呼吸系统感染肺炎克雷伯菌中Ⅰ类整合子基因盒的相关研究

【目的】 肺炎克雷伯菌是医源性感染的重要致病菌之一,随着临床大剂量抗生素的不规范使用,肺炎克雷伯菌多重耐药菌株日趋增多,常导致治疗的失败和病程迁延。I类整合子是肺炎克雷伯菌中分布最普遍的整合子,其携带的耐药基因盒在细菌耐药性方面起关键作用,且整合子的分布及携带的基因盒存在明显的地区差异性。目前尚未见青岛地区肺炎克雷伯菌整合子的研究报道,本研究旨在探讨I类整合子的分布、基因盒的组成及其与耐药表型的关系,明确青岛地区肺炎克雷伯菌中I类整合子及其携带的基因盒流行情况,为临床合理应用抗生素提供可靠依据。 【方法】 收集2011年至2013年青岛市立医疗集团分离鉴定的呼吸系统感染的非重复肺炎克雷伯菌82株,采用美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的K-B法测定细菌对16种常用抗菌药物的敏感性;提取细菌基因组DNA,PCR检测整合子保守区的整合酶基因;对保守区阳性的菌株进行可变区基因的PCR扩增,将回收纯化的PCR产物克隆至pMD18-T载体,经琼脂糖凝胶电泳及PCR鉴定后,重组克隆送往华大基因公司进行测序,通过在线Blast和DNA Star软件进行同源性比对分析,确定I类整合子携带的耐药基因盒。 【结果】 82株肺炎克雷伯菌对16种常用抗菌药物的耐药率为2.3%~72.1%,其中对头孢唑林、哌拉西林和头孢呋辛类药物的耐药率达60%以上;I类整合子的阳性率为76.82%,I类整合子可变区扩增片段大小从750~2 500 bp不等,测序结果显示其携带的11种基因盒主要包括编码氨基糖苷类耐药性的aad 家族(aadA1、aadA2、aadA5、aadB)、aac 家族(aacA4)、编码磺胺类耐药性的dfr家族(dfrA1、dfrA5、dfrA12)、编码氯霉素耐药性的catB8 基因及功能不明的orfF及orfC 基因,共组成7种不同的基因盒排列组合(已向GeneBank申请登录)。 【结论】 青岛地区呼吸系统感染肺炎克雷伯菌中I类整合子的阳性率较高,其携带的耐药基因盒主要赋予细菌对氨基糖苷类和磺胺类的耐药性,这些耐药基因盒的不同排列组合构成了肺炎克雷伯菌多重耐药的物质基础。     

株多重耐药肺炎克雷伯菌耐药基因和整合子、转座子遗传标记研究

目的了解多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药基因存在状况和遗传学背景。方法聚合酶链反应法对多重耐药的肺炎克雷伯菌进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因、质粒AmpC酶基因、qacE△1-sull耐消毒剂和磺胺基因、整合子遗传标记（整合酶基因）、Tn21／Tn501转座子遗传标记（汞离子还原酶基因）检测。结果TEM、SHV型β-内酰胺酶基因，DHA型质粒AmpC酶基因，aac（6’）-I型氨基糖苷类修饰酶基因，qacE△1-sull耐消毒剂和磺胺基因，整合子遗传标记（intIl整合酶基因），Tn21／Tn501转座子遗传标记（merA汞离子还原酶基因）检测阳性。结论多重耐药肺炎克雷伯菌存在多种耐药基因和I类整合子、Tn21／Tn501转座子。     

沙门菌质粒DNA上整合子的分析

目的分析沙门菌质粒DNA上整合子的分子特征。方法用全自动细菌分析仪Mieroscan WalkAway40和纸片扩散法,对32株沙门菌进行抗生素敏感性测定,提取细菌质粒DNA,PCR扩增Ⅰ类整合子、Ⅱ类和Ⅲ类整合酶,对扩增产物进行序列分析。结果12株细菌含有一个Ⅰ类整合子,整合子大小分别为1000bp和1700bp。1000bp整合子含基因盒aadAl,1700bp整合子含基因盒dfr17-aadA5,未检测到Ⅱ类和Ⅲ类整合酶。结论整合子在沙门菌中广泛存在,整合子是介导和传播细菌耐药性的重要分子机制。     

