大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体的构建、制备及表达

目的检测大鼠CTLA4-FasL重组腺相关病毒载体感染大鼠关节炎性成纤维样滑膜细胞后目的基因的表达。方法构建大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体,制备重组病毒,体外感染从佐剂诱导关节炎的大鼠关节中分离的炎性成纤维样滑膜细胞,利用Flag标签纯化目的蛋白,ELISA和Western blot等方法检测目的蛋白的表达。结果获得含有大鼠CTLA4-FasL融合基因的重组腺相关病毒,感染炎性成纤维样滑膜细胞后能够分泌性表达目的蛋白。结论构建并制备的CTLA4-FasL重组腺相关病毒能够有效感染炎性成纤维样滑膜细胞并促使期表达CTLA4-FasL融合蛋白,为今后关节炎治疗的体内实验研究奠定了基础。     

肌肉注射CTLA4-FasL重组腺相关病毒抑制大鼠关节炎的实验研究

目的观察CTLA4-FasL融合基因能否有效抑制大鼠关节炎。方法在动物造模免疫第2天,以肌肉注射方式导入CTLA4-FasL和EGFP(对照)重组腺相关病毒(rAAV),持续观察和测量2组动物的临床指标包括关节指数、踝关节厚度和体质量等,并对踝关节的组织学表现如滑膜增生和炎性细胞浸润等进行了检测。结果应用大鼠佐剂诱导关节炎动物模型,明确了重组AAV病毒可介导目的基因CTLA4-FasL于体内表达;与rAAV.EGFP对照组相比,rAAV.CTLA4-FasL处理组在临床学和组织学表现上均有效抑制了大鼠关节炎。结论 CTLA4-FasL融合分子很可能是具有潜在研究价值的类风湿性关节炎治疗分子。     

CTLA4-Ig在树突状细胞中的表达及效应研究

目的 获得CTLA4-Ig转基因修饰的DC细胞,分析表达产物CTLA4-Ig对T细胞活化功能的影响。方法 采用脂质体转染方法将CTLA4-Ig表达载体转入DC细胞,通过ELISA法鉴定转染DC细胞48和72h培养上清液及稳定表达的培养上清液,分离Balb/c小鼠和C57BL/10J小鼠淋巴细胞为反应细胞和刺激细胞,观察CTLA4-Ig对同种细胞混合培养反应的影响。结果 将鼠CTLA4-Ig表达载体转入DC细胞,获得瞬时表达及稳定表达,CTLA4-Ig可抑制单向混合淋巴细胞反应,且效应亦呈剂量依赖性。结论 鼠CTLA4-Ig表达产物对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用,其抑制作用随表达载体转染细胞培养上清液的增加而增强。同时获得了稳定表达CTLA4-Ig融合蛋白的CTLA4-Ig转基因修饰的DC细胞,为以后的工作奠定了基础。     

基因治疗中的腺相关病毒载体

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是基因治疗中最有希望的载体之一，它具有非致病性，对宿主免疫原性弱及广泛的细胞和组织亲嗜性等优点。本文综述了AAV在基因治疗中的最新研究进展，着重探讨了修饰AAv以改变它的亲嗜性及使用不同的启动子来进一步促进AAV在基因治疗中的应用。     

重组腺相关病毒载体介导的LacZ基因转染骨胳肌途径的研究

目的研究重组腺相关病毒载体(recombinantadeno-associatedvirusvector,rAAV)介导的β-半乳糖苷酶的结构基因LacZ,构建的rAAVLacZ病毒经不同途径给药后骨骼肌的转染效率、表达持续时间,为rAAV载体介导的目的基因对Duchenne肌营养不良的基因治疗探索合适的给药途径。方法采用报告基因LacZ、包装质粒PXX2、腺病毒成份辅助质粒PXX6三质粒共转染293细胞,包装重组腺相关病毒载体介导的rAAVLacZ,将rAAVLacZ局部腓肠肌肌肉注射转染至C57/BL6鼠骨胳肌,分别于单点注射后2个月、5个月取肌肉切片X-Gal染色。采用经股动脉注射rAAVLacZ观察LacZ基因在后肢骨骼肌的转染表达。结果(1)C57/BL6鼠局部肌注rAAVLacZ后,2个月和5个月时,均呈LacZ基因阳性表达,5个月时无表达减低。(2)经股动脉注射rAAVLacZ,C57/BL6小鼠后肢骨骼肌的肌膜及血管壁平滑肌LacZ基因广泛转染。结论重组腺相关病毒载体介导的报告基因LacZ可在C57/BL6鼠骨胳肌中高效持续表达5个月以上,经股动脉转染是有希望的下肢肌肉转染途径,此工作为神经肌肉遗传病,尤其是Duchenne肌营养不良基因治疗的进一步研究奠定了基础。     

