慢性砷暴露对人皮肤角质形成细胞药物转运相关蛋白mRNA表达和砷代谢的影响

目的探讨慢性砷暴露对人皮肤角质形成细胞(human keratinocytes,HaCaT)药物转运蛋白mRNA表达和砷代谢的影响。方法将HaCaT细胞随机分为慢性对照(不予以砷处理)组和慢性砷暴露(100 nmol/L亚砷酸钠染毒28周)组,培养于含10%胎牛血清和1%双抗的培养基中,收集处于对数生长期的细胞,采用实时荧光定量(real-time quantitative PCR)法检测细胞多药耐药相关蛋白mRNA的表达水平。将处于对数生长期的HaCaT对照细胞和慢性砷暴露细胞分别暴露于含终浓度为0(对照)、2.5、5、10、20、30、40、50、60、80、100、150μmol/L亚砷酸钠的培养基中孵育24 h,采用MTS法检测细胞活性。将慢性砷暴露组细胞和对照细胞予以10μmol/L亚砷酸钠处理24 h,采用氢化物发生-原子吸收分光光度法检测细胞砷蓄积和砷排放量。结果与对照细胞相比,慢性砷暴露HaCaT细胞多药耐药相关蛋白ABCC2和ABCC4 mRNA表达水平均升高,差异有统计学意义(P0.05);而ABCC1、ABCC3、ABCC5、ABCG1、ABCG2 mRNA的表达水平均无显著变化。与对照细胞相比,慢性砷暴露HaCaT经各浓度急性砷处理后细胞存活率均升高,差异有统计学意义(P0.05)。与对照细胞相比,10μmol/L亚砷酸钠染毒24 h后,慢性砷暴露细胞内的砷蓄积量降低,而砷排放量升高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论慢性砷暴露的HaCaT细胞药物转运蛋白mRNA的表达升高,砷排出能力增强,对砷毒性产生耐受性。     

三氯乙烯和四氯乙烯对体外培养人皮肤角质形成细胞脂质过氧化的影响

目的探讨有机溶剂三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)、四氯乙烯(perchloroethylene,PCE)对体外培养的皮肤角质形成细胞(keratinocyte,KC)的脂质过氧化的作用。方法利用中性红吸附(neutral red uptake,NRU)实验确定TCE和PCE对人KC的中性红半数吸收浓度(50%neutral red uptake,NR50),并根据此确定染毒浓度。分别使用2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mmol/L的TCE或0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mmol/L的PCE对体外培养的人KC染毒4 h,利用MDA、SOD和ROS试剂盒测定细胞中MDA、SOD和ROS水平。结果TCE、PCE对人KC的NR50分别为4.53 mmol/L和2.16 mmol/L。经不同浓度TCE、PCE作用4 h后,细胞内MDA水平和ROS水平随TCE或PCE浓度增加呈上升趋势,而SOD活性呈下降趋势,与溶剂对照组相比较差异有显著性,且存在浓度-反应关系。结论TCE、PCE对人KC有氧化损伤作用。     

细胞内谷胱甘肽对砷细胞毒性的保护作用

目的研究细胞内谷胱甘肽(GSH)对砷致人永生化角质形成细胞系(HaCaT)毒性的保护作用.方法HaCaT细胞用N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)和丁硫氨酸亚矾胺(L-buthionine-[S'R]-sulfoximine,BSO)预处理后,加入亚砷酸钠(sodium arsenite,NaAsO2)继续作用,用Alamarblue摄入法检测细胞活力,每组4个复孔.结果单独用NaAsO2作用细胞24h后,0.001～10.000 μmol/L组Alamarblue还原率增高(P＜0.05),大于10.000μmol/L时Alamar blue还原率下降(P＜0.01);用NAC预处理24h后再加入NaAsO2,15 μmol/L组Alamarblue还原率比NaAsO2单独作用增加(P＜0.05);用BSO预处理24 h后再加入NaAsO2,15 μmol/L组的Alamarblue还原率均下降(P＜0.05).结论低浓度NaAsO2刺激细胞增殖,高浓度具有细胞毒性;NAC可减轻砷的细胞毒性,而BSO则加重其细胞毒性.     