在铜绿假单胞菌临床分离株1类整合子中发现携带新型耐药基因盒

目的:研究铜绿假单胞菌中1类整合子的分布和结构特征及与多重耐药的关系.方法:应用聚合酶链反应(PCR)检测铜绿假单胞菌1类整合酶基因(int Ⅰ)并扩增其可变区;DNA测序技术分析1类整合子可变区的耐药基因;对1类整合子阳性菌采用琼脂平皿稀释法测定其MIC并进行转移接合明确其耐药基因转移情况;脉冲场凝胶电泳法(PFGE)了解这些阳性菌的遗传相关性.结果:47株铜绿假单胞菌临床分离株中,29株携带1类整合子,未检测到3类整合子.这29株包含的整合子均扩增出长度约4.3 kb的可变区,核酸序列分析发现存在新型耐药基因盒组合形式aac(6')-Ⅱ-aadA13-cmlA8-oxa-10,Genbank基因号为EU182575.其中基因盒aadA13以往未在铜绿假单胞菌中发现.同时第3个开放阅读框与已知基因cmlA5有95%的同源性,为编码氯霉素外排泵的基因盒,将其命名为cmlA8.PFGE结果分析显示29株阳性菌株具有高度的同源性.结论:本院流行的铜绿假单胞菌携带包含新型基因盒及组合形式的Ⅰ类整合子,再次证实1类整合子参与了铜绿假单胞菌的耐药和多重耐药.     

整合子系统在非发酵菌属细菌中分布特点

[目的]了解整合子系统在非发酵菌属细菌中的分布特点,继而探讨其与非发酵菌产生多重耐药之间的关系。[方法]选取2010年7月—2011年6月由大连医科大学附属第一医院住院及门诊患者各种标本中分离的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱霍尔德氏菌、木糖产碱杆菌木糖亚种,提取全基因组DNA,通过PCR方法检测其整合子的携带情况,并对扩增结果进行分析。[结果]在452株铜绿假单胞菌中,I类整合子阳性检出率为41.8%;在612株鲍曼不动杆菌中I类整合子阳性检出率为66.7%,II类整合子阳性检出率为2.3%;在61株嗜麦芽窄食单胞菌中I类整合子阳性检出率为13.1%;在36株洋葱霍尔德氏菌中,I类整合子阳性检出率为8.3%;21株木糖产碱杆菌木糖亚种中未检出整合子;在以上各菌株中均没有检测到III类整合子。整合子阳性菌株和整合子阴性菌株的抗菌药物敏感性试验结果对比发现,整合子阳性的菌株对多种抗生素耐药率均高于整合子阴性菌株。[结论]整合子系统在非发酵菌属的某些菌种中检出率很高,它的存在是非发酵菌产生多重耐药的一个重要因素。     

细菌多重耐药与整合子-基因盒系统

细菌的耐药性,尤其是多重耐药已成为临床治疗的大难题。修饰酶及灭活酶的产生、抗生素作用靶位的改变以及利用膜蛋白的缺失与主动外排泵系统过表达来减少抗生素在细胞内的浓度,是细菌的几个重要耐药机制。整合子介导耐药基因在染色体、质粒及转座子之间移动,从而导致细菌耐药性的传播,是细菌耐药性迅猛发展的重要原因。     

Ⅱ类整合子与志贺菌耐药的相关性分析

目的:研究志贺菌中Ⅱ类整合子的流行现状、与耐药的相关性及其携带的耐药基因。方法:K-B法测定26株志贺菌的药敏情况;PCR-限制片段长度多态性(RFLP)筛查整合子并分类;长片段PCR扩增Ⅱ类整合子可变区并进行序列测定。结果:65.4%(17/26例)的志贺菌中检出整合子,PCR-RFLP结果显示均含有Ⅱ类整合子,其中有12例还同时含有Ⅰ类整合子;17例Ⅱ类整合子保守区阳性的标本,有16例可变区扩增亦阳性,大小约为2200bp,对其测序结果显示含有编码对磺胺类抗生素耐药的基因dfrA1、对链丝菌素耐药的基因sat1和对氨基糖苷类抗生素耐药的基因aadA1。结论:在国内率先报道了Ⅱ类整合子广泛存在于志贺菌中。Ⅱ类整合子与志贺菌的耐药具有相关性。     

肺炎克雷伯菌连续分离株耐药性及Ⅰ类整合子遗传标记研究

目的 了解肺炎克雷伯菌(KPN)连续分离株整合酶基因存在情况和耐药性.方法 应用双基因聚合酶链反应法对44株KPN连续分离株进行检测.结果 44株KPN菌连续分离株中qacE△1-sul1基因阳性12株(27.3%).结论 在肠杆菌科细菌耐药机制中,Ⅰ类整合子起着非常重要的作用,它的3'-保守端有季胺类化合物(消毒剂)的耐药基因(qacE△1)和磺胺耐药基因(sul1)重叠基因,为Ⅰ类整合子遗传标记,整合子使细菌能够很快获得新的耐药基因以适应环境要求.     