感染靶向性重组腺相关病毒载体在基因治疗中的研究进展

重组腺相关病毒（rAAV）是一种非常有希望的人体细胞基因治疗载体.它既可以转染分裂细胞又可以转染非分裂细胞.rAAV在宿主体内以定向整合的方式存在.AAV重组体在细胞内能长期稳定地表达,且在体内不引起明显的病理变化,然而它广泛的宿主范围是体内基因治疗的一个缺点,因为它不具备组织特异性或器官局限性转导能力从而难以增加其在基因治疗中的安全性和效率.因此,开发具有组织或器官靶向性的重组腺相关载体是腺相关病毒载体发展的方向.本文就近年来感染靶向性腺相关病毒在基因治疗中的进展作一综述.     

腺相关病毒载体研究进展

腺相关病毒作为基因治疗的载体,具有感染范围广,可长效稳定地表达外源基因,可定点整合致宿主基因组等诸多优点而备受青睐。近年来,有关腺相关病毒及重组腺相关病毒的生物学特点有不少研究进展,本文就此做一综述。     

基因治疗中的腺相关病毒载体

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是基因治疗中最有希望的载体之一,它具有非致病性,对宿主免疫原性弱及广泛的细胞和组织亲嗜性等优点.本文综述了AAV在基因治疗中的最新研究进展,着重探讨了修饰AAV以改变它的亲嗜性及使用不同的启动子来进一步促进AAV在基因治疗中的应用.     

腺相关病毒载体应用的研究进展

以腺相关病毒作为基因治疗载体近年来备受关注。通过提高腺相关病毒载体的产量 ,扩大其载体容量 ,提高基因的转染效率和克服体内的免疫反应等手段 ,使腺相关病毒载体的应用更加符合临床的需要。     

低氧启动腺相关病毒载体的构建及高感染滴度质粒辅助重组腺相关病毒的获取

目的构建低氧启动重组腺相关病毒载体 ,优化重组AAV的条件 ,获取高感染滴度低氧启动重组腺相关病毒 ,为基因治疗缺血性脑血管病提供高效的特异性表达目的基因的载体。方法AAVHelperfree系统购自stratagene ,HEK293细胞购自中国协和医科大学细胞中心 ,XL -10 -GoldE.coli购自stratagene ,胎牛血清 ,细胞培养基DMEM、IMDM、MEM、Hepes均购自Gibco,PIRES -EGFP购自Clontech ,pGL3、荧光素酶检测系统、T4DNA连接酶购自Promega;BamHI等内切酶购自Takala。采用PCR和同尾酶的方法合成5拷贝HRE -CMV -mp,酶切连接构建荧光素酶低氧启动腺相关病毒载体 ;扩增提取病毒载体质粒、辅助质粒和Cap、Rep蛋白质粒 ;大量培养HEK293细胞 ;质粒磷酸钙共转染 ;转染48h收获病毒(氯彷 -PEG8000) ;测定生物滴度、物理滴度、电镜观察病毒和病毒蛋白电泳。测定低氧2 %和正常氧压下荧光素酶的效价。结果获取感染滴度2×1011的低氧启动腺相关病素 ,低氧6h荧光素酶表达量是正常氧压时的59倍。结论重组AAV病毒载体是通过对AAV病毒进行改造 ,将自身的编码基因去除 ,使其能装载治疗基因及表达元件而产生的。rAAV载体具有转染效率高、重复性强 ,不激活免疫反应 ,可重复应用 ,不诱导基因突变的优势。但腺相关病毒载体长期稳定表达目的基因     

感染靶向性重组腺相关病毒载体在基因治疗中的研究进展

重组腺相关病毒(rAAV)是一种非常有希望的人体细胞基因治疗载体.它既可以转染分裂细胞又可以转染非分裂细胞.rAAV在宿主体内以定向整合的方式存在.AAV重组体在细胞内能长期稳定地表达,且在体内不引起明显的病理变化,然而它广泛的宿主范围是体内基因治疗的一个缺点,因为它不具备组织特异性或器官局限性转导能力从而难以增加其在基因治疗中的安全性和效率.因此,开发具有组织或器官靶向性的重组腺相关载体是腺相关病毒载体发展的方向.本文就近年来感染靶向性腺相关病毒在基因治疗中的进展作一综述.     