亚砷酸钠对人皮肤角质形成细胞内过氧化氢酶的影响

目的 探讨亚砷酸钠（NaAsO2）作用于体外培养的人皮肤角质形成细胞（HaCaT）后,细胞内过氧化氢酶（CAT）的活力、mRNA和蛋白表达的变化.方法 对生长至80%融合的HaCaT细胞株,分别加入0.0、2.5、5.0、10.0和20.0 μmol/L的NaAsO2作用24 h.用紫外速率直接法测定细胞内CAT的活力;用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测CAT的mRNA表达水平;用免疫印迹（Western blot）方法检测CAT蛋白表达水平.结果 5.0 μmol/L以上的NaAsO2可明显降低CAT的活力,且呈剂量-反应关系,差异有统计学意义（P＜0.05）;RT-PCR电泳结果可见,5.0 μmol/L以上的NaAsO2作用于细胞后CAT/β-actin吸光度比值与对照组比较明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）;Western blot检测结果与RT-PCR电泳结果一致.结论 NaAsO2可降低HaCaT内CAT基因的mRNA及蛋白表达水平并抑制细胞内CAT活力.     

三氯乙烯诱导皮肤角质形成细胞凋亡的体外研究

目的 检测三氯乙烯（TCE）对人表皮角质形成细胞（NHEK）的凋亡诱导作用,探讨TCE皮肤毒性的作用靶.方法 采用中性红吸附试验测定TCE对体外无血清培养的NHEK的中性红吸附减少50%的浓度（NR50值）,确定TCE染毒剂量;测定丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力反映细胞脂质过氧化作用和氧化状态;用透射电子显微镜（TEM）和流式细胞仪（FCM）观察细胞凋亡形态学改变和测定细胞DNA含量,计算凋亡发生率及增殖指数（PI）.结果 TCE对NHEK的NR50值为4.53（3.92～5.13）mmol/L;TCE处理NHEK 4 h后,MDA含量的增加和SOD活力的抑制均具有剂量-效应关系（r=0.98,r=0.93,P＜0.01）;TEM观察显示,与对照相比,TCE处理组细胞可见明显凋亡改变;FCM测定显示,DNA含量直方图中G1期前可见明显的凋亡峰,与对照组相比,TCE处理组细胞凋亡率明显增高（空白对照及TCE 0.125、0.500、2.000 mmol/L组分别为18.42%、31.83%、38.63%、44.35%）,而PI则明显降低（空白对照及TCE 0.125、0.500、2.000 mmoL/L组分别为4.99%、3.26%、2.48%、2.07%）.结论 在体外培养条件下,TCE可通过脂质过氧化和氧化应激作用诱导NHEK凋亡,抑制其增殖.     

YTH结构域家族蛋白2对砷诱导皮肤角质细胞恶性表型的影响

目的 探究YTH结构域家族蛋白2(YTH domain family protein 2,YTHDF2)对砷诱导皮肤角质细胞恶性表型的作用,为砷致皮肤癌的机制提供新视角。方法 以正常皮肤角质Ha Cat细胞和1μM亚砷酸钠连续染毒50代的恶性转化Ha Cat细胞（Ha Cat-T）为研究对象,采用免疫印迹实验检测YTHDF2蛋白在Ha Cat-T和Ha Cat细胞的表达水平。si RNA沉默Ha Cat-T细胞YTHDF2基因表达,CCKc-8实验、平板划痕愈合实验、Transwell实验以及流式细胞术检测YTHDF2敲低后Ha Cat-T细胞增殖、迁移、侵袭能力以及凋亡水平的变化,采用t检验分析组间差异。结果 相比于Ha Cat细胞,Ha Cat-T细胞YTHDF2蛋白表达水平增高1.37倍（t=12.238,P<0.001）。si RNA干扰有效降低了Ha Cat-T细胞中44.40%(t=6.423,P=0.003)YTHDF2蛋白表达;敲低YTHDF2后,Ha Cat-T细胞增殖能力相比于未敲低的Ha Cat-T细胞在24、48和72 h分别降低32.17%(t=7.98...     