青岛地区大肠埃希菌中整合子与耐药性的分析

【立论依据】 大肠埃希菌是临床常见的条件致病菌,耐药率有逐年上升的趋势。近年研究表明,整合子在细菌多重耐药性的形成和水平传播中发挥重要作用,且整合子的分布及其携带的基因盒存在明显的地区差异性。因此,检测不同地区大肠埃希菌中整合子的分布及耐药基因盒,对于控制细菌耐药及合理应用抗菌药物具有重要的指导意义。 【设计思路】 本研究通过检测青岛地区临床分离的大肠埃希菌中I类、II类及III类整合子的分布及携带的耐药基因盒,分析整合子与耐药表型的关系,旨在探讨整合子在介导大肠埃希菌耐药中的作用。 【实验内容】 琼脂纸片扩散法进行药敏试验;分别设计针对I、II、III类整合子整合酶基因及可变区的PCR引物,PCR检测整合子的整合酶基因,对整合酶基因阳性菌株进行可变区基因的PCR扩增,回收纯化的PCR产物克隆至T载体,将筛选鉴定的重组子送往华大基因公司测序,测序结果经在线Blast及DNAstar软件进行同源性比对分析,确定整合子携带的耐药基因盒。应用SPSS 21.0统计软件分析大肠埃希菌耐药性与整合子的相关性。 【材料】 78株大肠埃希菌分离自青岛市立医疗集团住院患者的各类标本,细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司,PCR引物由Invitrogen公司合成,pMD18-T载体购自大连TaKaRa公司。 【可行性】 前期研究结果表明:78株大肠埃希菌对环丙沙星、左氧氟沙星、头孢唑林、头孢呋辛、复方新诺明、氨曲南、头孢曲松及哌拉西林的耐药率均超过70%;I类整合子的携带率为53.89%,其中I类整合子阳性菌株对复方新诺明的耐药率明显高于整合子阴性菌株,差异有统计学意义(P<0.05);I类整合子可变区检测出3种不同长度的片段:2株750 bp片段不携带耐药基因盒,8株1 800 bp片段携带dfrA17-aadA5 基因盒,1株1 200 bp片段为aadA22基因盒;I类整合子阳性菌株中携带耐药基因盒的菌株占61.90%,对复方新诺明的耐药率明显高于基因盒阴性菌株(P<0.01)。 【创新性】 首次研究青岛地区大肠埃希菌中整合子的分布及其携带的耐药基因盒,探讨整合子与大肠埃希菌耐药性的关系。     

革兰阴性杆菌中1类整合子的分布与耐药关系

[目的]在革兰阴性杆菌中检测1类整合子,并分析整合子对细菌耐药性的影响.[方法]用VITEK-AMS微生物自动分析仪鉴定细菌和药敏试验,用PCR方法扩增1类整合酶基因,经电泳后检测扩增产物.[结果]266株革兰阴性细菌中检测出1类整合子66株,检出率为24.8%.主要阳性菌为大肠埃希菌34.3%(24/70)、肺炎克雷伯菌48.1%(26/54)、阴沟肠杆菌30%(6/20)、铜绿假单胞菌15.6%(7/45)、鲍曼不动杆菌4.8%(2/42)、产气肠杆菌20%(1/5).1类整合子阳性菌对氨基糖苷类、喹诺酮类及头孢菌素类药物表现出较高的耐药率.携带1类整合子菌株易表现出对至少4种抗菌素的多重耐药性,其多重耐药率为68.2%(45/66),明显高于1类整合子阴性菌株(28.5%),P＜0.05.[结论]1类整合子广泛地存在革兰阴性细菌中,1类整合子对细菌多重耐药性的产生和传播起着重要作用,应加强临床细茵基因水平的耐药监测,采取有效措施防止耐药性的传播.     

Ⅰ类整合子在革兰阴性菌中分布的初步探讨

目的 调查Ⅰ类整合子在革兰阴性菌中分布及其与细菌耐药性的关系.方法 用整合子特异引物采用聚合酶链反应（PCR）技术检测革兰阴性菌株中整合子基因.结果 49株临床分离的革兰阴性菌,Ⅰ类整合子阳性者有35株,占71%（35/49）,且35株菌均表现对β-内酰胺类、喹诺酮类等的多重耐药.结论 Ⅰ类整合子在革兰阴性菌中分布较广,并参与细菌耐药性的形成,常引起多重耐药.     

