一种高通量筛选结直肠癌转移相关cDNA文库的方法

我们已利用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)，构建了结直肠癌转移相关cDNA消减文库，为进一步开展结直肠癌转移相关研究提供了大量的信息。如何高效、便捷、高通量地差异筛选该文库，成为目前急需解决的问题。以往多用Northern blot和反向Northern印迹进行差异片段的检测，但筛查量有限。     

cDNA文库的建立、筛选及其应用(技术与方法)

cDNA文库是将细胞中所有的mRNA逆转录成与之互补的cDNA(compkme-mtary DNA),进而合成双链cDNA,再克隆到载体上,引入适当的宿主细胞内繁殖而得。尽管与基因文库相比,建立cDNA文库要经过繁琐的步骤,但它有着库小、易筛选且更能直接反映细胞特征的优点,因此,cDNA文库得到了广泛的应用,同时,应用范围的增加又促进了方法学的发展。本文力图对cDNA文库的建立和筛选方法以及文库的应用作一简单归纳。     

一种可用于多DNA片段连接的新SOE-PCR方法

目的通过对重叠延伸PCR技术的改进,建立一种可用于多DNA片段连接的SOE-PCR方法。方法扩增获得相互重叠的1.8、1.1、1.3kb的短片段,以之作为亚片段模板。在SOE-PCR反应体系中加入不同数量用于重叠的亚片段模板及延伸所得目的长片段扩增所需的外引物,同时加入了稀释100倍的内引物,使得亚片段模板在扩增过程中能动态达到最佳重叠延伸浓度。结果获得了特异性强、丰度高的两段连接产物,与原有的SOE-PCR方法相比,大大减小了反应的非特异性条带扩增,产物丰度也优于传统的扩增方法。采用同样方法尝试了单管反应对三个片段进行连接,获得了总长度为4.2kb的长片段,且实验重复性、特异性好。结论本研究以相互重叠的多个短片段为模板,实现多片段的连接和扩增,可降低受模板浓度条件的影响的实验操作难度。多片段连接时减少了操作步骤和突变几率,可广泛用于多DNA片段连接操作。     

一种利用抗原结合微粒筛选杂交瘤培养上清液的新奇方法

已建立一种简易而快速的筛选技术用于检出产生特异性抗体杂交瘤。将抗原与一种用于凝集分析的高折射率的微粒,以共价键相结合,Ag结合微粒只需制备一次便可用于整个筛选过程,悬浮于含表面活化剂和聚乙二醇的磷酸盐缓冲液中保存。含有针对某种抗原(或半     

表达基因鉴定的一种新策略:筛选poly(dA/dT)-cDNAs

低丰度表达基因及组织细胞等特异基因的鉴定是人类表达基因签定的瓶颈,Wang等认为cDNA中的长序列poly(dA/dT)是限制低丰度表达基因等鉴定效率的主要原因.为此提出了一种新策略,即用3'端锚定oligo (dT)11代替常规oligo(dT)引物逆转录合成cDNA,并将3'端携带11个(dA/dT)s序列的cDNA称之为poly(dA/dT)-cDNA.筛选poly(dA/dT)-cDNAs差减文库可以提高这些基因的鉴定效率.     

通过标准的染色技术、新的光密度法和体细胞杂交法证明:6p等臂染色体是视网膜母细胞瘤特有的一种染色体畸变

由显性遗传引起生殖细胞突变的人类肿瘤—视网膜母细胞瘤(RB),通过家系研究表明在染色体13q14部位与酯酶D连锁。1971年Knudson认为一个RB的形成除了配子细胞突变外,至少需要一次体细胞突变。1978年Yunis提出患先天性13q14缺失的病人是由于该区基因功能缺陷而诱发RB。多数RB病人有正常结构的核型。但对所有RB的研究表明,存在一个或多个染色体重排。有些RB的13q14染色体缺失,但对其发生率报道不一。     

一种利用HCIC快速纯化抗rhTF_(243)单克隆抗体方法的研究

目的:建立从小鼠腹水中快速纯化抗人重组组织因子243(recombine human tissue factor243,rhTF243)单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的方法。方法:含抗rhTF243单克隆抗体的腹水经离心、过滤及缓冲溶液变换等预处理后,先经疏水电荷诱导层析纯化处理,去除大部分杂蛋白,再经Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析柱进一步纯化。结果:经两步纯化后获得抗rhTF243单克隆抗体,其生物学活性高、纯度大于95%,抗体效价保持良好,抗体总回收率达73%,且具有明显的抗促凝作用。结论:建立的单克隆抗体纯化方法简便、高效,所得mAb的纯度高、生物学活性好。     

一种显示铺片内肥大细胞颗粒的新方法——T(甲苯胺蓝)A(苯胺油)E(酒精)法

一、概述肥大细胞的颗粒有三个主要特点:①易为碱性染料着色,②具有异染性,⑨易溶于水。肥大细胞的染色法可分为两大类,一类为非异染性染色法(nonmetachromatic staining),所用染料主要有吖啶红、菊橙、俾斯麦棕、中性红、碱性复红等。另一类为异染性染色法(metachromatic staining),所用染料具有异染性,常用于染肥大细胞的确硫堇、美蓝、甲苯胺蓝,沙黄O或T。另外还有结晶紫、天青石蓝、焦性没食子蓝、焦油紫等。     

