用PCR-SSP技术检测羊水中RHD基因

Rh抗原能够导致严重的输血反应,获得性溶血性贫血及同种免疫,特别是RhD抗原在新生儿溶血病中扮演了重要的角色,资料表明,我国Rh溶血症由抗D引起者占61.5%［1］。抗-D免疫球蛋白在治疗新生儿溶血病方面起着非常重要的作用,而且RhD阴性妇女如果血清中存在抗-D,RhD的表现型在新生儿溶血病的诊断中也显得十分重要。笔者根据已知的RH基因结构,采用PCR-SSP技术,通过特异性引物序列,检测羊水中RHD基因,以便在胎儿出生前了解其RhD型,达到对HDN的预知诊断。     

HLA-DQB1 PCR-SSP基因分型技术

HLA-Ⅱ(DR,DQ,DP)配型对提高异基因骨髓移植存活率减少GVHD有重要意义。既往HLA-DQ采用血清学技术检定表型,近年国外转向基因分型,不少实验室已将其列为常规。国内近年来有人报告聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-SSOP),限制性片断长度多态性     

中国部分地区RhD(-)汉族人RHD基因结构分析

目的 :了解RhD(- )中国汉族人RHD基因的构成情况 ,并探讨其潜在的应用价值。方法 :采用PCR SSP方法分析 5 0名RhD(+)和 76名常规血清学RhD(- )汉族供血者的RHD基因存在情况 ,对其中 8例RhD(- )血样进行了吸收放散试验。结果 :5 0名RhD(+)供者RHD基因完整存在。 76名RhD(- )供者中 ,2 2名供者(2 8 95 % )存在完整RHD基因 ,9名供者 (11 84% )缺失大部分RHD基因 ,并全为中间缺失型 ;45名供者(5 9 2 1% )完整缺失RHD基因。携带完整RHD基因片段的RhD(- )个体表型均为CC或Cc,而无cc。吸收放散试验证实携带完整RHD基因的常规血清学RhD(- )个体中存在吸收放散弱D型 (Delution ,Del)。结论 :常规血清学RhD(- )中国人RHD基因存在多态性 ,提示中国汉族人RhD(- )特征有多种遗传机制 ,因此在临床医学中要正确对待不同遗传背景的常规血清学RhD(- )个体。     

PCR技术检测弱D15型

目的　探讨采用DNA技术鉴定弱D15型。方法　根据文献和GenBank报道的基因序列 ,针对弱D15型基因 ,设计一对特异性引物 ,并引入一对内对照引物 ,建立简易的聚合酶链式反应 (PCR)技术检测弱D15型 ,之后用于检测 10份Rh阴性、10份Rh阳性、10份Del样品和 1例弱D15型DNA样品。结果　除 1例弱D15型样品检测为阳性外 ,其余均为阴性 ,显示PCR特异性检测弱D15型基因。结论　PCR方法简便、快速 ,能准确鉴定弱D15型 ,可用于临床常规实验室     

HLA的PCR-SSP分型技术

PCR-SSP是采用PCR技术,针对被检基因设计一系列具有等位基因多态性的序列特异性引物扩增被检标本,分析PCR产物判定HLA型别。HLA-DR1～DR1l8可以采用19对引物检定;采用两步法以79对引物可以检定DR全部基因型。HLA-DQ采用20条引物不同组合,除检定与血清学型别一致的特异性外还可分析部份基因型;以22对引物则可检定DQB1全部基因型。PCR-SSP技术比PCR-SSOP及PCR-RFLP简易快速,适于临床常规。     

PCR-SSP基因分型技术在ABO疑难血型定型中的应用

目的 研究聚合酶链式反应-特异性序列引物(PC-SSP)基因分型技术在ABO疑难血型鉴定中的应用.方法 收集8例来自广东省肇庆市无偿献血者的ABO疑难血型样本,采用正反定型实验、吸收放散试验等一系列血型血清学方法进行检测;提取基因组DNA,并用PCR-SSP基因分型技术,特异性扩增ABO基因片段,根据有无PCR产物以及产物长度,判断样本的基因型.结果 通过凝胶电泳检测PCR反应的特异性产物,判断样本1～6号ABO基因型为A/O型,样本7,8号为B/O型.8例疑难ABO基因分型结果与其血型的血清学分型结果吻合.结论 ABO疑难血型定型的解决是一个复杂的难题,而PCR-SSP基因分型是一种方便、快速、可靠的技术,对于解决ABO疑难血型鉴定非常有用.     