四氯乙烯对人原代角质形成细胞的细胞毒性作用

[目的]研究体外培养条件下有机溶剂四氯乙烯(perchloroethylene,PERC)对正常人表皮角质形成细胞(normalhumanepidermiskeratinocyte,NHEK)的细胞毒性作用。[方法]用0.25%的胰蛋白酶经冷温两步消化皮肤,分离得到NHEK,进行体外无血清培养;用中性红吸附试验(NRU)测定PERC对NHEK的中性红吸附减少50%的浓度(NR50值),并据此确定PERC细胞毒性试验的染毒剂量;测定乳酸脱氢酶(LDH)活力反映其对细胞膜的损害,测定丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力反映细胞脂质过氧化作用。[结果]PERC可引起NHEK细胞活力剂量依赖性降低,PERC对NHEK的NR50值为2.16mmol/L(95%可信区间为1.27~3.07);0.05、0.10、0.20、0.40、0.80mmol/LPERC处理NHEK1、2、3、4h后,LDH的释放呈明显剂量-反应和时间-反应关系;以上浓度的PERC处理NHEK4h,可引起MDA含量增加和SOD活力抑制,且均显示剂量-反应关系,与空白对照组、溶剂对照组相比,引起差异有显著性的最低浓度分别为0.20mmol/L(MDA升高)和0.10mmol/L(SOD降低),均为P<0.05。[结论]在体外培养条件下,PERC可能通过氧化应激和脂质过氧化作用对人角质形成细胞产生细胞毒性作用。     

三氯乙烯对人原代角质形成细胞的细胞毒作用

目的研究体外培养条件下有机溶剂三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)对正常人表皮角质形成细胞(normal human epidermal keratinocyte,NHEK)的毒性作用。方法用0.25%的胰蛋白酶经冷温两步消化皮肤,分离得到NHEK,进行体外无血清培养;根据中性红吸附试验测定的NR50结果,确定TCE染毒剂量。测定乳酸脱氢酶(LDH)活力,反映其对细胞膜的损害,测定丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力,反映细胞脂质过氧化作用。结果TCE可引起NHEK细胞活力剂量依赖性降低,TCE对NHEK的NR50值为4.525 mmol/L(3.922~5.128 mmol/L);NHEK细胞用0.125,0.250,0.500,1.000,2.000 mmol/L的TCE处理1,2,3,4 h后,LDH的释放显示明显的时间-剂量-反应关系;同样剂量的TCE处理NHEK,4 h后可引起MDA含量呈浓度依赖性增加(最低浓度为0.500 mmol/L),SOD活力呈浓度依赖性抑制(最低浓度为0.250 mmol/L),与空白对照和溶剂对照组相比较,两者差异均有显著性(P<0.05)。结论在体外培养条件下,有机溶剂三氯乙烯可通过脂质过氧化和氧化应激作用对人角质形成细胞产生明显的细胞毒作用。     