Prevalence of Carbapenem-Resistant Klebsiella Pneumoniae (CRKP) and the Distribution of Class 1 Integron in Their Strains Isolated from a Hospital in Central China

Objective The aim of our study is to investigate the prevalence of Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (CRKP) and the genetic characteristics of the class 1 integron in CRKP on multi-drug resistance. Methods Clinical Klebsiella pneumoniae strains were collected from multiple departments of a hospital in central China. CRKP strains were identified among the isolates, and antibiotics susceptibility of CRKP strains was analyzed. The polymerase chain reaction (PCR) was adopted to amplify the class 1 integron variable area. The integron genetic structure was analyzed with enzyme digestion and DNA sequencing technology. The relation between class 1 integron and drug resistance was analyzed statistically. Results Totally 955 strains of Klebsiella pneumoniae were isolated from varied sites of the hospital, and 117(12.3%) of them were identified as CRKP, with a separation rate of 8.9% (26/292) in 2013, 11.3% (38/336) in 2014 and 16.2% (53/327) in 2015, which shows an increasing trend by year. 44.4% (52/117) of CRKP strains were separated from specimen of ICU, and 61.5% (72/117) were from sputum. Over 95%CRKP strains were resistant to ampicillin/sulbactam, aztreonam, imipenem, meropenem Ceftazidme, Cefotaxime,Cefepime,and Piperacillin, while relatively low resistant rates were found in Tigecycline (12.8%) and colistin (35.9%). The class 1 integron was detected in 77.8% (91/117) of CRKP strains. Class 1 integron of CRKP was significantly correlated with the antibiotic resistance to the tobramycin, gentamicin and amikacin (all P<0.01). The gene cassette analysis of variable area of class 1 integron showed that aadA2 accounts for 64.8%(59/91), aacA4-catB8-aadA123.1% (21/91), and aadA2-dfrA2512.1% (11/91). Conclusions CRKP has an increasing trend in a clinical setting in China, and most of them were resistant to multiple antibiotics. Class 1 integron in CRKP has strong ability to capture the genes resistant to aminoglycosides antibiotics from environment, with the aadA2 gene as the most popular one.     

鲍曼不动杆菌在不同感染人群中的耐药谱差异与Ⅰ类整合子特点的研究

目的分析鲍曼不动杆菌在不同人群中的耐药谱,为有效治疗鲍曼不动杆菌感染提供用药指导;调查Ⅰ类整合酶(IntI 1)和Ⅰ类整合子(Int 1)在医院感染鲍曼不动杆菌中的分布及其携带的耐药信息。方法用WalkAway 96SI全自动微生物鉴定/药敏系统对473株鲍曼不动杆菌进行鉴定和药敏;用PCR方法扩增135株菌的IntⅠ1和Int 1,对Int 1扩增产物进行克隆测序,分析其携带的耐药信息。结果笔者医院儿童病区分离株的耐药率除氨曲南为37.6%外,其他抗菌药物的耐药率都在15%以下;儿童病区与成人病区分离株的耐药性有显著性差异(P<0.05)。成人ICU分离株(占55.2%)除头孢哌酮/舒巴坦耐药率稍低(6.7%)外,其他抗菌药物的耐药率均在50%以上。ICU与普通病房分离株对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率无显著性差异(P>0.05),而对其他16种抗菌药物均存在显著性差异(P<0.05)。135株医院感染鲍曼不动杆菌中检出102株携带IntⅠ1基因,54株扩增出Int 1基因。部分扩增产物经克隆测序,共携带有8种耐药基因盒,分别为catB8,arr-3,aacA4,aadA1,aac(6’)-Ib,aac(3)-Ia,qacE和blaIMP-2。结论儿童病区与成人病区分离的鲍曼不动杆菌耐药性差异较大,临床用药不能同等对待;医院感染的鲍曼不动杆菌中IntⅠ1分布广泛,Int 1上主要携带氨基糖苷类耐药基因。     

铜绿假单胞菌整合子携带的金属β内酰胺酶研究进展

铜绿假单胞菌是条件致病菌,近年来该菌的多重耐药菌株日益增多,尤其是在该菌中发现整合子可以携带很多耐药基因如金属β-内酰胺酶基因等。本文就铜绿假单胞菌中整合子携带的金属β-内酰胺酶基因IMP、VIM、SPM和GIM的研究进展作一综述。     