基因治疗中腺相关病毒载体的研究进展

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)作为基因治疗载体近年来备受关注,但因其特殊的生物学性状限制了AAV在基础和临床实验中的研究。通过在AAV的包装、生产和纯化中采取新的方法和解决AAV转导中的限速步骤使AAV载体的应用在基因治疗中具有更广阔的前景。     

NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因重组腺相关病毒载体的构建及鉴定

目的:设计构建融合基因NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的重组腺相关病毒表达载体。方法:应用非对称引物/模板法,PCR技术制备Ant-Shepherdin[79-87]cDNA片段,通过连接pGEM-T-Easy载体及PBV220-NT4质粒,转化感受态细胞,获得NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因,连接腺相关病毒穿梭质粒pSSHG-CMV,采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染HEK-293细胞获取重组腺相关病毒,Dot-blot法测定重组病毒滴度,MTT比色法观察重组腺相关病毒对A549细胞存活率的影响。结果:合成Ant-Shepherdin[79-87]基因,连接PBV220-NT4,经克隆、酶切,琼脂糖凝胶电泳证实获得321bp的NT4-Ant-Shepherdin[79-87]目的基因;得到高滴度的(3.4×1013pfu/L)重组腺相关病毒表达载体;带有融合基因NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的重组腺相关病毒对A549细胞具有强烈的诱导凋亡作用。结论:成功构建了NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因的重组腺相关病毒表达载体,为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础。     

腺病毒载体介导的CTLA4-Ig基因转移促进异基因小鼠皮肤移植耐受

目的　探讨CTLA4 Ig重组腺病毒 (AdCTLA4 Ig)促进“脾细胞 (spleencells ,SP) 环磷酰胺 (cyclophosphamide ,CP)”系统诱导移植耐受的作用及其机制。方法　BALB c(H 2 d)小鼠经尾静脉注射C57BL 6(H 2 b,B6)小鼠脾细胞和AdCTLA4 Ig颗粒 ,48h后腹腔注射环磷酰胺 ,并同天进行皮肤移植 ,于耐受 2 5d时对受体小鼠进行混合淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR)、迟发型超敏反应 (delayedtypehypersensitivity ,DTH)等耐受状态的检查。结果　B6小鼠的皮肤移植物在耐受的BALB c小鼠中存活期特异延长。MLR和DTH检验证明BALB c小鼠对B6小鼠的脾细胞产生特异性耐受 ,对无关第三者ICR小鼠的脾细胞仍表现出强烈免疫应答。结论　AdCTLA4 Ig颗粒可以明显促进“细胞 环磷酰胺”诱导的异基因皮肤移植耐受 ;克隆排除和克隆无能是耐受诱导的主要因素     

腺相关病毒载体pAGX(+)的构建

目的构建腺相关病毒(AAV)载体并进行鉴定,以介导真核细胞的基因传递和表达.方法以基因重组技术构建AAV载体,用Southern杂交、狭缝杂交以及激光共聚焦显微镜等鉴定构建的AAV载体.结果成功地获得了重组AAV表达载体pAGX(+),藉报告基因EYFP鉴定pAGX(+),见pAEYFP经包装的重组AAV储存液的感染滴度达1.39×107TU(transmissionunit)/ml、复制滴度达1.94×1011颗粒/ml.Southern杂交表明EYFP基因获得成功拯救.rAAV/EYFP颗粒成功转导COS7细胞,EYFP获得表达,并整合入COS7细胞基因组,而藉质粒载体pEYFPCMV介导的转移,EYFP未能整合.结论成功地构建了一个AAV载体,并成功地介导了基因的转移、表达和整合.     

反义白介素4重组腺相关病毒载体气道给药对哮喘大鼠的影响

目的 构建携带反义IL-4基因的重组腺相关病毒（rAAV）真核表达载体，并以此干预大鼠哮喘模型，探讨其作为哮喘基因治疗方案的可行性。方法 磷酸钙沉淀法将质粒pasIL4、pXX2及pXX680共转染293T细胞合成携带反义IL-4基因的重组腺相关病毒（rAAV-asILA）。Southem blot法检测合成病毒的滴度。rAAV-asILA在动物实验开始的第1天和第14天2次通过气道给药干预哮喘大鼠（T组），实验中同时设立大鼠正常组（N组）、哮喘组（A组）以及rAAV-GFP干预组（C组）。末次激发后处理大鼠，计数肺泡灌洗液（BALF）中有核细胞以及嗜酸性细胞总数，ELISA检测BALF中IL-4和IgE蛋白量，RT-PCR检测肺组织IL-4 mRNA变化，取肺组织作病理学检查。结果 分析BALF中有核细胞细胞总数和Eos总数，结果表明：T组该2项指标较A组和C组有降低趋势，但这3组间差异无统计学意义（P〉0．05）。BALF中IL-4、IgE的ELISA检测结果以及肺组织IL-4 mRNA RT-PCR半定量检测结果表明：T组的上述指标水平较A组和C组均明显降低（P〈0．01）。T组大鼠肺组织病理学改变较A组和c组轻。结论 携带反义IL-4基因的rAAV载体，对于哮喘的干预具有一定的作用。rAAV-asIL4可能具有一定临床应用前景。     