毫米波对人角质形成细胞缝隙连接通讯功能的影响

目的　研究低功率毫米波对人皮肤角质形成细胞 (HaCaT)缝隙连接通讯 (GJIC)的影响。方法　采用荧光淬灭后恢复技术 ,用激光共聚焦显微镜检测频率为 30 16GHz、功率密度分别为1 0和 3 5mW/cm2 毫米波辐照对细胞缝隙连接通讯功能的影响。结果　 12 氧 14 酰佛波酯 (TPA)5 μg/L可抑制细胞GJIC功能 ,激光淬灭后平均荧光恢复率由正常对照的 (5 5± 17) %降至 (34±13) % ,差异有非常显著性。功率密度为 1 0和 3 5mW /cm2 毫米波单独辐照不改变细胞GJIC功能 ,其平均荧光恢复率分别为 (5 2± 16 ) %和 (5 0± 17) % ;当毫米波与TPA联合作用时 ,TPA诱导的细胞GJIC功能抑制被削弱 ,其中 1 0mW /cm2 毫米波使TPA诱导的细胞GJIC功能抑制部分恢复 ,其平均荧光恢复率为 (47± 16 ) % ,差异有非常显著性 ;而 3 5mW /cm2 毫米波使细胞GJIC功能完全恢复至正常对照水平 ,其平均荧光恢复率为 (5 0± 16 ) % ,差异有非常显著性。结论　毫米波辐照可消除或减小TPA诱导的细胞GJIC功能抑制。     

三种氯代烯烃对人角质形成细胞的细胞毒性作用

目的　探讨三氯乙烯(trichloroethylene ,TCE )、四氯乙烯(perchloroethylene ,PCE )和二氯乙烯(dichloroethylene ,DCE)对人角质形成细胞(keratinocyte ,KC)的细胞毒性作用以及其时间 剂量 效应关系。方法　利用中性红吸收(neutralreduptake ,NRU)试验测定TCE、PCE和DCE对人KC的中性红半数吸收浓度(5 0 %neutralreduptake ,NR50 ) ,用乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase ,LDH)释放试验研究三者对人KC细胞毒作用,并探讨其时间 剂量 效应关系。结果　TCE、PCE和DCE对人KC的NR50 分别4 .5 3mmol/L、2 . 16mmol/L和5 . 5 7mmol/L ,LDH释放试验表明三者对人角质形成细胞具有明显的细胞毒作用,且具有时间 剂量 效应关系。结论　TCE、PCE和DCE都对人KC具有细胞毒性,且PCE >TCE >DCE。这可能与三者对人KC的细胞膜损伤有关。     

口服硫辛酸对AMD患者血脂及抗氧化能力影响

目的 探讨硫辛酸对老年黄斑变性(AMD)患者血脂及抗氧化能力的影响,为预防和治疗AMD的发生和发展提供新方法。方法 对33名AMD患者进行为期3个月的硫辛酸干预研究,剂量为600mg,每天早晚口服,每次300mg。于干预前后分别测量眼视力,检测血清胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HLD)、低密度脂蛋白(LDL)、血清丙二醛(MDA)含量及过氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 硫辛酸干预后有43%的AMD患者患眼视力有所改善;干预前后血清CHO、TG、HLD、LDL含量差异无统计学意义(P>0.05);与干预前比较,干预后AMD患者血清MDA含量平均降低5.4%(P>0.05),SOD活性平均升高10.9%(P<0.05),并且干预后AMD患者血清SOD活性均明显升高。结论 硫辛酸能提高AMD患者机体SOD活性,对预防AMD的病情进展有一定作用。     

亚砷酸钠对HaCaT细胞的氧化应激作用

目的研究不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)对人皮肤永生化角质形成细胞株(HaCaT)的氧化应激作用。方法用AlamarBlue还原法检测NaAsO2对细胞活力的影响,用PI染色法检测细胞的凋亡和坏死率,利用2′7′二乙酰二氯荧光素(DCFHDA)检测细胞内ROS水平,同时用荧光法测定细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量。结果0001μmolL至1μmolL组的AlamarBlue还原率显著高于对照组,而10μmolL以上组的AlamarBlue还原率下降,20μmolL组的凋亡和坏死率显著高于对照组,各实验组的DCF荧光强度与对照组相比明显提高,1μmolL以上组细胞内GSH水平增高,5μmolL组GSSG水平增高。结论各浓度砷引起HaCaT细胞内ROS增多,低浓度时促进细胞增殖,高浓度则抑制细胞活力,砷诱导HaCaT细胞内的GSH增多,发挥解毒作用。     

