蛋白基因表达的诱导作用.方法 以K562细胞为模型,以APS诱导的细胞为实验组,未加药细胞为空白对照,丁酸钠(NaB)处理的细胞为阳性对照,分别用联苯胺染色和RT-PCR分析联苯胺染色阳性率、Aγ-和Gγ-珠蛋白基因mRNA表达水平.结果 (1)与空白对照组相比,300 mg/L APS诱导48 h后联苯胺染色阳性率由(4.37±0.58)%升高至(15.67+1.80)%(P<0.05).300 mg/L APS诱导K562细胞48 h的联苯胺染色阳性细胞总数为(60.40±6.33)×102.与NaB组(42.02±16.42)×102相比差异有显著性意义(P<0.05).(2)与空白对照组相比,300 mg/L APS诱导48 hAγ和Gγ珠蛋白基因tuRNA表达分别增加3.59±0.16倍和5.02±0.81倍(P=0.000).结论 APS可诱导K562细胞Aγ和Gγ珠蛋白基因mRNA表达增强,具有治疗β-珠蛋白生成障碍性贫血的潜能.     

人β-防御素1对宫颈癌Hela细胞HPV18复制和表达的影响

目的 观察人β-防御素1(hβD1)对宫颈癌Hela细胞HPV18复制和表达的影响.方法 基因转染:通过FugenHD介导,将已构建的hβD1/psectag质粒转染至Hela细胞(实验组),并设空载组和空白组.通过免疫细胞化学染色观察转染后目的 基因在细胞中的表达;荧光定量PCR检测转染48 h和72 h后Hela细胞HPV18 DNA拷贝数的变化; 半定量RT-PCR检测转染后48 h和72 h的Hela细胞HPV18 E6 mRNA表达的改变.结果 转染hβD1/psectag质粒48 h和72 h后的Hela细胞均有hβD1的表达,后者明显增强,而空载组和空白组未见表达.较之空载组和空白组,实验组48 h HPV18 DNA拷贝数增多,72 h HPV18 DNA拷贝数减少,但差异无统计学意义.实验组48 h的Hela细胞HPV18 E6 mRNA表达较空载组和空白组未见明显改变,而72 h的Hela细胞HPV18 E6 mRNA表达较空白组减少(P<0.05).结论 hβD1对Hela细胞HPV18 E6 mRNA表达有抑制作用并呈浓度依赖性,而对其DNA复制作用不明显.     

Mechanism of Hewei Jiangni Capsule(和胃降逆胶囊)Regulating Proliferation and Apoptosis of Human Gastric Cancer AGS Cells Through PI3K/AKT Signaling Pathway

目的:探究和胃降逆胶囊对人胃癌AGS细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制.方法:用不同药物剂量(3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg)制备的和胃降逆胶囊含药血清分别干预人胃癌AGS细胞,分为和胃降逆胶囊含药血清低剂量组、中剂量组、高剂量组及空白组,分别干预AGS细胞24 h、48 h、72 h后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,采用流式细胞仪检测细胞周期分布情况,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞相关蛋白磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、促凋亡基因(Bax)、抑细胞凋亡蛋白(Bcl-2)、细胞周期蛋白D1 (Cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖性抑制剂(p21)的表达情况;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Cyclin D1和p21 mRNA表达情况.结果:随着和胃降逆胶囊含药血清作用时间的延长,各药物组细胞活力逐渐降低,同剂量组24h、48 h、72 h比较差异有统计学意义(P＜0.05),48 h与72 h比较差异无统计学意义.在同一干预时间点,细胞活力随着药物血清浓度的增加而降低.各组含药血清处理AGS细胞48 h后,G0/G1期细胞比值与空白组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05);和胃降逆胶囊可以下调AGS细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白及抑制凋亡蛋白Bcl-2和Cyclin D1的表达(P＜0.05),上调AGS细胞中促凋亡蛋白Bax和p21的表达(P＜0.05);和胃降逆胶囊可以下调AGS细胞中抑制凋亡基因Bcl-2和Cyclin D1 mRNA的表达(P＜0.05),上调AGS细胞中促凋亡基因Bax和p21 mRNA的表达(P＜0.05),且呈现出浓度相关性.结论:和胃降逆胶囊通过抑制PI3K/AKT通路的活化,调控下游周期阻滞相关基因和凋亡相关基因的表达,进而抑制人胃癌AGS细胞增殖并促进AGS细胞凋亡.     