一例弱D25与“亚洲型”DEL基因杂合型个体的RHD基因分析

目的 对1例血清学RHD弱阳性的患者进行RHD基因型检测。方法 采用盐水法以及抗人球蛋白法鉴定RHD血型,应用抗球蛋白微柱凝胶卡进行直接抗人球蛋白试验;采用RH血型分型卡检测RHCE表型;对RHD基因的10个外显子进行PCR扩增及直接测序分析。结果 该个体血清学结果显示RHD抗原弱阳性表达,为D变异型,RHCE表型为CcEE,直接抗人球蛋白试验结果为阳性。RHD基因外显子直接测序发现其第9外显子上的第1227号碱基发生了G>A的杂合突变。同时,第3外显子上的第341号碱基发生了G>A的杂合突变,导致D抗原表达减弱。综上,该样本属RHD*weakDtype25/RHD*DEL1杂合型。结论 此D变异型个体为弱D25与DEL型杂合的病例,其血清学表现为D变异型,且未检索到中国人群相关病例报道。     

应用分子生物学技术检测及蛋白质模型预测1例弱D型54

摘要:目的对1例血型血清学检测为RHD变异型的样本进行基因分型,并进行家系调查分析。方法运用血型血清学检测方法对先证者及其家系样本进行RHD确认及RH血型抗原表位检测，用序列特异性引物PCR( sequence specifie primer PCR,PCR-SSP)法分析RHD基因外显子的表达,运用Sanger和SMRT ( single molecule real-timesequencing)测序法 对先证者及其家系样本进行RHD基因的1~10外显子测序分析。通过AlphaFold模拟构建蛋白质三级结构,将突变前后的蛋白质结构进行叠合以观察结构内分子间相互作用力的改变。结果先证者为 RHD弱表型,其他抗原为Ccee, 直接抗人球蛋白试验抗体筛查、抗体鉴定试验均为阴性，PCR-SSP 初步分型为RHD阳性。其父母血型血清学及PCR-SSP结果均为RHD阳性。SMRT 测序结果显示先证者母亲为RHD*/RHD杂合子。Sanger 测序结果显示，先证者父亲携带弱D型54等位基因。AlphaFold 建模预测揭示,p.Serl22Leu突变不能与146位GLU形成氢键相互作用。结论该样本为弱 D型54,p.Ser122Leu突变导致氨基酸内部分子间作用力发生改变,从而引起突变后蛋白质结构和功能的部分改变。     

汉族、藏族和维吾尔族人群RHD基因启动子区检测

目的探讨汉族、藏族和维吾尔族RHD基因启动子区多态性与RhD阴性机制相关性。方法对476例汉族(200例RhD阳性、228例RhD阴性、6例弱D和42例Del型)、57例藏族(50例RhD阳性和7例RhD阴性)和120例维吾尔族(50例RhD阳性和70例RhD阴性)标本,使用PCR-SSP方法检测RHD基因的Upstream盒、Down-stream盒和hybrid盒,使用PCR-SSP法和多重PCR法检测RHD基因启动子区-1~-1 246 bp内的4个RHD基因多态性位点。结果 348例RhD阳性标本(含6例弱D和42例Del型)、76例表型为RhD阴性但RHD基因型为RHD+/RHD-杂合子和RHD+/RHD+纯合子标本中均检测到4个RHD基因特异性多态性位点;而所有229例表型为RhD阴性基因型为RHD-/RHD-纯合子标本均未检测到RHD基因启动子区多态性位点。结论汉族、藏族和维吾尔族RHD基因启动子区多态性可能与RhD阴性机制无关;本研究所建立的RHD基因启动区4个多态性位点PCR-SSP检测方法可用于RHD基因启动区多态性位点研究。     