下呼吸道感染肺炎克雷伯菌耐药性及产ESBLs株危险因素分析

目的:研究下呼吸道感染肺炎克雷伯菌的耐药性及产ESBLs株感染的危险因素。方法:回顾分析本院2012年分离的257株肺炎克雷伯菌下呼吸道感染患者的流行病学资料,比较产ESBLs和不产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药性。采用病例对照的研究方法,以不产ESBLs肺炎克雷伯菌做为对照组,分析产ESBLs肺炎克雷伯菌感染的危险因素。结果:257株肺炎克雷伯菌中检出产ESBLs菌136株,检出率为52.92%。产ESBLs的肺炎克雷伯菌对测试抗生素的耐药率明显高于不产ESBLs组。20个与产ESBLs感染可能相关的危险因素中,经单因素及多因素Logistic回归分析显示3个为产ESBLs株感染的独立危险因素,即β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂类(OR=4.117,95%CI=1.763⁹.613)、喹诺酮类抗生素(OR=4.132,95%CI=1.9429.613)、喹诺酮类抗生素(OR=4.132,95%CI=1.942⁸.789)和ICU入住>7 d(OR=4.297,95%CI=1.8998.789)和ICU入住>7 d(OR=4.297,95%CI=1.899⁹.726),而碳青霉烯类抗生素使用是其保护性因素(OR=0.074,95%CI=0.0239.726),而碳青霉烯类抗生素使用是其保护性因素(OR=0.074,95%CI=0.023⁰.235)。结论:下呼吸道分离的肺炎克雷伯菌产ESBLs株的检出率高、耐药性强,感染患者病死率高,住院时间长。产ESBLs肺炎克雷伯菌感染具有多个独立危险因素,加强对这些危险因素的控制有助于预防产ESBLs株感染的扩散。     

肺炎克雷伯菌临床感染现状及耐药性分析

目的了解各种临床标本中肺炎克雷伯茵的分离情况及耐药情况,以便为临床选用抗肺炎克雷伯茵的药物提供依据。方法采用美国BD100细菌鉴定分析系统进行细菌鉴定,采用微量稀释法和KB法做药物敏感实验。结果肺炎克雷伯茵在各类临床标本中的分离率从高到低依次为胸腹水标本（分离率为69．9％）、其他标本（分离率为34．6％）、分泌物标本（分离率为22．2％）、尿液标本（分离率为19．1％）、痰液标本（分离率为13．2％）和血液标本（分离率为13．0％）;对头孢哌酮／舒巴坦、阿莫西林／克拉维酸和哌拉西林／他唑巴坦的耐药率分别为3．7％、5．2％和5．9％,时美罗培南和亚胺培南耐药率均为0。结论肺炎克雷伯茵耐药问题更为严重,应采取有效的控制措施。     

下呼吸道肺炎克雷伯菌感染耐药性分析

目的了解下呼吸道肺炎克雷伯菌对常用抗生素的耐药性。方法对2007年1月1日至2008年12月30日我科下呼吸道感染患者820例中痰液或灌洗液培养检出肺炎克雷伯菌100例,对其药敏结果进行回顾性分析。结果肺炎克雷伯菌的感染率为12.2%,2007年肺炎克雷伯菌产β内酰胺酶(ESBLs)菌株占22.5%,而2008年达35.0%;产ESBLs菌比非产ESBLs菌的耐药性更加严重,其中对头孢他啶、头孢吡肟、氨苄西林舒巴坦、环丙沙星等不少抗菌药物的耐药率>30%,耐药率<10%者仅为亚胺培南、氧哌嗪青霉素、他唑巴坦、阿莫西林棒酸。结论近年来肺炎克雷伯菌感染率及耐药性均较高,应高度重视,加强对该菌耐药谱检测,是减少和延缓该菌耐药性增高和避免院内感染流行的重要措施。     

常见医院感染多重耐药革兰阴性杆菌Ⅰ类整合子标志物检测

目的了解浙江省湖州解放军第98医院从临床分离的常见医院感染多重耐药革兰阴性杆菌Ⅰ类整合子存在状况。方法从临床分离鲍曼不动杆菌60株、铜绿假单胞菌30株、阴沟肠杆菌20株、嗜麦芽窄食单胞菌19株和黄杆菌属15株(脑膜败血性黄杆菌12株、产吲哚金黄杆菌3株),采用聚合酶链反应及序列分析的方法检测Ⅰ类整合子标志物 int Ⅰ 1及qacE△1 基因。结果鲍曼不动杆菌、铜绿似单胞菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和黄杆菌属中 int Ⅰ 1基因阳性率分别为58.3%、0、95.0%、0和0,qacE△1基因阳性率分别为83.3%、83.3%、85.0%、10.5%和0。合计144株中 int Ⅰ 1和 qacE△1阳性株数(%)分别为54株(37.5%)、94株(65.3%),Ⅰ类整合子标志物总阳性率为68.1%(98/144)。结论解放军第98医院从临床分离的常见医院感染多重耐药革兰阴性杆菌Ⅰ类整合子携带率相当高。