地塞米松对子宫珠蛋白相关蛋白1在哮喘小鼠的表达及影响的研究

目的 观察子宫珠蛋白相关蛋白1(UGRP-1)基因在小鼠肺组织的表达及地塞米松对其的影响.方法 将36只小鼠随机分为哮喘模型组、地塞米松干预组、空白对照组.用实时荧光定量PCR法分别检测小鼠末次激发后6 h和24 h肺组织UGRP-1 mRNA的量:用ΔΔCt法计算其相对值,作为标本的UGRP1基因在mRNA水平上的相对表达量,并用酶联免疫吸附法(ELISA)测肺泡灌洗液(BALF)中UGRP1水平.结果 在末次激发后6 h处死的哮喘模型组及地塞米松干预组间UGRP-1 mRNA量比较差异无统计学意义(P＞0.05),但均显著低于空白对照组(P＜0.05);在24 h处死的哮喘模型组、地塞米松干预组和空白对照组间肺组织UGRP-1 mRNA含量两两间比较差异有统计学意义(P＜0.05),空白对照组表达最高,哮喘模型组最低.6 h处死的小鼠BALF中UGRP-1的量:地塞米松干预组和哮喘模型组差异无统计学意义(P＞0.05),空白对照组含量最高;24 h处死的小鼠地塞米松干预组UGRP-1量较6 h批有明显升高(P＜0.05),与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),哮喘模型组含量最低(P＜0.05).结论 哮喘小鼠肺组织UGRP-1及其基因表达在6 h和24 h均较空白对照组明显降低;地塞米松能促进UGRP-1基因的表达,并能维持其蛋白的稳定.     

CRELD1基因过表达对心脏瓣膜相关基质蛋白的影响

目的 探讨CRELD1基因过表达对心脏瓣膜相关基质蛋白的影响.方法 采用PCR技术获得CRELD1基因,利用质粒pcDNA3.1(一)构建目的基因的真核表达载体,酶切及DNA测序鉴定.利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染人胚肺成纤维细胞株(HFL-I)(重组质粒组),以空载体转染细胞和未转染细胞分别作为转染对照组和空白对照组.采用Real-TimePCR技术和Western blotting方法检测细胞中心脏瓣膜基质蛋白Tenascin-C和Aggrecan的mRNA和蛋白相对表达量.结果 重组质粒测序鉴定结果与GenBank数据库比对序列一致.重组质粒组HFL-I中Aggrecan的mRNA和蛋白相对表达量均显著低于转染对照组和空白对照组(P＜0.05);各组HFL-I中Tenascin-C的mRNA和蛋白相对表达量比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 CRELD1基因过表达时可以下调人胚肺成纤维细胞中心脏瓣膜基质蛋白Aggrecan的表达量,为阐明CRELD1基因在房室间隔缺损中的作用提供了一定的理论基础.     

哺乳动物性别决定基因的研究进展

目的了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定。结论性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。     

Ｌｉｍｓ Ｅ：一个新的ＬＩＭ同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因.方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定.结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1 164 bp.编码387个氨基酸.结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Liras基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础.     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

Rh(-)献血者128例基因分型

目的：探讨Rh(-)献血者RhD基因分型的临床意义。方法：采用PCR－－SSP技术检测郑州市128例Rh（－）献血者的RhD基因结构，用氯仿／三氯甲烷法放散检测D^u检测，结果：RhD基因多态性存在3种基本形式，其中外显子完整存在32例（25．00％），全部为D^u型，完全缺失85例（66．41％），部分缺失11例（8．59％），其中2例为D^u型。结论：RhD基因的丰富多态性对于确保输血安全具有指导意义。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

子宫肌瘤基因芯片的研究

基因芯片是一种能快速检测大量基因表达的分子生物学研究工具。子宫肌瘤基因芯片的研究发现,肌瘤中与细胞生长、增殖、凋亡、代谢、细胞运动性、血管发生、细胞外基质形成、细胞分化和免疫相关的基因表达发生了改变。文章综述子宫肌瘤基因芯片的研究进展,从分子水平探讨子宫肌瘤的发病机制。     

慢性胃炎胃粘膜上皮细胞中bax、fas、p16基因的表达

目的:探讨bax、fas和p16在胃粘膜病变发生发展过程中的作用及意义.方法:应用免疫组织化学方法,检测慢性浅表性胃炎(CSG)和轻、中、重度慢性萎缩性胃炎(CAG)患者胃粘膜上皮细胞中bax、fas(促凋亡基因)和p16(增殖负调控基因)基因蛋白的表达情况.结果:CSG和轻、中、重度CAG胃粘膜中bax的表达率分别为41.75%、72.41%和78.26%,fas的表达率分别为39.81%、65.52%和78.26%,p16的表达率分别为9.71%、24.14%和30.43%.轻、中、重度CAG与CSG比较,bax、fas、p16的表达差异有显著性意义P<0.05～0.01.轻、中、重度CAG间比较,差异无显著性意义.结论:bax、fas和p16的高表达,使得细胞增殖/凋亡的比例失衡,在胃粘膜病变的发生发展中可能有重要意义.     

肿瘤特异性报告基因载体的构建

目的：将构建一种能在肿瘤组织中进行肿瘤行异性表达的逆转录病毒载体，增强肿瘤基因治疗的靶向性。方法：PCR法获得HER2基因的启动子片段并将其克隆至逆转录病毒载体P^LXSN中，再将突变型绿色荧光蛋白（mtGFP)基因克隆至该启动子下游。结果：质粒P^LHSN经EcoR I和BamH I酶切后可切出510bp和5.8kb两条片段；质粒P^LHGSN经BamH I酶切可切出520bp和6.7kb两条片段。结论：成功构建了携带HER2基因启动子和mtGFP报告基因的逆转录病毒载体。