多重聚合酶链反应分析中国汉族人群RHD基因

目的 分析中国汉族人群RHD基因的构成。方法 采用2套多重PCR－SSCP扩增体系，对450例献血（328例RhD阳性、112例RhD阴性、10例D变异型）的基因组DNA进行RHD特异性外显子3、4、5、6、7、9和内含子4，RHDΨ及C、c等位基因扩增，并与血清学Rh定型结果进行对比。结果 328例RhD阳性献血中，326例具有全部的RHD基因特异性外显子，另有2例分别为D^Va和D^IVb；112例血清学RhD阴性献血中，35例存在全部的RHD基因特异性外显子（31．25％），但该35例样本中未检出RHDΨ基因37bp的插入片段。10例D变异型中3例为D^ⅥⅢ，1例D^Va,1例R0^Har,1例D^DFR;另外4例中，2例缺乏RHD所有特异性外显子，2例扩增出RHD所有特异性外显子。结论 中国汉族人群RHD基因的表达存在多种模式。多重PCR体系分析RHD基因既可诊断个体的RhD表型，又具有确认不完全D以及发现新的D变异型的优势。     

Weak D and DEL alleles detected by routine SNaPshot genotyping: identification of four novel RHD alleles

BACKGROUND: Molecular RHD blood group typing is very efficient for managing donors and patients carrying any of the various molecular types of weak D and DEL. The purpose of the work was to develop a multiplex polymerase chain reaction (PCR) SNaPshot assay for simultaneous detection of weak D and DEL alleles that are prevalent in Europeans, Africans, and Asians. STUDY DESIGN AND METHODS: Preliminary profiling was carried out on single‐nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with 13 prevalent RHD alleles, that is, weak D Types 1, 2, 3, 4.0, 4.0.1, 4.1, 4.2, 5, 11, 15, and 17; RHD(IVS3+1g>a); and RHD(K409K). Multiplex PCR was used to amplify six RHD regions encompassing 14 SNPs. Identification was obtained by incorporation of the complementary dye single base at the 3′‐end of each probe‐primer. A prospective analysis was then carried out on 152 blood samples from patients (n = 53) and donors (n = 88) with equivocal RhD serology and pregnant women (n = 11). RESULTS: After validation, our SNaPshot assay allowed direct genotyping of 82.9% of samples overall and 100% of samples harboring weak D Types 1, 2, 3, and 4.1 alleles. In the remaining 17.1% of samples overall, sequence investigation allowed accurate genotyping. In addition, four novel RHD alleles were identified, that is, RHD(S256P), RHD(L390L), RHD(F410V), and RHD(IVS4‐2a>g). CONCLUSION: The SNaPshot assay described herein is a helpful supplementary tool for resolving doubtful RhD serology. By allowing accurate identification of weak D and DEL alleles this assay should allow better management of the donors and the patients genotyped weak D Types 1, 2, 3, and 4.1 who can receive D+ blood units.     

PCR-SSP方法在人类粒细胞抗原HNA-1c基因分型中的应用

人类粒细胞抗原(humanneutrophilantigen,HNA)在临床上具有重要作用,可引起新生儿粒细胞免疫反应和输血相关性急性肺损伤。目前已发现并命名的HNA有5个系统,7个抗原。HNA鄄1是HNA系统最常见且最具临床意义的抗原,其位于FcγRⅢb(CDl6)上,是目前发现惟一具多态性的粒细胞抗原系统,包括HNA鄄1a(NA1)、HNA鄄1b(NA2)和HNA鄄1c(SH)3个抗原。HNA鄄1c与HNA鄄1b基因高度同源,仅第3外显子第266位C→A不同。HNA鄄1系统NA1和NA2抗原分型方法已有报道[1～4],但有关HNA鄄1c抗原的检测很少。参照有关文献,笔者建立了HNA鄄1c基因序列…     