一种利用CT片族确定股骨头空间几何中心位置的方法

本文基于股骨头与髋臼配合作用面为半球面的前提，提出一种根据股骨头横截面ＣＴ片轮廓确定股骨头几何中心的轴向位置，进而确定股骨头空间几何中心坐标及股骨头直径的方法。     

原发性大肠癌染色体分析:一种新改良的获取中期细胞的方法

染色体显带技术的问世,使恶性肿瘤染色体异常的研究更臻完善。近年来这种技术也已引进于急性白血病、骨髓增殖异常以及癌性渗出物的研究。然而对于实体肿瘤的研究,这种技术会遇到获得可供分析的中期细胞的困难。因此,要想把这种染色体分析技术应用于实体瘤必须先要有获取分裂中期细胞的好方法。本研究报导一种新的获取实体瘤分裂中期的改良方法,并报导原发性大肠癌染色体分析的结果。于外科手术切除后立即取得结肠癌标本,再把L-去甲肾上腺素和柠檬酸钠和标准的染色体培养技术结合起来,目的是为了得到更多的中期分裂相以及使得细胞更易铺开。于17例肿瘤中,有12例(75％)     

UT—PCR——一种扩增未知序列微量DNA片段的方法

ＵＴ－ＰＣＲ——一种扩增未知序列微量ＤＮＡ片段的方法夏庆杰张思仲肖翠英武辉在致病基因的突变分析、分离克隆等医学分子生物学研究中，常常遇到这样的问题：虽然已经获得感兴趣的某ＤＮＡ片段，但由于量太微而难以继续进行克隆、测序、探针制备等操作。我们介绍一种能...     

免疫蚀斑法:一种挑选重组病毒的简便方法

在以痘苗病毒为表达载体的基因过程中,为挑选出重组病毒,通常是采用将目的基因与β-半乳糖苷酶等标志基因共表达的方式,通过后者的颜色反应来挑选重组体。然而在研制痘苗载体人用活疫苗时却不允许采用上述方法,因为附加的原核基因和操作中用到致畸剂均不符合人用疫苗规程的要求。     

细胞胀亡(oncosis):一种不同于凋亡(apoptosis)的细胞死亡

凋亡是一种主动方式的程序性细胞死亡 ,它的形态特征为细胞固缩、核碎裂。近来 Majno提出一种表现为细胞肿胀和核溶解的细胞损伤过程 ,称之为胀亡 (oncosis)。目前 ,毒理病理学家认为凋亡和胀亡代表了两种不同的细胞死亡方式。本文对细胞胀亡的病理形态特征、生化改变和发生机制、分子调控的初步研究进展及其与凋亡的联系进行综述 ,以利于加深对细胞死亡方式的进一步认识     

酵母双杂交体系(Yeast Two-Hybrid System):一种研究蛋白一蛋白相互作用的强有力方法

双杂交体系是研究蛋白一蛋白相互作用的一种有效方法。将相互作用的两个蛋白分别与转录因子的DNA结合结构域和转录激活结构域融合成两个杂交体，在酵母细胞内，通过报告基因的表达情况反映两蛋白之间的相互作用。其主要特点是操作简单，可以研究蛋白间弱相互作用，通过筛库可直接得到与目的蛋白相互作用蛋白的DNA序列。用双杂交体系筛库时最值得注意的是假阳性问题。     

每搏心输出量(SV)的一种计算方法

近几年来用无创伤的方法检测心功能得到广泛的应用,从主动脉压力计算每搏心输出量的公式非常之多,但往往由于测试方法上的缺陷以及环境条件的局限,而使测试和计算结果不令人满意之事时有发生、作者与我校心血管研究室有关同志一道,试图从RM—6000多道生理记录仪描绘的颈动脉搏动图及其微分图、肱动脉搏动图,应用波动     

一种新的切取尸检颞骨的方法(摘要)

一种新的切取尸检颞骨的方法（摘要）徐伟恒刘兆华陈继川（第三军医大学大坪医院野战外科研究所耳鼻咽喉科，重庆６３００４２）本文介绍了一种经颅内、外联合径路切取尸检颞骨技术的方法和步骤。从器械准备、开颅取脑至颞骨的最后取出均作了详细叙述。提到必须注意的几点...     

TRI_(ZOL):一种适于一步分离RNA的新试剂

能否在基础和临床研究的很多领域取得进展取决于能否获得高质量的RNA。在众多分离RNA的方法中,一种建立在异硫氰酸胍/苯酚/氯仿抽提基础之上的一步RNA分离法已被广泛接受,主要由于这种方法在保证质量的同时可大幅度地减少分离RNA所需时间。TRI_(ZOL)是RNA一步分离法改进后的方法。 TRI_(ZOL)试剂是一种由苯酚和异硫氰酸胍组成的单相溶液。在样品均浆或裂解过程中,TRI_(ZOL)试剂能保证在破坏细胞和溶解细胞成份时RNA仍保持其完整性。加入氯仿,然后离     

酵母三杂交系统:一种在真核细胞水平研究RNA-蛋白质相互作用的有效方法

RNA-蛋白质之间的相互作用是真核细胞RNA在细胞内执行其功能的基础,这种相互作用在基因表达的多个水平上均发挥着重要的调控作用。要研究RNA对基因表达的调控就必须对RNA-蛋白质之间相互作用的方式进行研究。本文介绍的酵母三杂交系统(yeast three-hybrid system)是一种近年来在酵母双杂交系统的基础上发展而来的,可用于鉴定先前未知的,在自然界中存在且具有生物学意义的RNA-蛋白质相互作用的实验方法。该方法提供了一个在真核细胞内研究RNA-蛋白质相互作用的技术平台。它可以根据酵母细胞所表现出的简单表型及易于辨别的酶反应,对体内复杂环境中发生的RNA-蛋白质的相互作用进行遗传学分析。