谷胱甘肽与蛋氨酸对饮水砷暴露小鼠体内砷化物的分布和甲基代谢的影响

目的探讨外源性谷胱甘肽(glutathione,GSH)和L-蛋氨酸(L-Methionine,L-Met)干预后,对饮水砷暴露小鼠肝、肾和血中化物的分布和甲基代谢的影响。方法将实验小鼠随机分为对照组(Con组)、单纯染砷组(As组)、GSH干预组(GSH组)与L-Met干预组(L-Met组)。小鼠自由饮用含砷50mg/L的水。从第4周起,染砷组同时腹腔注射GSH和L-Met进行处理,共处理7天。末次注射后24h处死小鼠,取其肝、肾和血组织样品。采用氢化物发生-超低温捕集-原子吸收分光光度法分别检测小鼠肝、肾和血中无机砷(inorganic arsenic,iAs)、一甲基胂(monomethylarsenic acid,MMA)和二甲基胂(dimethylarsenic acid,DMA)含量。结果L-Met组小鼠肝中DMA含量和砷二甲基化率(SMI)显著高于As组;GSH干预组小鼠肝中砷一甲基化率(PMI)和SMI显著高于As组。L-Met组和GSH组小鼠血中DMA、总砷含量和PMI均显著高于As组。结论GSH和L-Met对小鼠体内的砷甲基化代谢具有促进作用、可加速无机砷在体内的甲基化过程,最终使砷甲基代谢的终产物DMA含量增加,从而促进了总砷的代谢与排泄。     

构树叶总黄酮对人永生化表皮细胞的防护效果

目的 探讨构树叶总黄酮(total flzvonoids of Brottssonetia papyrifera，TFBP)对铅、砷引起的人永生化表皮细胞活性损伤和氧化损伤的防护效果。方法 采集构树叶并利用聚酰胺柱洗脱法提取构树叶总黄酮。用不同剂量的铅和砷处理细胞，加入不同浓度的构树叶总黄酮，采用噻唑蓝(MTT)染色法检测细胞活性变化，采用丙二醛(MDA)试剂盒测MDA的变化。结果 0．1～1．0mmol／L的醋酸铅对细胞的活性有抑制作用。低浓度亚砷酸钠(0．5～1．0μmol／L)对人永生化表皮细胞有增值作用。高于5．0μmol／L的亚砷酸钠对表皮细胞生长有抑制作用。添加大于100mg／LTFBP后与对照组比较，MTT值明显升高，MDA的含量明显降低，有显著性差异。结论 醋酸铅和亚砷酸钠对人永生化表皮细胞有活性损伤和氧化损伤，构树叶总黄酮TFBP能降低这种氧化损伤，对细胞有防护功能。     

砷对HaCaT毒作用及N-乙酰半胱氨酸拮抗作用

目的　研究亚砷酸钠(sodiumarsenite ,NaAsO2 )对人皮肤角质形成细胞系(HaCaT)的毒性作用及N 乙酰半胱氨酸(N acetylcysteine ,NAC)对砷毒性的拮抗作用。方法　NaAsO2 单独作用于HaCaT细胞2 4h或用NAC预处理后,加入NaAsO2 继续作用2 4h ,用AlamarBlue还原法检测细胞活力。结果　<1μmol/L的NaAsO2 单独作用于细胞2 4h后,AlamarBlue还原率增高(P <0 . 0 5 ) ,10 μmol/L以上的NaAsO2 则使AlamarBlue还原率显著下降(P <0 . 0 1) ;用NAC预处理2 4h后再加入NaAsO2 ,2 0 μmol/L组AlamarBlue还原率与NaAsO2 单独作用相比显著增加(P<0 .0 5 )。结论　低浓度NaAsO2 刺激细胞增殖,高浓度具有细胞毒性;NAC可减轻砷的细胞毒性,细胞内的还原型谷胱甘肽(GSH)对砷的细胞毒性起保护作用。     