D抗原阳性个体及无效等位基因携带者RHD基因数目测定

目的　测定Rh血型D抗原阳性个体的RHD基因数目。方法　采用聚合酶链式反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)技术 ,扩增 10名D阳性、5名弱D、2 5名Del表型和 12名携带无效等位基因的Rh阴性个体的RH基因座位下游盒子和融合盒子序列 ,产物经DNA限制性内切酶PstI消化后电泳 ,以 5份经血清学和序列分析基因分型方法确认的D阴性样本作为RHD-/RHD-纯合子对照 ,鉴定RHD+ /RHD+ 或RHD+ /RHD-基因型。结果　 10名D阳性个体均为RHD+ /RHD+ 纯合子、5份弱D样本及 12名携带无效等位基因的Rh阴性个体全部为RHD+ /RHD-杂合型。 2 5名Del表型个体中 9人为RHD+ /RHD+ 纯合型 (36 % ) ,其中 6人Rh表型为DCCee、3人为DCcee ;另 16名Del个体为RHD+ /RHD-杂合型 ,Rh表型均为DCcee。结论　D阳性个体RHD+ /RHD+ 纯合型多见 ,弱D型个体以RHD+ /RHD-杂合型为主 ,在Del表型个体存在高比率的RHD+ /RHD+ 纯合型 ;携带无效等位基因的个体多为RHD+ /RHD-杂合型     

RHD genotyping in weak D phenotypes by multiple polymerase chain reactions

BACKGROUND: Weak D phenotypes involve a quantitative variation of D. The genomic basis in weak D has been disputed, however. STUDY DESIGN AND METHODS: Five sequence-specific polymerase chain reactions (SSP- PCRs) on exons 2, 5, and 7 of the RHD gene were evaluated in 248 white and 98 Japanese blood donors and compared with the results obtained by amplification of intron 4 and serology. All methods and SSP-PCR testing on the 3′ non-coding region of the RHD gene were applied to the genotyping of 94 DNA samples derived from individuals expressing weak D phenotypes. RESULTS: Concordant results were obtained with all genotyping and phenotyping methods in testing 201 D-positive and 145 D- negative donors. Four of 94 weak D samples were typed as D-negative by amplification of intron 4 and SSP-PCR on exon 5. Phenotyping with monoclonal antibodies revealed a DVI category in one of these cases and DFR phenotype in three of these cases. One weak D sample, which reacted like normal D-positive cells with all applied monoclonal antibodies, was typed falsely negative by SSP-PCR on exon 5 because of a point mutation at nucleotide 667 (T–>G) that resulted in a Phe223Val amino acid substitution. In this individual, heterozygosity was found at two other amino acid positions (Glu233Gln and Val238Met) by restriction fragment length polymorphism analysis. CONCLUSION: Genetic diversity in weak D phenotypes is rare. Only 1 of 90 true weak D phenotypes (1.1%) had a genetic variation in testing on seven gene regions of the RHD gene.     

浙江汉族人群RHD基因合子型检测

目的了解浙江汉族人群RHD基因合子型多态性情况。方法采用PCR-SSP方法检测438例RhD阳性、弱D表现型、RhD阴性表型个体的RHD基因上、下游盒和杂交盒,根据个体盒子的检测结果推测其合子型。结果198例RhD阳性样本中12例(6.06%)为RHD /RHD-型,其余186例(93.94%)为RHD /RHD 型;32例弱D表现型样本中29例(90.63%)为RHD /RHD-型,3例(9.37%)为RHD /RHD 型;208例RhD阴性样本中53例(25.48%)为RHD /RHD-型,145例(69.71%)为RHD-/RHD-型,10例(4.81%)为RHD /RHD 型。结论浙江汉族人群中RhD阳性、弱D表现型、RhD阴性表型个体RHD基因合子型分布频率不同,RhD阴性人群中存在缺失RHD基因或有完整RHD基因的情况。