重组9型腺相关病毒载体转染小鼠心脏及对心功能的影响

目的 探讨重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated serotype 9,rAAV9)载体对小鼠心脏的转染效果及对心功能的影响.方法 16只昆明种小鼠经尾静脉将携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)报告基因的rAAV9(rAAV9-eGFP)转染入小鼠,于7、14、21、28 d留取标本,使用荧光显微镜观察eGFP在心肌、肝、肺、肾、脑、骨骼肌的荧光表达,Western blot法检测eGFP)的蛋白表达.另20只昆明种小鼠随机分为2组,每组10只,分别经尾静脉注射rAAV9-eGFP)和生理盐水,28 d后行心脏超声及血流动力学检查.结果 rAAV9-eGFP经尾静脉注射21 d时eGFP表达在心脏达到高峰,转染效率可达32%,在其他脏器表达量少或无表达.rAAV9-eGFP组较生理盐水组心功能差异无统计学意义(P＞0.05).结论 rAAV9可通过外周静脉注射在心脏较高表达,且对心功能无不良影响.     

重组人DcR3腺相关病毒的构建和表达

目的克隆人DcR3基因于腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体pAAV-IRES-hrGFP中,以获得高感染滴度及纯度的重组人DcR3腺相关病毒,为将其用于感染移植肝,研究其对大鼠移植肝的保护作用打下基础。方法用基因重组的方法构建含全长人DcR3基因的重组腺相关病毒骨架质粒,利用脂质体法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞AAV-293细胞中,合成重组DcR3腺相关病毒,经PEG/氯仿纯化,用SDS-PAGE鉴定其纯度,扫描电镜观察病毒颗粒形态,倍比稀释法测定重组病毒的感染滴度。并用重组病毒感染COS-7细胞鉴定DcR3的表达。结果正确构建组装重组人DcR3腺相关病毒,纯化后病毒感染滴度为1.1×1010U/mL。在重组DcR3腺相关病毒感染的COS-7细胞上清液中检测到了DcR3的表达。结论成功构建了重组人DcR3腺相关病毒,为下一步研究DcR3对大鼠移植肝的保护作用打下基础。     

Smad 6和Smad 7基因腺相关病毒载体的构建及其表达

目的 :构建Smad 6和Smad 7基因腺相关病毒 (AAV)载体 ,并转染到人肾小管上皮细胞中表达。方法 :利用基因重组技术 ,采用BamHI和XhoI双酶分别将pcDNA3中的目的基因Smad6 /flag和Smad 7/flag融合基因片断切出 ,再克隆到质粒pAAV MCS中 ,构建重组质粒pAA Smad 6 /flag和pAA Smad 7/flag。采用磷酸钙沉淀法 ,以重组质粒或pAAV LacZ以及pAAV RC、pHelper共转染HEK2 93细胞 ,产生均有传染性的病毒颗粒。再将此病毒颗粒转染到培养的人肾小管细胞中 ,用免疫组化法检测其Smad 6和Smad 7转移基因的表达。结果 :成功地构建Smad 6和Smad 7基因的腺相关病毒载体 ,并可在肾小管上皮细胞中表达Smad 6和Smad 7。结论 :肾小管细胞能稳定、高效表达外源Smad 6和Smad 7,为今后建立Smad 6和Smad 7AAV基因治疗体内肾纤维化的模型奠定了良好的基础     

9型重组腺相关病毒转染体外培养大鼠心肌细胞的影响

目的:研究含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的9型重组腺相关病毒(rAAV9)对大鼠心肌H9C2细胞的转染及对细胞生长的影响。方法:rAAV9-EGFP按转染复数(MOI)1×105、1×106、1×107转染H9C2细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察H9C2细胞中EGFP阳性表达情况,采用流式细胞仪检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞的转染效率。观察转染后细胞生长形态,并用AlamarBlue法检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞增殖影响。结果:转染后第1天,MOI=1×106、1×107组中EGFP开始表达;第2天,MOI=1×105组开始表达,各组EGFP表达强度随MOI值的增高而增强,同时EGFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强;转染后第4天达到高峰,此时流式细胞术检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞的转染率分别为MOI=1×105组:(14.1±0.2)%、MOI=1×106组:(35.1±4.8)%、MOI=1×107组:(56.8±0.1)%。rAAV9-EGFP转染H9C2细胞后,细胞生长及形态正常,AlamarBlue法进一步检测表明转染组对H9C2细胞增殖无影响。结论:rAAV9-EGFP能够有效地转染H9C2细胞,且rAAV9-EGFP对H9C2细胞增殖无明显抑制。