tBHQ对无机砷致人皮肤角质细胞损伤保护作用

目的 探讨叔丁基对苯二酚(tBHQ)对亚砷酸钠(NaAsO₂)致人皮肤角质细胞系HaCaT细胞损伤的保护作用.方法 用Alamar Blue还原法检测细胞活力,用荧光探针2',7'-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)的生成,用硫代巴比妥酸(TBA)法检测细胞内过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)的生成.结果 NaAsO₂(25、50μmol/L)单独处理后,各组细胞活力明显下降(P<0.01),分别为82%和59%;细胞经tBHQ(25、50μmol/L)预处理后,tBHQ 25μmol/L组细胞活力分别恢复至(101.44±1.63)%和(92.06±9.95)%,tBHQ 50μmol/L组细胞活力分别恢复至(98.88±2.03)%和(91.12±7.87)%;NaAsO₂(25、50μmol/L)单独处理后,各组细胞内ROS水平明显上升(P<0.01),分别为对照组的1.64和3.86倍;细胞经tBHQ(25、50μmol/L)预处理后,tBHQ 25μmol/L组ROS水平分别下降为对照组的0.95和1.87倍,tBHQ 50μmol/L组ROS水平分别下降为对照组的0.79和1.69倍;NaAsO₂(25、50μmol/L)单独处理后,细胞内MDA含量明显上升(P<0.01),分别为2.28、2.96 nmol/(mgμprot);细胞经tBHQ(25、50μmol/L)预处理后,tBHQ 25μmol/L组MDA含量分别下降为2.05、2.43 nmol/(mgμprot),tBHQ 50μmol/L组MDA含量分别下降为2.10、2.60 nmol/(mg.prot).结论 tBHQ对无机砷致人皮肤角质细胞损伤具有保护作用,且具有一定的剂量-反应关系.     

砷对原代培养海马细胞形态学影响及酶活力研究

研究不同剂量亚砷酸钠对海马细胞活力、形态学改变以及生化指标的影响。采用 0、0 0 8、0 40、2 0 0和 1 0 0 0mg L亚砷酸钠处理海马细胞 6h和 2 4h后 ,观察到海马神经元活力降低 ;细胞浆、核界限不清 ,细胞浆空泡变性 ,细胞突起变细、减少以至消失 ,神经细胞之间网络疏松 ;核染色质凝集、浓缩 ,核边移 ;胞浆内尼氏体减少 ;且呈剂量和时间依赖关系 ;培养上清中乳酸脱氢酶活性增高 ,胆碱酯酶活性降低。实验结果表明不同剂量亚砷酸钠对大鼠海马细胞产生不同程度的毒性作用 ,包括变性、凋亡和坏死。     

亚砷酸钠对淋巴细胞毒性及抗氧化物拮抗作用

目的研究不同浓度的亚砷酸钠对体外培养的大鼠淋巴细胞活力的影响及亚硒酸钠和抗坏血酸的拮抗作用。方法体外分离大鼠外周血淋巴细胞后，施加处理因素，在37℃条件下恒温培养，用水溶性染料(AlamarBlue)摄入法定量检测淋巴细胞活力。结果亚砷酸钠浓度大于5μmol／L时，AlamarBlue的还原率显著低于对照组，且呈剂量反应关系；用5μmol／L的亚硒酸钠预处理细胞24h后，10μmol／L亚砷酸钠组AlamarBlue的还原率显著增高，接近空白对照组还原率；而用50μmol／L的抗坏血酸预处理后，还原率有所增高，但未达到对照组水平。结论亚砷酸钠可抑制淋巴细胞活力，抗氧化物可一定程度的拮抗三价砷的细胞毒性作用。